Breve resumen sobre las tecnicas de microscopia para la biologia celular y molecular, presentando la mayoria de microscopios y sus funciones principales.

1. Principios y técnicas de Microscopia
Resumen
El primer microscopio óptico fue desarrollado en 1590 por Z. Janssen y su sobrino H. Janssen.
Robert Hooke, que observo las primeras células y por Antonie van Leeuwenhoek, quienes mejoraron el
microscopio para vislumbrarnos por primera vez la estructura interna de las células.
En la década de 1930 se desarrolló el microscopio electrónico que revoluciono nuestra capacidad de
explorar la estructura y la función celular, ya que es 100 veces mejor que el microscopio óptico para
visualizar objetos
En el microscopio se necesitan siempre tres elementos para formar una imagen: una fuente de
iluminación, una muestra para ser examinada y un sistema de lentes que enfocan la iluminación sobre la
muestra y que forma la imagen.
La longitud de onda de la iluminación establece un límite en el tamaño de los objetos que pueden ser
observados.
La interferencia es uno de los procesos por el cual dos o más ondas se combinan para reforzarse o
cancelarse, produciendo una onda igual a la suma de las dos iniciales.
En los mejores microscopios ópticos la apertura angular es alrededor de 70º.
La apertura angular de una lente es uno de los factores que determina la resolución de un microscopio,
que se define como la distancia mínima que existe entre dos puntos separados cuando se observa con
un microscopio.
La resolución está determinada por tres factores: la longitud de onda de la luz que se emplea para
iluminar la muestra, la apertura angular y el índice de refracción del medio que rodea la muestra.
El límite de resolución para un microscopio que emplea luz visible es aproximadamente 300nm en seco y
200nm con lentes para aceite de inmersión y 2nm para el microscopio electrónico. (La resolución puede
ser optimizada hasta valores de 100nm empleando luz ultravioleta como fuente de iluminación.
Con objeto de incrementar la apertura numérica, algunas lentes de microscopio están diseñadas para
utilizar aceite de inmersión entre la lente y la muestra.
Debido a que el límite de resolución determina la capacidad de una lente para distinguir entre dos
objetos que están muy próximos, también establece el límite superior de los aumentos útiles posibles
con cualquier lente.
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2. Los aumento útiles en un microscopio óptico están limitados aproximadamente a 1000 X en seco y a
1400 X con aceite de inmersión. Los aumentos por encima de estos límites se denominan <<aumentos
vacíos>> ya que no proporcionan información adicional acerca del objeto que se estudia.
El video microscopía digital puede registrar imágenes consecutivas optimizadas. En la que se registran y
se almacenan imágenes microscópicas poniendo una cámara de video en el plano de la imagen
producido por la lente ocular.
En el microscopio electrónico tienen dos diseños básicos: el microscopio electrónico de transmisión y el
microscopio electrónico de barrido. Ambos son similares ya que cada uno utiliza un haz de electrones
para producir la imagen
Cuadro comparativo
Fuente de Iluminación
Microscopio óptico
Microscopio electrónico
Es luz visible, y el sistema de lentes consiste en
Es un haz de electrones emitido por un filamento
una serie de lentes de vidrio.
de tungsteno calentado, y el sistema de lentes
La imagen puede ser vista o bien directamente a
consiste en series de electroimanes. El haz de
través de un ocular o bien se puede enfocar sobre electrones se enfoca en una pantalla fluorescente,
un detector como una película fotográfica o una
en una película fotográfica o es visualizada
cámara electrónica.
digitalmente empleando un detector.
Resolución
En un microscopio óptico se emplean lentes de
En un microscopio electrónico se emplean
vidrio para dirigir la dirección de los fotones
electroimanes como lentes para dirigir la dirección
de los electrones.
Aumentos
Limitados por 1000 X en seco y 1400 X en aceite
Son 100 veces mejor que el óptico, es decir
de inmersión, después de estos rangos de dice
100,000 X más pequeña que la de un fotón de luz
que son aumentos vacíos ya que no proporciona
visible, el límite teórico de resolución de un
ninguna información adicional.
microscopio electrónico (0.02nm) en algunos
ordenes de magnitud menor que el del
microscopio óptico (200nm).
Microscopio óptico compuesto de campo claro
Recorrido de la luz
Partes y funciones principales
Comienza con la fuente de iluminación, localizada Ocular: Aumenta la imagen formada por el
en la base del instrumento, los rayos de luz
objetivo.
procedentes de esta fuente pasan a través de
Tubo del cuerpo: transmite la imagen del objetivo
lentes condensadoras que dirigen la luz hacia la
al ocular.
muestra montada en un portaobjetos de vidrio
Brazo: da soporte al microscopio.
dispuesto en la platina del microscopio. La lente
Lentes objetivos: principales lentes que aumentan
objetivo es la responsable de la formación de la
la muestra.
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3. imagen primaria. La imagen primaria es
posteriormente aumentada por la lente ocular,
en algunos microscopios entre el objetivo y el
ocular se posiciona una lente intermedia para
conseguir aún más aumentos.
Platina: Mantiene la posición de la preparación
microscópica
Condensador: Enfoca la luz a través de la muestra.
Diafragma: Controla la cantidad de luz que entra
en el condensador
Tornillo de enfoque rapido.
Iluminador: Fuente de luz.
Base: Soporte del microscopio.
Tornillo de enfoque fino.
Características especiales
Las únicas muestras que se pueden observar directamente mediante el microscopio de campo claro
son aquellas que tienen color o tienen alguna otra propiedad que afecta a la luz que la atraviesa.
Muchas muestras biológicas carecen de esas características y por lo tanto deben ser tenidas con
colorantes o examinadas con tipos especiales de microscopios.
Microscopia de contraste de fases
Incrementa el contraste sin necesidad de cortar ni teñir, haciendo uso de las diferencias de grosor y de
índice de refracción de varias regiones de las células que se examinan.
La microscopia de contraste de fases usa una placa de fase: que es un componente óptico dispuesto en
el recorrido de la luz por encima del objetivo para poner en fase los rayos directos no difractados con
aquellos que han sido difractados por la muestra. (Corrige la luz alterada por el lente objetivo para que
el ojo humano no pueda detectar estos cambios de fase).
Como resultado…
Las estructuras internas de las células se visualizan a menudo mejor mediante microscopia de
contraste de fase que con óptica de campo claro.
Esta modalidad en microscopia óptica es particularmente útil para examinar muestras vivas y sin teñir
ya que los materiales biológicos producen difracción de la luz de manera casi inevitable.
¿En donde se emplea?...
Generalmente en microbiología y en la investigación de cultivos celulares para detectar bacterias,
orgánulos celulares y otras partículas presentes en las muestras vivas.
Microscopia de contraste de interferencia diferencial (DIC)
Utiliza un disociador del haz de luz para detectar diferencias de fase. Se asemeja a la microscopia de
fase, pero es más sensible ya que emplea un prisma especial para separar el haz de luz en dos rayos
separados. La imagen tiene apariencia tridimensional como resultado de una ilusión de fusión de
sombras que se produce ya que las diferencias de fase son positivas en un lado de la cebra y negativas
en el lado opuesto.
Componentes Ópticos Necesarios
Incluye un Polarizador, un analizador y un par de Prismas de Wollanston El polarizador y el primer
prisma de Wollanston separan el rayo de luz, creando haces separados por una pequeña distancia en
una dirección. Después de atravesar la muestra, los haces se recombinan para formar un rayo idéntico al
que entro inicialmente el polarizador y en el primer prisma de Wollanston.
El efecto neto es un marcado incremento en la resolución, que hace que esta técnica sea
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4. especialmente útil para estudiar muestras vivas y sin teñir.
Microscopia de Fluorescencia
Permite detectar la presencia de moléculas o iones específicos dentro de las células. Es un tipo
especializado de microscopia óptica que emplea luz para excitar fluorescencia en la muestra.
Que lo hace diferente…
Un microscopio de fluorescencia tiene un filtro de excitación entre la fuente de luz y el condensador,
que transmite únicamente luz de una longitud de onda particular. El condensador enfoca la luz sobre la
muestra, produciendo que los compuestos fluorescentes de la muestra emitan luz de una longitud de
onda más larga.
¿Qué se debe de hacer para emplear la Microscopia de Fluorescencia?...
Se emplean indicadores especiales de las moléculas denominadas sondas fluorescentes, una sonda
fluorescente es una molécula capaz de emitir luz fluorescente y que puede emplearse para indicar la
presencia de una molécula o un ion especifico. Una de las aplicaciones más frecuentes de las sondas
fluorescentes es la Inmunotincion. (ver glosario)
¿Qué técnicas se emplea para la Microscopia de Fluorescencia?...
Utilizando técnicas de inmunofluorescencia indirecta, se trata de un tejido o una célula con un
anticuerpo sin marcar. Este anticuerpo, llamado anticuerpo primario, se une a los sitios antígenos
específicos dentro del tejido o de la célula. Entonces se añade un segundo tipo de anticuerpo llamado
anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario está marcado con una partícula fluorescente y se une al
anticuerpo primario.
Como resultado produce una amplificación de señal y es mucho más sensible que la utilización de un
único anticuerpo primario. El método es <<indirecto>> ya que no detecta directamente donde se unen
los anticuerpos a los antígenos; técnicamente la fluorescencia refleja el sitio al que se ha unido el
anticuerpo secundario, y refleja el lugar donde se localiza la molécula de interés.
¡Algo más sobre la Microscopia de Fluorescencia!...
Se puede utilizar para monitorizar la distribución subcelular de varios iones además para detectar
macromoléculas como proteínas. Para conseguirlo, los químicos han sintetizado moléculas cuyas
propiedades de fluorescencia son sensibles a las concentraciones de iones como Ca2+, H+, Na+, Zn2+ y
Mg2+, así como potenciales eléctricos a través de la membrana plasmática.
Transferencia de energía por resonancia de Fluorescencia (FRET), ¿Qué es?...
Cuando dos moléculas fluorescentes cuyas propiedades de fluorescencia están emparejadas y muy
próximas entre sí, es posible que sufran FRET. En FRET la iluminación de una célula a la longitud de onda
de excitación del primer fluorόforo (donante) produce la transferencia de energía al segundo fluorόforo
(aceptor). Esa transferencia energía no implica un fotón de luz, pero una vez que ocurre induce la
emisión de luz por el aceptor en su longitud de onda característica.
Microscopia Confocal
Función principal: Minimiza el aspecto borroso mediante la exclusión de la luz fuera del foco de la
imagen. Definición: Es un tipo especializado de microscopio óptico que emplea un haz de luz láser para
producir una imagen de un único plano de la muestra en un momento determinado. Esta aproximación
mejora la resolución a lo largo del eje óptico del microscopio así se pueden distinguir las estructuras
localizadas en el centro de la célula de las que están en la superficie o de la parte inferior.
Como alternativa a la Microscopia laser Confocal…
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5. El microscopio confocal de disco giratorio emplea discos que giran rápidamente y que contienen un
conjunto de pequeñas lentes y una serie correspondiente de pinholes. Aunque no puede producir
secciones ópticas tan finas como los microscopios laser confocal, puede generar imágenes confocales
que se pueden adquirir rápidamente usando cámaras digitales.
¿Para qué se emplea un Pinhole en la Microscopia Confocal?...
Para eliminar la luz fuera del foco, el resultado es una imagen nítida, aunque las moléculas por encima y
por debajo del plano focal de la lente objetivo están siendo excitadas por la luz incidente
¿Cómo reducir la Foto toxicidad de las moléculas excitadas fluorescentes?...
Esto es posible utilizando la microscopia de excitación multifoton, se emplea un láser que emite pulsos
de luz de muy alta energía y muy rápidamente para irradiar la muestra. Para que se produzca
fluorescencia, la molécula fluorescente debe absorber una rápida sucesión de fotones (en algunos casos
tres o más).
¿Cuál es la tercera técnica empleada?...
La Microscopia digital de deconvoluciόn para producir imágenes muy nítidas, se basa en un principio
completamente diferente. Se emplea microscopia de fluorescencia convencional para adquirir series de
imágenes fluorescentes a lo largo del espesor de la muestra. Entonces se emplea un ordenador para
procesar digitalmente o deconvolucionar, cada plano focal para eliminar matemáticamente la
distribución debida a la luz fuera del foco.
Microscopia de Fluorescencia de reflexión (TRIF)
Supone un método incluso más preciso para observar las moléculas fluorescentes. TRIF se basa en una
propiedad útil de la luz: cuando la luz se mueve desde un medio con un alto índice de refracción (como
el vidrio) a un medio con un índice de refracción menor (como el agua o una célula), si el ángulo de
incidencia de la luz supera un cierto valor (denominado ángulo critico), la luz es reflejada.
¿Por qué es útil la TRIF si se refleja toda la luz?...
Una capa de luz muy pequeña, llamada el <<campo evanescente>> se extiende hacia el agua o la célula.
Esta capa es muy fina, de alrededor de 100nm, haciendo que TRIF sea 10 veces mejor que un
microscopio confocal para resolver objetos pequeños muy próximos a la superficie del cubreobjetos.
Como resultado…
Esto hace que TRIF se especialmente útil para estudiar la liberación de vesículas de secreción o para la
observación de la polimerización de actina.
Técnicas de preparación de muestras para Microscopia Óptica
La preparación de las muestras frecuentemente implica su fijación, seccionamiento y tinción. En los
preparativos para la tinción de células, los tejidos deben ser tratados previamente con Fijadores que
matan las células, al tiempo que preservan su apariencia estructural.
Los fijadores más ampliamente usados…
Son los ácidos y aldehídos como el ácido acético, el ácido pícrico, el formaldehido y el glutaraldehído.
Una forma de fijación de los tejidos es sencillamente sumergirlos en la solución fijadora
El paso siguiente luego de Fijar la Muestra…
Consiste en cortar la muestra en secciones que sean las suficientemente finas para transmitir la luz. De
otra forma la muestra seria opaca bajo el microscopio y no serían visibles las estructuras discernibles.
Para preparar estas secciones finas, la muestra se incluye en un medio (como plástico o parafina) que
puede mantener su posición mientras se obtienen las secciones.
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6. Y por último paso…
Las secciones se montan entonces en un portaobjeto y se procede a su tinción con cualquiera de los
colorantes, que se han adaptado para este propósito.
¿Para qué se emplea el Micrótomo?...
Después de la inclusión o la congelación rápida, la muestra se corta en secciones finas de pocos
micrómetros de grosor empleando un micrótomo, un instrumento que funciona de forma parecida a un
seccionador de embutidos.
La Autorradio grafía Microscópica
Es una aproximación con importancia histórica para la localización de componentes específicos dentro
de las células; es una técnica que emplea una emulsión fotográfica para determinar en qué lugar se
localiza un compuesto radiactivo específico dentro de la célula en el momento en que esta se fija y se
corta para microscopia.
Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM)
Forma una imagen a partir de los electrones que se transmiten a través de la muestra que está siendo
examinada.
Características Principales: Sistema de Vacío…
Los electrones no pueden viajar muy lejos a través del aire, se debe de mantener un intenso vacío a lo
largo de todo el recorrido del haz de electrones. Para crear este vacío dos tipos de bombas de vacío
funcionan manera conjunta. En algunos TEMs se incorpora un dispositivo llamado Trampa de vacío
ayuda a establecer un nivel de vacío elevado.
Canon de Electrones
Los electrones en TEMs son generados por un canon de electrones un conjunto compuesto por diversos
componentes. El Cátodo un filamento de tungsteno semejante al filamento de una bombilla, libera
electrones de su superficie cuando es calentado. La punta del cátodo está cerca de una apertura circular
de un cilindro de metal. Un voltaje negativo en este cilindro ayuda a controlar la emisión de electrones y
a dar forma al haz. En el otro extremo del cilindro se encuentra en ánodo. El ánodo se mantiene a 0 V
mientras que el cátodo se mantiene a 50-100 kV. Esta diferencia de voltaje hace que los electrones se
aceleren al pasar a través del cilindro y por lo tanto se denomina Potencial de aceleración.
La formación de la imagen…
Depende tanto de la longitud de onda como de las propiedades particulares de los electrones. Al tiempo
que el haz abandona el canon de electrones, entra en una serie de Lentes Electromagnéticas. Cada lente
es simplemente un espacio bajo la influencia de un campo electromagnético. La distancia focal de cada
lente se puede incrementar o disminuir variando la cantidad de corriente eléctrica aplicada a la espiral.
La Lente Condensadora…
Es la primera en afectar al haz de electrones. Funciona de la misma forma que su equivalente en el
microscopio óptico para enfocar el haz sobre la muestra.
La lente Objetivo, la Lente Intermedia, y la Lente de Proyección…
Es la parte más importante del sistema de lentes del microscopio electrónico, producen una imagen final
en una pantalla que emite fluorescencia cuando recibe impactos de los electrones o en un detector que
genera directamente la imagen.
¿Cómo se forma la imagen a partir de la acción de estas lentes electromagnéticas sobre un haz de
electrones?
Recuerda que el haz de electrones generado por el cátodo pasa a través de un sistema de lentes
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7. condensadoras y afecta a la muestra. Cuando impactan sobre la muestra, algunos electrones son
dispersados por la muestra, mientras que otros continúan su recorrido relativamente sin desviación.
Sistema de Captura de Imagen
La utilización de película permite crear impresiones fotográficas que se denominan Micrografías
Electrónicas y que se transforman en un registro fotográfico permanente de la muestra.
Voltaje
El haz de electrones es demasiado débil para penetrar en las muestras biológicas, de forma que las
muestras que se examinan mediante microscopia electrónica de transmisión convencional deben ser
extremadamente finas (normalmente no más de 100nm de grosor) de lo contrario, los electrones no
serían capaces de atravesar la muestra y la imagen seria completamente opaca.
Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)
Produce imágenes a partir de electrones reflejados por la superficie externa de la muestra (en lugar de
los electrones transmitidos a través de la misma). Es una técnica especial espectacular debido a la
sensación de profundidad que confiere a las estructuras biológicas, permitiendo estudiar la topografía
de superficie.
Características Principales…
El sistema de vacío y la fuente de electrones son similares a los del TEM, aunque el voltaje de
aceleración es más bajo.
La principal diferencia es la forma en que genera la imagen. En un SEM el sistema de lentes
electromagnéticas enfoca intensamente el haz de electrones en un punto que se mueve sobre la
superficie de la muestra mediante placas cargadas denominadas Deflectores del haz localizados entre la
lente condensadora y la muestra. (pág. 22 libro)
Técnicas de Preparación de Muestras para Microscopia Electrónica
En la Microscopia Electrónica de Transmisión: La obtención de secciones ultra finas y la tinción son
técnicas preparativas comunes.
Implica el seccionamiento de tejidos y células en secciones ultra finas de no más 50-100 nm de grosor,
las muestras deben ser previamente fijadas químicamente y estabilizadas. Los fijadores que se emplean
son habitualmente soluciones de aldehídos y muy comúnmente glutaraldehído. Después de la fijación se
tiñe habitualmente con una solución al 1-2% de treta oxido de osmio tamponado (OsO4). Se une a varios
componentes celulares haciéndolos más densos a los electrones.
Los Fijadores Químicos: Efecto 1, son lentos; la difusión del fijador en la muestra para fijar sus
estructuras requiere una mínima cantidad de tiempo. Efecto 2, extraen componentes celulares, a
menudo se pierden en la fijación algunas estructuras pequeñas dentro de las células
Congelación a alta presión: Sin ella se forman cristales de hielo dentro de las muestras lo que produce
danos en sus estructuras.
Crio sustitución: El agua de la muestra es reemplazada muy lentamente por un solvente orgánico, como
la acetona, durante un periodo de días.
El tejido posteriormente pasa a través de una serie de soluciones de alcohol que los deshidratan, y
posteriormente se sumergen en una solución de un disolvente como acetona u oxido de propileno para
prepararlo para su inclusión en una resina liquida plástica de tipo epoxi.
Se tiñen de nuevo, esta vez con soluciones que contienen plomo y uranio, este paso incrementa el
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8. contraste de la muestra ya que el plomo y el uranio confieren una densidad electrónica mayor a
regiones específicas de la célula.
Se pueden localizar moléculas en Micrografías Electrónicas con Radioisótopos o anticuerpos
Para el TEM, la muestra que contiene componentes marcados radiactivamente se examinan
simplemente en secciones ultra finas sobre rejillas de cobre en lugar de en secciones finas montadas en
portaobjetos de vidrio.
Inmunomicroscopia Electrónica (Inmuno EM): La fluorescencia no se puede visualizar en el microscopio
electrónico y para visualizar los anticuerpos estos deben ser unidos a sustancias densas a los electrones
y por lo tanto visibles como puntos opacos.
Una de las aproximaciones más comunes es acoplar las moléculas anticuerpo con partículas de Oro
coloidal.
La Microscopia Correlativa para cubrir el espacio entre las microscopias ópticas y electrónicas
La Microscopia Correlativa: En ella se captan imágenes dinámicas de una célula empleando microscopia
óptica, a menudo usando anticuerpos y/o GFP.
Generalmente se emplea inmunoEM para determinar la localización de la proteína con una alta
resolución.
La microscopia correlativa establece así un puente entre las imágenes dinámicas de microscopia óptica y
las imágenes detalladas que solamente se pueden adquirir mediante EM.
La tinción Negativa en EM
Tinción Negativa: es una de las técnicas más simples en microscopia electrónica de TEM, las muestras
intactas se visualizan simplemente en relieve en contraste con un medio tenido intensamente.
¿Cómo se Realiza?...
La rejilla de cobre debe ser inicialmente cubierta con una película de plástico muy fina. Entonces se
suspende la muestra en una pequeña gota de líquido que se aplica sobre la superficie de plástico y se
deja secar al aire, una vez que la muestra se ha secado en la rejilla se aplica a la superficie de la película
una gota de colorante como acetato de uranillo o ácido fosfotungsico. Los bordes de la rejilla se hacen
contactar en diversos puntos con papel filtro para absorber el exceso de colorante, esto deja al
colorante por debajo y alrededor de la muestra y de sus características ultra estructurales.
La Técnica de Sombreado
Consiste en vaporizar una capa fina de un metal electro denso, como oro o platino, con un cierto Angulo
sobre la superficie de la muestra biológica y permite visualizar partículas aisladas como macromoléculas.
¿Cómo Podemos Visualizar el ADN o RNA?...
Comúnmente se emplea un procedimiento relacionado. En esta técnica, se extiende una solución de
DNA y/o RNA en una interfase aire-agua, creando una mono capa molecular que se recoge como una
fina película que es visualizada al depositar uniformemente metal pesado sobre ella.
Para mayor información de la técnica de sombreado: capítulo 1. Pág. 26-27. Biología Molecular y celular
Wayne Becker, Alberto García Gonzales, Jaime Gonzales Poggio.
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9. La Crio fractura y El Grabado por Congelación
Consta en lugar de cortar secciones uniformes a través de la muestra de tejido (o de teñir material sin
seccionar), las muestras congelan rápidamente a la temperatura del nitrógeno líquido o de helio líquido,
se someten al vacío, y se golpean con el borde de una cuchilla afilada. Las muestras congeladas a
temperaturas bajas son demasiados duras para ser seccionadas.
Las membranas crio fracturadas aparecen como superficies lisas salpicadas con.
Partículas Intramembranosas: estas partículas son proteínas integrales de membrana que han
permanecido en una u otra mono capa al pasar el plano de fractura por el interior de la membrana.
Grabado por congelación: Añade un paso adicional respecto a la crio fractura y permite aportar más
información. A continuación de la fractura de la muestra, pero antes del sombreado, se dispone el brazo
del micrótomo directamente sobre la muestra durante un periodo corto de tiempo. Esta maniobra
produce la evaporación (sublimación) de una pequeña cantidad de agua de la superficie de la muestra
sobre la superficie de la cuchilla y esta sublimación produce un efecto de grabado que consiste en la
acentuación de los detalles de superficie.
Estereomicroscopia Electrónica
Se obtiene información tridimensional fotografiando la misma muestra desde dos ángulos ligeramente
diferentes.
¿Cómo se consigue?...
Usando una mordaza especial que puede ser inclinada con respecto a las de electrones. La muestra se
inclina inicialmente en una dirección y se fotografía, y después se inclina la misma magnitud en la
dirección opuesta y se fotografía de nuevo.
Preparación de muestras para Microscopia electrónica de Barrido
El objetivo es preservar las características estructurales de la superficie celular y trata al tejido de forma
que se minimice el daño causado por el haz de electrones.
El procedimiento es similar a la preparación de secciones ultra finas en la TEM, pero sin el paso de
cortado.
El tejido está fijado en aldehídos, postfijado en tetra óxido de osmio y deshidratado mediante el
procesamiento a través de series de soluciones de alcohol.
Otros Métodos de Imagen
La Microscopia de Barrido de Sonda
Denominado microscopio efecto de túnel (STM) desarrollado a principios de los años 80 con el fin de
explorar la estructura superficial de muestras a nivel atómico.
Características…
Utiliza una sonda muy pequeña que no emite un haz de electrones, sino por el contrario posee una
punta hecha de un material conductor como el platino-iridio. La punta de la sonda esta
extremadamente afilada estando compuesta por un único átomo. Se puede mover en tres dimensiones
sobre una superficie. Las dimensiones <x> y <y> barren la superficie, mientras que la <z> controla la
distancia de la punta sobre la superficie.
Limitaciones…
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10. 1) La muestra debe ser conductor eléctrico,
2) la técnica únicamente proporciona información de los electrones asociados con la superficie de
la muestra.
Aplicaciones
Es la medida de los cambios dinámicos en la conformación de las biomoleculas en funcionamiento, por
ejemplo: que pudieses visualizar el cambio de forma de una única molécula de una enzima medida que
hidroliza ATP para producir energía necesaria para transportar iones a través de membranas.
Difracción de rayos X
Este método reconstruye imágenes a partir de los patrones de difracción de rayos x que pasan a través
de una muestra cristalina o fibrosa, revelando la estructura molecular con una resolución de nivel
atómico.
La Cristalografía de rayos X
Proporciona unas visiones sin precedentes de las moléculas biológicas a nivel atómico, sin embargo la
cristalografía requiere grandes cantidades de moléculas purificadas.
Técnica del CrioEM
Ayuda a rellenar los vacíos, se congelan rápidamente mediante crio fijación de moléculas o agregados
macromoleculares purificados. La congelación rápida evita la formación de cristales de hielo. Por el
contrario, las moléculas quedan embebidas en Hielo vítreo agua congelada no cristalina que preserva
mejor las estructuras de las moléculas embebidas.
Glosario:
Interferencia: Es cuando un haz de luz o de electrones para a través de una lente y se enfoca en un
punto, la imagen que se forma es consecuencia de una propiedad de las ondas.
Difracción: Es la imagen que se ve cuando se observa una muestra a través de una serie de lentes es
realmente un patrón de interacciones aditivas y destructivas de las ondas que atravesaron las lentes.
Distancia focal: Es la distancia entre el punto medio de la lente y el punto focal en el que convergen los
rayos que atraviesan la lente.
Apertura angular: Es la mitad del ángulo ἀ del cono de luz que entra en el objetivo del microscopio a
partir de la muestra. Es por lo tanto una medida de la cantidad de iluminación que sale de la muestra y
pasa a través de la lente.
Índice de refracción: Es una medida de la variación de la velocidad de la luz al atravesar de un medio a
otro.
Microscopio compuesto: utiliza combinaciones de diversas lentes y se denomina por lo tanto
microscopio compuesto.
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11. Fluorescencia: Hace referencia al proceso que comienza con la absorción de luz por una molécula y
termina con su emisión. La aproximación a este proceso se optimiza considerando el comportamiento
de un cuanto de luz en contraposición a su comportamiento ondulatorio.
Inmunotincion: Una técnica basada en la capacidad de los anticuerpos de reconocer y unirse a
moléculas específicas (las moléculas a las que se unen los anticuerpos se denominan anticuerpos).
Foto blanqueamiento: Cuando las moléculas fluorescentes son irradiadas con luz la longitud de onda de
excitación apropiada durante largos periodos de tiempo, sufren un foto blanqueamiento (la irradiación
induce que las moléculas dejen de emitir fluorescencia).
(FRAP) La Recuperación de la Fluorescencia después del Foto blanqueamiento: Es una medida útil de la
velocidad a la que las moléculas difunden o son transportadas directamente.
Foto activación: Produce la situación contraria a la foto blanqueamiento, la liberación local de una
molécula fluorescente produce un punto luminoso de fluorescencia que se puede seguir a medida que
las moléculas siguen su camino a lo largo de la célula.
Perfusión: Inyección del fijador en el torrente circulatorio del animal antes de extraer los órganos.
Artefactos (preparación de muestras): Son representaciones falsas o inexactas de la muestra, que se
producen por el tratamiento químico o por la manipulación de células y los tejidos.
La Crio fijación: Consiste en una congelación rápida (20 ms) de una muestra bajo condiciones de alta
presión, evita los problemas en perder pequeñas estructuras celulares.
Crio protección: Reduce la formación de cristales de hielo durante la congelación.
Secador de punto crítico: Se emplea para secar la muestra en condiciones de presión y temperatura
controlada.
Interferencia Constructiva: Las ondas procedentes de dos orígenes entran en fase, su amplitud total es
aditiva.
Interferencia Destructiva: Si están fuera de fase, su amplitud se reduce. (Este efecto se puede ver
cuando la luz pasa a través de dos orificios en una pieza de material opaco y entonces incide sobre una
superficie blanca).
Nota: Si algún apartado no resulta lo más claro posible revisar el libro de texto para mayor información;
Biología Celular y Molecular de Wayne Becker Capitulo 1 [Principios y técnicas de microscopio].
mailto:martjorge8@gmail.com?subject=biologia_capitulo_1
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