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EXTRACCIÓN POR ELECTROFORESIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS ADN Y ARN DE CEPAS DE Trichoderma sp.

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El diagnóstico molecular está basado en el análisis de los ácidos nucleicos ADN y ARN. El análisis de ADN permite obtener información de la estructura de un gen, mientras que el análisis del ARN aporta la información funcional sobre la expresión de una proteína. En la presente actividad de laboratorio se realizó la extracción de ADN de cepas de Trichoderma longibrachiarum (LIG052), Trichoderma atroviride (LIG042), Botrytis sp. (LIG035) y Stromatinia cepivorum (LIG020), y para ARN se empleó una cepa de Trichoderma harzianum (LIG064). La extracción de ADN se practicó utilizando el protocolo modificado para extracción de ADN de Crinipellis, y para ARN el protocolo de extracción de ARN de fruto de fresa, ambos propuestos por el Laboratorio de Investigaciones Genéticas UNET. Se verifico la calidad de las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa 1%, observándose un recorrido difuso de las bandas electroforéticas debido a fallas reveladas durante el proceso.

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EXTRACCIÓN POR ELECTROFORESIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS ADN Y ARN DE CEPAS DE Trichoderma sp.

  1. 1. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DEL TÁCHIRA VICERRECTORADO ACADÉMICO - DECANATO DE POSTGRADO MAESTRÍA EN AGRONOMÍA PRODUCCIÓN VEGETAL Técnicas Avanzadas de Laboratorio 2016-B EXTRACCIÓN POR ELECTROFORESIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS ADN Y ARN DE CEPAS DE Trichoderma sp. Vázquez Chacón Jose Yvanosky. Laboratorio de Investigaciones Genéticas. UNET. RESUMEN El diagnóstico molecular está basado en el análisis de los ácidos nucleicos ADN y ARN. El análisis de ADN permite obtener información de la estructura de un gen, mientras que el análisis del ARN aporta la información funcional sobre la expresión de una proteína. En la presente actividad de laboratorio se realizó la extracción de ADN de cepas de Trichoderma longibrachiarum (LIG052), Trichoderma atroviride (LIG042), Botrytis sp. (LIG035) y Stromatinia cepivorum (LIG020), y para ARN se empleó una cepa de Trichoderma harzianum (LIG064). La extracción de ADN se practicó utilizando el protocolo modificado para extracción de ADN de Crinipellis, y para ARN el protocolo de extracción de ARN de fruto de fresa, ambos propuestos por el Laboratorio de Investigaciones Genéticas UNET. Se verifico la calidad de las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa 1%, observándose un recorrido difuso de las bandas electroforéticas debido a fallas reveladas durante el proceso. Palabras clave: ADN, ARN, electroforesis, Trichoderma spp., peso molecular. INTRODUCCIÓN Los ácidos nucleicos constituyen compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se pueden encontrar en las células asociados a proteínas formando complejos llamados núcleo-proteínas. Se conocen dos grupos de ácidos nucleicos, ARN (ácido ribonucleico) y el ADN (ácido desoxirribonucleico). La función biológica de los ácidos nucleicos es fundamental, el ADN está asociado con el material genético de las células, pudiendo encontrarse como una sola cadena en algunos microorganismos o formando parte de núcleo-proteínas de los cromosomas en organismos superiores, almacenando información genética y como molde para la síntesis de proteínas, se localiza principalmente en el núcleo y en muy poca cantidad en mitocondria y
  2. 2. cloroplastos. El ARN participa en la síntesis de proteínas y se distribuye en toda la célula, mayormente en citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas (Voet & Voet, 2006). Los últimos avances en filogenia, clasificación e identificación de hongos, así como las técnicas de detección y cuantificación de hongos (antagonistas y fitopatógenos) están basadas en técnicas que incluyen la extracción de ácidos nucleicos (ADN y ARN) y el uso de la electroforesis en gel de agarosa. Estos métodos de extracción se basan en la homogenización de la muestra, y rotura de las parees celulares del hongo mediante agentes químicos como enzimas o detergentes, y mecánicos, como perlas de vidrio y agitación; una vez rotas las celulas y liberados los ácidos nucleicos, se purifican con productos químicos como el fenol y el cloroformo, y se precipitan con alcoholes como el isopropanol (López, 2011). La electroforesis en gel de agarosa es una técnica que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas, constituye un método normalizado que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN y ARN (Somma & Querci, 2007). Microorganismos antagonistas, como el Trichoderma spp., también denominados agentes de control biológico (ACBs), suelen encontrarse de forma natural en el suelo, y conllevan efectos beneficiosos para los cultivos (Suarez-Estrella et al., 2007). Los aislados de Trichoderma se encuentran entre los agentes de control biológico más utilizados en agricultura, ya que actúan eficazmente contra numerosos hongos fitopatógenos presentes en el suelo (Chet, 1987). Se caracteriza por presentar rápido crecimiento, posee una gran capacidad de esporulación y de adaptación a un amplio rango de suelos agrícolas, sin embargo, a pesar de su sensibilidad a diferentes condiciones abióticas medioambientales como temperatura, humedad y nutrientes, su gran adaptabilidad les permite sobrevivir en gran número de hábitats (Hjeljord & Tronsmo, 1998). Estos microrganismos interaccionan con los patógenos de plantas compitiendo por los nutrientes, generando metabolitos secundarios con efecto antibiótico o parasitando directamente a los organismos fitopatógenos. Además, mejoran el crecimiento de las plantas y generan resistencia inducida en frecuentes situaciones de estrés (Alabouvette et al., 2006). El seguimiento y monitorización de los ACBs aplicados en agricultura, incluido el Trichoderma spp., requiere de herramientas que nos permita conocer, detectar y cuantificar la calidad de un determinado microorganismo presentes en una muestra (López, 2011). Al respecto, el objetivo de la presente actividad de laboratorio consistió en la extracción de ADN y ARN de aislado de cepa de Trichoderma spp. perteneciente al cepario del Laboratorio de Investigaciones Genéticas de la UNET.
  3. 3. MATERIALES Y MÉTODOS Extracción de ADN Se siguió el protocolo modificado para la extracción de ADN de Crinepellia, sugerido por el Laboratorio de Investigaciones Genéticas de la UNET. Se tomó una porción de micelio del hongo y se maceró con 800 µl de buffer de extracción (lisis celular) (0,4 M NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0) (Fig. Nº 1). Una vez macerada la muestra, se coloca en un tubo eppendorf, agitando con vórtez por 10-15 s. Se agregan 40 µl de SDS 20% (sulfato dodecil de sodio), para cambiar la permeabilidad de las membranas y romperlas, y 8 µl de Proteinasa K 20 mg/ml, para facilitar la desnaturalización de las proteínas. Se procede a incubar las muestras de 55-65 ºC por una hora, y se deja enfriar antes de centrifugar durante 10 min a 9000 rpm, procediendo a transferir el sobrenadante (750 µl) a un nuevo tubo eppendorf. La extracción se realizó mediante la adición de 500 µl fenol cloroformo isoamilalcohol (25:24:1), eliminando desechos de las proteínas. Se procede a incubar durante 30 min a 4 ºC, centrifugando posteriormente a 10000 rpm por 5-10 min. Se recuperó el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf, descantando el cloroformo isoamilalcohol remanente. La precipitación del ADN consistió en agregar 0,1 vol de acetato de socio 3 M (pH 7) y 0,94 vol de isopropanol frio, agitando varias veces los tubos, incubando bajo refrigeración toda la noche. Posteriormente, las muestras son centrifugadas por 10 min a 9000 rpm, procediendo a eliminar el sobrenadante, lavar con 100 µl de etanol (80%) frio y centrifugar de nuevo. El precipitado se resuspendió en 50 µl de Buffer Tris-EDTA (TE: Tris HCl 20 mM, pH 8, EDTA 1 mM, pH 8). La calidad y cantidad se determinó por comparaciones con concentraciones conocidas por electroforesis en geles de agarosa al 1% con bromuro de etidio, usando 2 µl de marcador PST-L. Fig. Nº 1. Maceración del micelio de Trichoderma spp. con buffer de extracción. Extracción de ARN Para la extracción de ARN, se aplicó el protocolo modificado de fresas planteado en el Laboratorio de Investigaciones Genéticas de la UNET. La homogenización de la muestra de Trichoderma sp., consistió en mezclar 2 g de la muestra con N2 líquido, pasar la muestra a 10 ml de buffer de extracción (7 ml H2O DEPC, 1 ml Tris ClH 1M pH 7,4,
  4. 4. 1 ml EDTA 0,5M pH 8, 1 ml NaCl 5M), mantenido sobre hielo hasta su completa descongelación. Se le añadió 140 µL de β- mercaptoetanol, se aplicó vortex, se añadió 1 ml SDS 20% y se agitó de nuevo en vortex. La eliminación de proteínas de la muestra consistió en incubar por 15 min a 65 ºC, añadiendo posteriormente 3,3 ml AcK 5M, se agitó en vortex, enfriado continuo a -20 ºC por 10 min y se centrifugó a 15.000 rpm por 30 min a 4 ºC, procediendo a recuperar el sobrenadante. Para la recuperación de carbohidratos y ácidos nucleicos, se añadieron al sobrenadante recuperado 7 ml de isopropanol y se agitó en vortex, procediendo e enfriar la muestra a -20 ºC por una hora, se procedió a centrifugar por 30 min a 15.000 repm y 4 ºC, descartando el sobrenadante y dejando secar el pellet por 10 min invirtiendo el tubo. Se le adicionó 700 µL de buffer TE (Tris- EDTA) para resuspender el pellet, manteniendo sobre cama de hielo por 3-5 min. Se efectuó centrifugación por 2 min con el objeto de recuperar el sobrenadante, añadiendo 75 µL de AcNa 3M, pH 5,2 y 500 µl isopropanol, incubando a -20 ºC. A la postre, se procedió a centrifugar por 15 min (rt), descartando el sobrenadante. Se lavó el pellet dos veces con EtOH 70%, secando los pellets a 37 ºC, resuspendiendo en 2 ml de H2O utilizando una aguja, procediendo a cargar en gel 10 µl. Para precipitar los carbohidratos, se le añadió a 2 ml de la muestra, 11,8 ml de H2O DEPC, 1,2 ml AcNa pH 4,5 y 6 ml 2- BE, se procedió a incubar la muestra a 4 ºC durante 30 min, y se centrifugó a 16000 rpm durante 20 min a 4 ºC, finalmente se recuperó el sobrenadante. Para la precipitación de ácidos nucleicos, se le añadió a la muestra 9 ml 2-BE, se procedió a incubar a 4 ºC por 30 min, se centrifugó por 16000 rpm durante 20 min a 4 ºC, descartando el sobrenadante. El pellet se lavó con EtOH 70% y EtOH 100%, se secó en estufa a 37 ºC y finalmente se procedió a resuspender en 1 ml de H2O DEPC. Para precipitar el ARN, se procedió a añadir 340 µL ClLi 12 M y se incubó a 4 ºC toda la noche. Posteriormente, se centrifugó a 15000 rpm durante 45 min a 4 ºC y se lavó el pellet con EtOH 70% y 100%, luego se dejó secar a 37 ºC, procediendo a resuspender el pellet seco en 50 µl de H2O DEPC. Se cuantificó incluyendo la relación de carbohidratos y proteínas. Preparación del Gel de Agarosa 1% La electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa constituye una herramienta imprescindible de la biología molecular para caracterizar, identificar y aislar ADN y ARN. La electroforesis en gel de agarosa es empleada para visualizar la integridad de ADN genómico y para evaluar la presencia e integridad de las diferentes especies de ARN. Debido a que el gel de agarosa no es desnaturalizante los fragmentos de menor tamaño se mueven con mayor facilidad a través de los poros de la matriz de agarosa mientras que los fragmentos grandes se enfrentan a mayor resistencia y por ende migran lentamente. Los geles de agarosa concentrados (1-3%)
  5. 5. oponen mayor resistencia al tránsito de los ácidos nucleicos y por ende permiten lograr mayor resolución. La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN o ARN por electroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis (Posso & Ghneim, 2008). El procedimiento para preparar el gel de agarosa 1% (p /v) en TBE 1 x estéril, consistió en sellar los bordes de un molde de plástico limpio y seco con cinta adhesiva (tirro). Se procedió a colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos completos al añadir la solución de agarosa. Se preparó y diluyó la cantidad adecuada de la solución buffer TBE 1 x estéril para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel. Se procedió a pesar la agarosa en polvo según los cálculos para el 1% y se añadió en un matraz de Erlenmeyer (normalmente 150 ml de solución de gel para un molde de 15 x 15 cm y 100 ml de gel para un molde de 15 x 10 cm), sobre el tampón TBE 1x. Se procedió a calentar hasta disolver completamente la agarosa. Se dejó enfriar la mezcla a 50-60 ºC, y se le añadió el bromuro de etidio hasta lograr una concentración final de 0,2 µg/ml. La solución se vació en el molde y se dejó formar el gel. Una vez formado el gel, se retiró cuidadosamente el peine y el tirro para colocar el gel en la cubeta de electroforesis. Se añadió el buffer TBE 1x a la unidad de electroforesis de modo que el gel quede cubierto por una capa de aproximadamente 2-5 mm (Somma & Querci, 2007). Proceso de Electroforesis Para la verificación de la calidad y pureza de las extracciones de ADN y ARN, se colocaron 2,5 µl de ADN / ARN, 3 µl buffer de carga, 4,5 µl H2O, en cada pozo de carga, siguiendo la secuencia, para ARN (1), (2), (3) y (4) Trichoderma harzianum LIG064, (5) Master  DNA/Hind III, y para ADN (6) Trichoderma longibrachiarum (LIG052), (7) Trichoderma atroviride (LIG042), (8) Botrytis sp. (LIG035) y (9) Stromatinia cepivorum (LIG020). Se procedió a colocar el soporte del gel en la cubeta de electroforesis, añadiendo el buffer de electroforesis TBE 1x, de forma que cubra bien el gel de agarosa, tapando la cubeta de electroforesis y conectando los electrodos a la fuente de alimentación. Se programó la fuente a unos 80 – 100 voltios y se inició la electroforesis por aproximadamente 45 – 60 min. Una vez acabado el proceso de electroforesis, se visualizaron los fragmentos de AND y ARN mediante luz UV y se realizó una fotografía de la imagen. RESULTADOS Y DISCUSIONES El proceso de electroforesis a través de geles de agarosa permite separar las moléculas de ADN y ARN de acuerdo a su peso molecular. Los resultados expuestos en el presente informe corresponden al
  6. 6. pool de muestras evaluadas por los grupos Nº 1 (02/01/2016) y Nº 2 (27/02/2016), de la asignatura Técnicas Avanzadas de Laboratorio, correspondiente a la Maestría en Agronomía UNET. Los resultados en ambos grupos corresponden a la secuencia (1), (2), (3) y (4) Trichoderma harzianum LIG064 para ARN, (5) Master  DNA/Hind III, y (6) Trichoderma longibrachiarum (LIG052), (7) Trichoderma atroviride (LIG042), (8) Botrytis sp. (LIG035), (9) Stromatinia cepivorum (LIG020), para ADN. Diversos factores tienen una marcada influencia sobre la distribución y migración del ADN o ARN a través del gel de agarosa, como el tamaño del ADN (a mayor tamaño de la molécula generalmente migra más lentamente), la concentración de la agarosa, conformación del ADN, voltaje aplicado, dirección del campo eléctrico, composición de las bases y temperatura, presencia de agentes intercalantes y composición del buffer de electroforesis (Yábar, 2003). Estos factores suelen confundir los resultados finales, por lo que se recomienda al investigador estandarizar algunos parámetros importantes que en la práctica suelen pasar desapercibidos. Durante el desarrollo de la actividad práctica (Grupo Nº 1), fue continua la falla a nivel eléctrico, presentándose variaciones de voltaje con la fuente de poder, se presume que, a problemas externos del suplidor de energía eléctrica, a problemas internos del equipo, como sulfatación de las conexiones, o a calidad de la concentración de la solución buffer usada en el proceso, por lo que se observa una imagen difusa en la placa de electroforesis (Fig. Nº 2). Fig. Nº 2. Placa de Electroforesis en Gel de Agarosa correspondiente al Grupo Nº 1. En la placa de electroforesis del Grupo Nº 1, se presenta un escaso desplazamiento de las bandas. La zona correspondiente a las muestras de ADN es completamente difusa, seguido del marker Lambda, y se visualiza la banda correspondiente a la muestra de ADN genómico (8) Botrytis sp. (LIG035). Al respecto, la continuidad y variación del voltaje aplicado permite la movilización de las moléculas de ADN de un polo a otro, a medida que aumenta la fuerza del campo eléctrico (aumento del voltaje), se incrementa la movilidad de las moléculas de ADN de alto peso molecular, pero de manera indistinta, generando que las moléculas no se separen ARN (1) ARN (2) ARN (3) ARN (4) Lambda ADN (6) ADN (7) ADN (8) ADN (9)
  7. 7. completamente unas de otras a pesar de aumentar la velocidad de electroforesis (Yábar, 2003). Posiblemente esta es una de las causas de la baja calidad de la placa electroforética obtenida por el Grupo Nº 1. La calidad del buffer de electroforesis puede ser otra de las causas de la baja calidad de la placa, la migración del ADN es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. En el caso de usar un buffer de baja concentración, la conductividad eléctrica disminuiría drásticamente por la falta de iones y, en consecuencia, la migración del ADN sería casi nula. Si la concentración de iones fuera excesivamente alta, la conductividad eléctrica sería muy eficiente y se generaría un sobrecalentamiento del buffer. El calor excesivo podría causar la licuación de la agarosa o la denaturación del ADN (Yábar, 2003). Sin embargo, ya que se observa desplazamiento de la muestra de ADN (8) Botrytis sp. (LIG035), se deduce que la falla de la actividad práctica esta direccionada al problema eléctrico. En la placa electroforética del Grupo Nº 2 (Fig. Nº 3), para ARN se observan claramente las subunidades correspondientes al Trichoderma harzianum LIG064 (1), (3) y (4), y en menor cantidad la banda (2). El marker  (5) se visualiza de forma íntegra. En el caso del ADN las subunidades correspondientes a Trichoderma longibrachiarum (LIG052) (6), Botrytis sp. (LIG035) (8) y Stromatinia cepivorum (LIG020) (9) se aprecian sutilmente, a excepción de la Trichoderma atroviride (LIG042) (7), que evidencia signos de degradación de la muestra. Fig. Nº 3. Placa de Electroforesis en Gel de Agarosa correspondiente al Grupo Nº 2. En el caso haber logrado un efectivo proceso de electroforesis, la imagen obtenida del gel mediante la visualización de luz UV debe aportar la información correspondiente a los pesos moleculares de ADN o ARN extraídos a las muestras. El uso de patrones de peso molecular (PM) se usa comúnmente, el marker Lambda DNA/Hind III constituye una referencia útil para calcular los pesos moleculares de fragmentos de ADN, después de la separación electroforética; el Lambda DNA/Hind III Marker (Fig. Nº 4) se obtiene a partir de ADN del fago λ digerido con Hind III hasta generar bandas entre 0,125 kb y 23 kb, aptas para ser utilizadas como marcadores de peso ARN (1) ARN (2) ARN (3) ARN (4) Lambda ADN (6) ADN (7) ADN (8) ADN (9)
  8. 8. molecular en geles de agarosa. Los patrones internos de PM proporcionan un instrumento para normalizar las distancias de migración de los fragmentos dentro de cada carril con el fin de facilitar las comparaciones entre carriles de las distintas luminografías (Hoisington et al., 1994). Fig. Nº 4. Marker Lambda DNA Hind III A los efectos didácticos de la actividad, el fragmento correspondiente a ADN (9), permite visualizar desde el inicio del gel, tres carriles bien demarcados en cada banda. Comparando con la banda del marker Lambda, las subunidades presentan PM que oscilan entre 2,03 kb (2027 bp) y 9,4 kb (9416 bp). CONCLUSIONES La información generada en el estudio permitió identificar las etapas claves para la extracción de ADN y ARN por electroforesis en gel de agarosa. El control del voltaje es fundamental para el desarrollo de las bandas en el gel de agarosa y la posterior visualización de los fragmentos de ADN o ARN en las luminografías. Las bandas electroforéticas de ARN de la cepa de Trichoderma harzianum (LIG064) presenta tres fragmentos definidos. La comparación de las intensidades de las bandas electroforéticas de ADN con el master Lambda, permite definir subunidades con PM entre 2,03 kb y 9,4 kb. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alabouvette, C., Olivain, C., Steinberg, C. (2006) Biological control of pnat deseases: the European situation. European Journal of Plant Pathology 114: 329-341. En: López Mondéjar, R. (2011). Detección y cuantificación de Trichoderma harzianum, y evaluación de su actividad biocontrol frente a la fusariosis vascular del melón mediante la aplicación de herramientas moleculares. Universidad de Alicante (Tesis Doctoral). pp. 7-17.
  9. 9. Chet, I. (1987) Trichoderma – aplication, mode of action, and potential as a biocontrol agen of soilborne plant pathogenic fungi. En: López Mondéjar, R. (2011). Detección y cuantificación de Trichoderma harzianum, y evaluación de su actividad biocontrol frente a la fusariosis vascular del melón mediante la aplicación de herramientas moleculares. Universidad de Alicante (Tesis Doctoral). pp. 7-17. Hjeljord L., Tronsmo, A. (1998) Trichoderma and Gliocladium in biological control: an overview. En: López Mondéjar, R. (2011). Detección y cuantificación de Trichoderma harzianum, y evaluación de su actividad biocontrol frente a la fusariosis vascular del melón mediante la aplicación de herramientas moleculares. Universidad de Alicante (Tesis Doctoral). Hoisington, D., Khairallah, M., & González- de-León, D. (1994). Protocolos de Laboratorio: Laboratorio de Genética Molecular Aplicada. CIMMYT. 2a ed., México, DF. López Mondéjar, R. (2011). Detección y cuantificación de Trichoderma harzianum, y evaluación de su actividad biocontrol frente a la fusariosis vascular del melón mediante la aplicación de herramientas moleculares. Universidad de Alicante (Tesis Doctoral). pp. 7-17. Somma, M., & Querci, M. (2007). Análisis de la presencia de organismos genéticamente modificados en muestras de alimentos. Extracción y purificación de ADN. European Comission JRC. Suarrez_Estrella, F., Vargas-Garcia, M.C., Lopez, M.J., Moreno, J. (2007) Effect of horticultural waste composting on infected plan residues with pathogenic bacteria and fungi: integrated and localizad sanitation. Waste Management 27:886-892. Posso Duque, D., Ghneim Herrera, T. (2008). Uso de Marcadores Microsatélites para la Estimación de Diversidad Genética en Plantas. Ediciones IVIC. Voet, D., & Voet, J. G. (2006). Bioquímica. 3ª Edición. Editorial Médica Panamericana. © Libermed Verlag S.A. – Montevideo, Uruguay. Yábar Varas, C. A. (2003). Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN. Serie de Normas Técnicas, (38).

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