1. Unidad 3. Nutrición, metabolismo,
crecimiento y control de microorganismos
Objetivos
• Conocer
-Las características de los principales grupos nutricionales de microorganismos, su
crecimiento y control
-Las diferentes aplicaciones de la microbiología
-Las peculiaridades metabólicas de los microorganismos y su diversidad
-Las pautas del crecimiento microbiano y los factores que lo influyen
-Los agentes antimicrobianos más comunes y sus mecanismos de acción
• Asimilar
-El mantenimiento adecuado de cultivos puros de microorganismos solo es posible con la
práctica de técnicas asépticas
-El metabolismo microbiano es enormemente versátil y plástico
• Capacidad
-Prepara cultivos y manejar varias técnicas de esterilización
-Realizar técnicas básicas de recuento de bacterias
-Aislar microorganismos
-Actualizar su formación y necesidades en microbiología a través del manejo herramientas
bioinformáticas

2. Modelos basado en datos aéreos indican que si la pandemia de gripe que
surgió en Hong Kong en 1968 apareciese en el año 2000, daría la vuelta al
globo mucho antes. Una vacuna tarda en prepararse unos 9 meses si se
incuba en huevos.
Science, Vol 306, Issue 5695, 392-394 , 15 October 2004

3. Unidad 3. Nutrición, metabolismo,
crecimiento y control de
microorganismos
Capítulo 6. Crecimiento microbiano: La
curva de crecimiento, parámetros de
crecimiento, determinación del
crecimiento. Cultivos continuos. Influencia
de los factores ambientales (solutos, pH,
temperatura, O2, presión y radiación).
Crecimientos de los microorganismos en
ambientes naturales

4. La curva de crecimiento
El crecimiento microbiano se define como un aumento de los constituyentes celulares
que puede dar como resultado:
-un aumento en el número de células
ej.: cuando el microorganismos de reproduce por gemación o fisión binaria
-aumento en el tamaño de la célula
ej.: los microorganismos cenocíticos llevan a cabo divisiones del núcleo que no
van acompañadas de división celular
En microbiología se estudia frecuentemente el crecimiento de la población en lugar del
crecimiento de células individuales
La curva de crecimiento
se observa cuando los
microorganismos son Fase estacionaria
cultivados en un medio Fase
discontinuo (batch) (o cesa el crecimiento de la población
exponencial
sistema cerrado: cultivo en un (log) Fase de
muerte
recipiente cerrado en el que velocidad máxima de
no se regenera el medio) división y crecimiento de disminuye
generalmente se representa Fase la población el tamaño
lag
como el logaritmo del número de la
de células frente al tiempo no aumenta población
se diferencian cuatro fases

5. La curva de crecimiento
Crecimiento equilibrado
• los componentes celulares se sintetizan a una velocidad constante unos con
respecto a otros
– ej.: durante la fase exponencial de crecimiento
Crecimiento no equilibrado
• la velocidad de síntesis de los componentes celulares varia de forma relativa (unos
componentes respecto a otros)
• tiene lugar en una gran variedad de condiciones ej.: modificaciones en los niveles de
nutrientes (de un medio pobre a un medio rico o de un medio rico a uno pobre) o
cambios en las condiciones ambientales
Efecto de la concentración de nutrientes en el crecimiento

6. La curva de crecimiento
Fase Lag
• las células sintetizan nuevos componentes
– ej.: material ya presente que se deba reponer o aumentar en concentración
– ej.: material, no existente anteriormente, empleado para adaptarse al medio o
nuevas condiciones de crecimiento
• duración variable: en algunos casos es muy corta y en otros está ausente
Fase exponencial (ó logarítmica)
• la velocidad de crecimiento es constante
• en esta fase la población es más uniforme desde
el punto de vista químico y propiedades físicas
Ejemplo de crecimiento exponencial
las células se dividen y doblan su número a intervalos regulares

7. La curva de crecimiento
Fase estacionaria
• el número total de células viables permanece constante
– puede ser que células metabólicamente activas dejen de reproducirse
– puede ser que la velocidad de división sea la misma que la de muerte
Posibles razones que determinan la entrada a la fase estacionaria
• limitación, carencia, de nutrientes
• disponibilidad de oxígeno limitada
• acumulación de productos tóxicos
• densidad poblacional crítica
Respuesta de los microorganismos a las carencias de nutrientes
• cambios morfológicos. Ej.: formación de endosporas
• disminución del tamaño, contracción del protoplasto y condensación del nucleoide
• producción de proteínas específicas de situaciones de carencia. Ej.: Factores sigma
• supervivencia alargo plazo
• aumento de la virulencia
Fase de muerte
• La muerte celular se define como la pérdida irreversible de la capacidad de dividirse
• las células se mueren exponencialmente
• el algunos casos la velocidad de muerte es lenta debido a la acumulación de células
resistentes

8. Parámetros del crecimiento
Parámetros de crecimiento
• La fase lag y la fase estacionaria se caracterizan por su duración que se calcula a
través de la intersección con la otras fases
Duración de la
fase lag
Duración de la fase lag
• La estimación de la fase lag es muy
importante en microbiología de alimentos
ya que puede determinar el tiempo de
caducidad de un producto

9. Parámetros del crecimiento
La fase exponencial se caracteriza por:
• su duración
• el tiempo medio de generación o duplicación (g)
– tiempo necesario para que la población doble su
tamaño
• la velocidad específica máxima de crecimiento ó
constante de velocidad de crecimiento ó constante de
crecimiento (abreviada como k ó µ)
– proporción en la que aumenta la población por
unidad de tiempo
• frecuentemente también se expresa el crecimiento como
generaciones por hora
Durante el crecimiento exponencial las
células se dividen y doblan su número a
intervalos regulares

10. Parámetros del crecimiento
Durante el crecimiento exponencial la velocidad de
crecimiento (dN/dt) es constante a los largo del
tiempo:
dN/dt=k.N
Integrando esta función obtenemos
ln Nt- ln N0 =k.t y ln Nt= ln N0 +k.t
La constante de crecimiento “k” se puede estimar de
la pendiente que se obtiene al representar el
logaritmo natural (ln) del número de células frente al
tiempo. Si se emplea logaritmo en base 10 (log10) en
lugar de ln, la pendiente es 2.3 veces más pequeña
que la constante de crecimiento real)
Como el número de células en un tiempo t es:
Nt = N0 ek.t
El tiempo de duplicación o generación “g” es cuando Nt= 2N0, entonces:
2 N0 = N0 ek.g g = ln2/k= 0.69/k
Nota: El contenido del Prescott puede llevar a error ya que define la constante de crecimiento o velocidad media
de crecimiento como el número de generaciones por unidad de tiempo, es decir, el inverso del tiempo de
generación. En la representación logarítmica en base 10 que se muestra arriba, logN = N0+k.t. Como la derivada
de logN es (dN/N).loge, la de la constante es cero y la de “t” es “dt” estonces (dN/N).loge= k.dt y la velocidad de
crecimiento (dN/dt) es:
dN/dt= k.t/log e por eso la pendiente es 2.3 veces más pequeña que la constante de crecimiento real

11. Parámetros del crecimiento
Durante el crecimiento exponencial la representación
del ln del número de células frente al tiempo da lugar
a una recta. Por consiguiente:
ln Nt=a+k.t Siendo “a” y “k” constantes
Derivando esta función obtenemos la función que
define las variaciones infinitesimales del número de
células a lo largo del tiempo
dN/N=k.dt O lo que es lo mismo dN/dt=k.N
Definimos dN/dt como la velocidad de crecimiento.
k es la constante de crecimiento y representa la proporción
más probable a la que se incrementa la población por
unidad de tiempo
El tiempo de duplicación o generación “g” es cuando Nt= 2N0, entonces:
En la ecuación original (ln Nt=a+k.t ) se observa que cuando el tiempo es cero a=lnN0.
Por lo tanto podemos reescribir la ecuación como
ln Nt=lnN0+k.t, siendo N0 el número inicial de células. La misma ecuación se
puede reescribir como Nt = N0 ek.t. Con ella es sencillo calcular el tiempo de generación
(g), tiempo al cual la población se incrementa de N0 a 2N0.
2 N0 = N0 ek.g g = ln2/k= 0.69/k

12. Y si en lugar de representar lnN vs. t
representamos lgN vs. t, ¿qué pasaría?
lg Nt=a+k.t
dN/(N.ln10)=k.dt
dN/dt= k.ln10.N
k ya no representa la proporción más
probable a la que se incrementa la población
por unidad de tiempo. El incremento de
población es k.ln10.

13. Parámetros del crecimiento
El tiempo de generación varía
mucho de unas especie a otras

14. Determinación del crecimiento
Determinación del crecimiento microbiano
• puede ser medido como el cambio en el número de individuos de una
población, recuento de células
• o como los cambios en la masa de una población
Determinación del número de células (recuento)
• Recuento directo de células
– cámaras de recuento
• fácil, barato y rápido
• sirve para eucariotas y procariotas
• no diferencia células vivas y muertas
Cámaras de recuento
– contadores electrónicos
Una suspensión de microorganismos se pasa por un pequeño orificio a través del cual circula
una corriente eléctrica que es interrumpida a medida que pasan los organismos
• no diferencia vivas de muertas
• rápido y fácil
• útil con grandes microorganismos (no procariotas)
– sobre filtros de membrana
• se filtran las células sobre una membrana y se tiñen con fluorescencia
• útil para contar bacterias
• con algunos marcadores pueden diferenciarse células vivas de muertas

15. Determinación del crecimiento
• Recuento directo de células (continúa)
– Citometría de flujo
Las células se tiñen con un marcador fluorescente
(salvo que tengan fluorescencia intrínseca) y se
pasan por un capilar muy fino sobre el que inciden
dos haces de luz láser uno de ellos permitirá medir
la dispersión de luz (relacionada con el tamaño de
las partículas) y otra excitará el marcador
fluorescente
– es caro
– puede diferenciar especies y células vivas y
muertas
– puede diferenciar células vivas y muertas
Ej.: el análisis combinado de la luz
dispersada y la emisión natural de
fluorescencia de los pigmentos
fotosintéticos del fitoplacton permite
diferencias a Synechococcus (puntos
verdes) Prochlorococcus (puntos
rojos) y algas eucariotas (puntos
azules). Los puntos fucsia son
marcadores de tamaño.

16. Determinación del crecimiento
Recuento de células viables
•recuento en placa
• permite medir el número de células viables en un medio determinado
• el tamaño de la población se expresa como unidades formadoras de colonias
(CFU)
• simple y sensible
• ampliamente usado en el recuento de microorganismos viables en alimentos agua
y suelo
• los resultados pueden ser imprecisos si las células se agregan o agrupan (en
filamentos, por ejemplo) y varias células dan lugar a una colonia
se siembran diluciones (en profundidad o por extensión)
en un medio sólido adecuado
↓
se incuba y se cuenta el número de colonias
↓
se calcula el número de células en la población

17. Determinación del crecimiento
Recuento de células viables (Continúa)
•Método de filtración en membrana:
•concentra las células
•mide el número de células viables
•elimina inhibidores presentes en el medio en el que están suspendidas
•muy útil para analizar muestras acuáticas

18. Determinación del crecimiento
Determinación de la masa de la población
• Peso seco
– laborioso y no muy sensible
• Cuantificación de un componente o sustancia celular
– ej.:, proteína, DNA, ATP o clorofila
– útil si la cantidad de componente o sustancia en cada célula es
constante
• determinación turbidométrica (dispersión de luz)
– rápida, fácil y sensible
más células
↓
más luz dispersada
↓
menos luz detectada
En un intervalo* se cumple la ley
de Lambert-Beer
A=ε•c•l
* Según los espectrofotómetros, el intervalo de
absorbancia en el que la relación es lineal varía
de 0,2 -0,6 a 0,1-0,9. Fuera de ese intervalo es
conveniente diluir la muestra

19. Cultivos continuos
Cultivo continuo de microorganismos
• crecimiento en un sistema abierto
– se realiza un suministro
constante de nutrientes
– se realiza una eliminación
continua de residuos
• mantiene las células en fase
logarítmica/exponencial a una
concentración constante de biomasa
durante largos periodos de tiempo
• esto se logra empleando un sistema
de cultivo continuo
– Quimiostatos
– Turbidostatos
El quimiostato
• la velocidad a la que se añade el medio fresco
al cultivo es igual que la velocidad a la que se
elimina el medio del cultivo
• un nutriente esencial está en cantidades
limitantes

20. Cultivos continuos
Velocidad de dilución y crecimiento microbiano
velocidad de dilución – velocidad a la que el medio fresco fluye hacia el cultivo
(mL/h) relativa al volumen del cultivo (mL)
Observa que:
•la densidad celular se
mantiene en un amplio
intervalo de velocidades
de dilución
•el quimiostato funciona
Valor medido
mejor a bajas
velocidades de dilución
No olvidéis
Velocidad de dilución

21. Cultivos continuos Turbidostato
El turbidostato
• regula el flujo de medio de cultivo fresco al recipiente del
cultivo de forma que se mantiene una turbidez o
densidad celular constante
• la velocidad de dilución es variable
• no hay nutrientes limitantes
• el turbidostato funciona mejor a elevadas velocidades de
dilución
Importancia de los métodos de cultivo continuos
• se puede obtener un suministro constante de células
creciendo en fase exponencial a una velocidad conocida
• se puede estudia el crecimiento de microorganismos a muy
baja concentración de nutrientes, próxima a la encontrada
en ambientes naturales
• se puede estudiar la interacción de microorganismos bajo
condiciones parecidas a las encontradas en medios
acuáticos
• fundamentales en biotecnología y microbiología industrial y
de los alimentos

22. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
Influencia de los factores ambientales en el crecimiento
• la mayor parte de los microorganismos crecen bajo condiciones ambientales moderadas
• algunos microorganismos son extremófilos: crecen en condiciones que serían letales para
la mayoría del resto de los microorganismos
cantidad de agua disponible para los organismos
Solutos
disminuye por la interacción con moléculas de soluto (efecto
Actividad del agua (aw) osmótico)
a mayor [soluto] ⇒ menor aw
disminuye por la adsorción a superficies (efecto matriz)
Límites inferiores de actividad del agua para el crecimiento microbiano

23. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
Organismos osmotolerantes
• crecen en un amplio intervalo de actividades de agua
• muchos emplean solutos compatibles para aumentar su concentración
osmótica interna
– solutos que son compatibles con el metabolismo y el crecimiento
• algunos contienen proteínas y membranas que requieren una concentración
de solutos elevada para su estabilidad y actividad
• Organismos halófilos ej.: Halobacterium
– requiere elevados niveles de NaCl para crecer
Salinas con un afloramiento (bloom) de Halobacterium. El color se debe a la
bacteriorodopsina

24. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
pH
• logaritmo
negativo de la
concentración de
H+
• acidófilos
– crecimiento
óptimo entre
pH 0 y pH 5.5
• neutrófilos
– crecimiento
óptimo entre
pH 5.5 y pH 7
• alcalófilos
– crecimiento
óptimo entre
pH8.5 y pH
11.5

25. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
• la mayoría de los acidófilos y alcalófilos mantienen un pH interno próximo a la neutralidad
– para ello, algunos organismos emplean mecanismos de intercambio de
protones/iones
• algunos sintetizan proteínas de protección
– ej.: proteínas de estrés ácido (acid-shock proteins)
• algunos microorganismos modifican el pH de su hábitat produciendo productos de
desecho ácidos o básicos
– la mayoría de los medios contienen tampones para evitar la inhibición del crecimiento
Temperatura
• Los microorganismos muestran temperaturas de crecimiento mínimas, máximas y
óptimas
• Según la temperatura óptima los microorganismos se clasifican en psicrofilos,
psicrotrofos, mesófilos, termófilos e hipertermófilos

26. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
Concentración de oxígeno
Fundamento de la respuesta diferencial al oxígeno
• El O2 se reduce fácilmente a productos tóxicos
– Radical superóxido (O2+ 1e–→O2• –)
– Peróxido de hidrógeno (O2 •–+1e–+2H+→H2O2)
– Radical hidroxilo (H2O2+ 1e–+1H+→H2O+OH •)
• Los organismos
aerobios sintetizan
enzimas protectores
– superoxido
dismutasa (SOD)
2O2 •–+2H→O2+H2O2
– catalasa
2H2O2→2H2O + O2
Necesita O2 Prefiere O2 Indiferente al O2 El O2 es tóxico < 2 – 10% O2
Positiva Negativa
O2, crecimiento microbiano y su relación con las actividades enzimáticas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa

27. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
Una vez preparado, en el agar tioglicolato se desarrolla un gradiente estable de
oxígeno, con una alta concentración de oxígeno en la superficie y ausencia de
oxígeno en la base. Los microorganismos desarrollan diferentes pautas de
crecimiento según su relación con el oxígeno. Los aerobios estrictos solo crecen
en la superficie del agar (Af, Alcaligenes faecalis; Pf, Pseudomonas fluorescens).
Los anaerobios aerotolerantes crecen a igual velocidad a lo largo del tubo (Lp.
Lactobacillus plantarum). Los anaerobios facultativos crecen en todo el tubo
pero más junto a la superficie (Se, Staphylococcus epidermidis; Ea, Enterobacter
aerogenes). Los anaerobios estrictos crecen solo en el fondo del tubo.

28. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
Qué relación tienen estos microorganismos con el oxígeno

29. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
Presión
• organismos barotolerantes
– un aumento de presión les afecta negativamente pero no tanto como a los no
tolerantes
• organismos barofílicos
– necesita o crece más rápidamente en presencia de altas presiones

30. Influencia de los factores ambientales (solutos, pH, temperatura, O2, presión y radiación)
Radiación
Daños por radiación
• radiación ionizante
– Rayos X y rayos gamma
– provocan mutaciones → muerte
– rompe la estructura química de muchas
moléculas incluyendo el DNA
• el daño puede ser reparado mediante
mecanismos de reparación de ADN
• radiación ultravioleta (UV)
– provocan mutaciones → muerte
– provoca la formación de dímeros de timina en el DNA
– El DNA dañado puede ser reparado según dos mecanismos
• fotorreactivación – los dímeros se rompen en presencia de luz
• reactivación en oscuridad – los dímeros se rompen y reparan en ausencia
de luz
• luz visible
– altas intensidades generan oxígeno singlete (1O2) (agentes oxidantes muy potentes
– pigmentos carotenoides
• protege a numerosos microorganismos de la fotooxidación

31. Crecimientos de los microorganismos en ambientes naturales
Crecimientos de los microorganismos en ambientes naturales
Factores limitantes del crecimiento
• los ambientes microbianos son complejos, constantemente cambiantes y puede
exponer un microorganismo a gradientes solapados de nutrientes y factores
ambientales
• Ley del mínimo de Leibig
– la biomasa total está determinada por el nutriente presente a menor
concentración
• Ley de la tolerancia de Shelford
– por encima o debajo de algunos límites ambientales, un microorganismo no
crecerá, independientemente del nutriente suministrado
Recuento de microorganismos viables pero no cultivables
• en condiciones de estrés los microorganismos pueden perder temporalmente la
capacidad de crecer en medios de cultivo normales
• el 90 % de los microorganismos no crecen en medios de cultivo normales
(comerciales)
• se han desarrollado métodos microscópicos e isotópicos para el recuento de
organismos viables no cultivables

32. Crecimientos de los microorganismos en ambientes naturales
Sensación de Quorum (Quorum Sensing) y las poblaciones microbianas
Luminiscencia de
Vibrio fischeri
• quorum sensing
– promueve la comunicación
microbiana, la cooperación
y sincronización
– implica la secreción y
detección de señales
químicas
Vibrio fischeri
Pseudomonas
aeruginosa
Agrobacterium
tumefaciens
Erwinia carotovora