Enzimologia

1. Aproveitamento do resíduo de laranja
para a produção de enzimas
lignocelulolíticas
por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr)
Universidade Federal do Ceará
Departamento de Tecnologia de Alimentos
Disciplina: Enzimologia e Tecnologia das Fermentações
Professora: Vanesca Frota
Ana Beatriz Bezerra Moraes
Ana Cláudia de Morais Lima Nascimento
Ana Karoline Ferreira Leite
Haysa Sales Rodrigues
Rayane Rodrigues
Sinara Lemos de Paiva

2. 1. Introdução
2.Objetivos
3. Materiais e Métodos
4. Resultados e Discussão
5. Considerações Finais
6. Etapas Futuras
7. Referências Bibliográficas
Sumário
2

3. 1. Introdução
3
• Nos últimos anos, há um interesse
crescente no uso de diversos resíduos
agroindustriais;
• Produção de diversas moléculas:
proteínas microbianas, ácidos orgânicos,
etanol, enzimas e metabólitos
secundários biologicamente ativos;
• Economicamente viável;
• Reduz os problemas ambientais.

4. 4
1. Introdução
• A laranja está entre as frutas mais
produzidas e consumidas no mundo;
• A citricultura é uma das atividades
agrícolas que mais vem se desenvolvendo
na região noroeste do Paraná;
• 34% da produção é transformada em
suco;
• Em grandes países produtores esta
percentagem chega a 96%;
• O resíduo equivale a 50% do peso da fruta
e tem uma umidade aproximada de 82%.

5. 5
1. Introdução
• O resíduo de laranja é usado
principalmente como complemento para
ração animal;
• Estes resíduos possuem utilização restrita;
• Grande quantidade de água e alto custo de
secagem;
• Interesse das empresas em desenvolver
mercado para bagaço cítrico úmido;
• Os resíduos de laranja podem ser utilizados
na obtenção de fertilizantes orgânicos,
pectina, óleos essenciais, compostos com
atividade antioxidante e várias enzimas
(pectinases e amilases).

6. 6
1. Introdução
• Pleurotus spp.(Jack:Fr) Kumm.
(Pleurotaceae, Basidiomicetes) é um grupo
de cogumelos com alto valor nutricional;
• São fungos causadores da podridão branca
da madeira;
• Degradam a lignina, um polímero fenólico
recalcitrante encontrado nos vegetais;
• Produzem enzimas lignocelulolíticas
(lacases, Mn peroxidase e peroxidase
versátil) .

7. 7
1. Introdução
• Cultura em estado sólido;
• Possibilita a obtenção de elevadas
atividades de enzimas, incluindo enzimas
ligninolíticas;
• O crescimento do microrganismo pode
ocorrer na superfície ou em todo o
substrato;
• A escolha do substrato específico deve
está relacionado ao custo e viabilidade;
• O cultivo em substratos lignocelulósicos
fornece elementos à nutrição fungica.

8. 2. Objetivos
8
Neste trabalho foi proposto o uso de resíduos de laranja
como substrato para a obtenção de enzimas hidrolíticas e
oxidativas envolvidas na degradação de materiais
lignocelulósicos, como: lacase (EC 1.10.3.2), manganês
peroxidase (EC 1.11.1.14), xilanase (EC 3.2.1.8) e endo-1,4
glucanase (EC 3.2.1.4), por Pleurotus ostreatus cultivados
em estado sólido.

9. 3.1- Microorganismo
● Pleurotus ostreatus CCB2;
● Em laboratório, a espécie é mantida por repiques
periódicos em ágar batata dextrose (BDA);
● Placas totalmente colonizadas, com até 2 semanas de
idade;
● Discos com 10 mm de diâmetro;
3. Materiais e Métodos
9

10. 3.2 - Preparo dos resíduos de laranja
● Indústrias de suco da região de Maringá – PR;
● Secagem (estufa de ventilação forçada 35° C –
peso constante) e moagem;
● Após a Secagem: os resíduos foram triturados
em partículas com diâmetro médio de 4 mm;
10
3. Materiais e Métodos

11. 3.3 - Condições de cultivo
4g resíduo de laranja seco – (Erlenmeyer 250 mL);
Foi adicionado Solução mineral ao substrato –
(umidades iniciais variando de 50 a 90%);
Os meios foram esterilizados em autoclave por 15 min.
a 121 °C;
4 discos de 10 mm de diâmetro das culturas de P.
ostreatus em BDA foram assepticamente transferidos
para os frascos;
11
3. Materiais e Métodos

12. 3.3 - Condições de cultivo
As culturas foram mantidas em Temperaturas variáveis
(20 – 35°C até 30 dias) na presença/ausência de luz;
As culturas interrompidas a cada cinco dias;
As massas miceliais foram retiradas com auxílio de
uma espátula, lavadas com água destilada 2 vezes e
secas em estufa a 60 °C até peso constante para
determinação da biomassa.
12
3. Materiais e Métodos

13. 3.4 - Extração das enzimas
 Retirada da biomassa enzimas foram extraídas
adicionada 20 mL de água destilada substrato
culturas remanescentes;
 Mantidos a 8°C sob agitação/30min.;
 Materiais sólidos separados por filtração (gaze);
13
3. Materiais e Métodos

14. 3.4 - Extração das enzimas
 Filtrados foram centrifugados/10min;
 Os sobrenadantes límpidos foram utilizados
como fontes das enzimas.
14
3. Materiais e Métodos

15. 3.5 - Determinação das atividades enzimáticas
Lacase
- Substrato sirigaldazina
- Mistura:
1,5mL tampão fosfato (100 mM; pH 6,5)
0,2mL de sirigaldazina (0,5 mM em solução etanólica)
0,1mL de filtrado da cultura
Oxidação após 5min e a 30ºC absorve em 525nm
15
3. Materiais e Métodos

16. 3.5 - Determinação das atividades enzimáticas
• Manganês peroxidase
- Oxidação:
10mM MnSO4 (30ºC)
50mM malonato de sódio
Presença de 0,5 mM H2O2 e pH 4,5
 O íon mangânico forma complexo com o malonato,
o qual absorve 270nm 16
3. Materiais e Métodos

17. 3.5 - Determinação das atividades enzimáticas
• Xilanase, amilase, pectinase e endoglucanase
- Açúcares redutores
- Hidrólise dos substratos:
Xilano
Amido
Pectina
Carboximetilcelulose
• β-glicosidase e β-xilosidase
- substratos sintéticos:
p-nitrofenil-β-glicopiranosídeo
p-nitrofenil-β-xilopiranosídeo 17
3. Materiais e Métodos

18. 3.6 - Outros métodos analíticos
 Carboidratos solúveis totais
- Método fenol sulfúrico (glicose)
Açúcares redutores
- Método ácido 3,5 dinitrosalicílico (glicose)
18
3. Materiais e Métodos

19. 19
3.7- Análises estatísticas
• Teste ANOVA
• Teste Tukey (p<0,05)
3. Materiais e Métodos

20. Resultados e discussão
20

21. 4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e
na produção de enzimas por P. ostreatus
20 a 35 °C
nenhuma diferença
foi observada
no crescimento
do fungo
Fungo cresceu
melhor entre
25 e 30 °C
cultivos foram
mantidos a 28 °C
e no escuro
21

22. ● O desenvolvimento da biomassa fúngica foi
fortemente afetada pela umidade do substrato. Analises
visuais das culturas mostraram que o crescimento e
desenvolvimento foram mais precoces quando Ui >
75% .
● Umidade adequada:
Ui que permitiram completa colonização dos substratos
até o 10º dia de cultivo, a 28 º C.
22
4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e
na produção de enzimas por P. ostreatus

23. ● 75% < Ui < 80% da cultura
O fungo cresceu de forma homogênea nas partículas do
substrato sólido.
● Ui > 80%
O crescimento deu-se pela formação de uma massa micelial
espessa, acima do substrato. Tal massa micelial foi removida
do substrato residual, permitindo a determinação da
biomassa fúngica produzida.
23
4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e
na produção de enzimas por P. ostreatus

24. A produção de diversas enzimas oxidativas e
hidrolíticas por P. ostreatus foi determinada após
10 dias de cultivo em cinco umidades iniciais
distintas.
24
4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e
na produção de enzimas por P. ostreatus

25. Figura 1 - Efeito da umidade inicial na produção de enzimas
oxidativas por P. ostreatus cultivado em resíduo de laranja.
Os cultivos foram desenvolvidos a 28 °C por 10 dias
56,0 ± 4,3 U.g -1
6,50 ± 0,43 U.g -1
25

26. Figura 4.2 - Efeito da umidade inicial na produção enzimas
hidrolíticas por P. ostreatus cultivado em resíduo de
laranja. Os cultivos foram desenvolvidos a 28 °C por 10 dias
26

27. 27
4.2 - Produção de biomassa e enzimas em
cultivos com 85% de umidade inicial
A característica de crescimento micelial superficial em
substrato com umidade inicial de 85% possibilitou a
separação da biomassa do resíduo de laranja
remanescente.
Valores de umidade superiores a 80%, o fungo se
desenvolveu nas camadas mais superficiais do substrato.
Desta forma, tal cultivo é mais propriamente considerado
como cultura de superfície.
A concentração de biomassa fúngica na superfície das
culturas permitiu que as mesmas fossem separadas do
substrato, e o crescimento pode ser avaliado pela
determinação direta da biomassa fúngica produzida
(Figura 4.3).

28. .
28
Figura 4.3 - Produção de enzimas e crescimento de P.
ostreatus em cultivos utilizando resíduo de laranja com
umidade inicial de 85%.
75 U.g -1
6,8 U.g -1
(?)

29. Máxima biomassa fúngica foi obtida após 20 dias de
cultivo (90 ± 5,7 mg.g-1
de substrato seco), com um
valor médio de 74 ± 5,6 mg.g-1
de substrato seco.
O fungo utiliza os açúcares redutores como fonte de
carbono nos primeiros 5 dias. Após este período,
quantidade desses açúcares permanece constante
(hidrólise dos polissacarídeos no resíduo).
Máxima atividade de lacase (75 U.g-1
de substrato
seco) foi obtida após 15 dias de cultivo, já o máximo de
atividade Mn peroxidase (6,8 U.g-1
substrato seco) foi
alcançado no 30º dia de cultivo.
29
4.2 - Produção de biomassa e enzimas em
cultivos com 85% de umidade inicial

30. 30
4.2 - Produção de biomassa e enzimas em
cultivos com 85% de umidade inicial
A produção das enzimas xilanase e endoglucanase
pelo fungo, foi maior no 5º dia de cultivo, 0,65 ± 0,07
e 0,43 ± 0,05 U.mg-1
de substrato, respectivamente.
A produção de outras enzimas hidrolíticas, tais como:
amilase e pectinase, foi baixa (valores inferiores a
0,2 U.g-1
de substrato seco).
A redução na quantidade de carboidratos totais
solúveis nos meios de cultura (Figura 3), sugere que a
pectina esteja sendo degradada. Apesar dos resultados
não mostrarem uma efetiva produção de pectinases.

31. 31
O meio à base de resíduo de laranja
proporcionou a obtenção de elevadas atividades
de enzimas com grande potencial de uso
industrial, especialmente lacase e manganês
peroxidase.
4.2 - Produção de biomassa e enzimas em
cultivos com 85% de umidade inicial

32. 5. Considerações finais
Os resíduos de laranja gerados pela indústria de
sucos apresentam umidade superior a 80%;
O uso de resíduo de laranja serviu como um
substrato adequado para o cultivo de P. ostreatus e
produção das enzimas lacase e Mn peroxidase;
Altas atividades das enzimas foram produzidas em
períodos relativamente curtos;
Níveis mais altos da Mn peroxidase foram
detectados nos cultivos mais longos.
32

33. 6. Etapas futuras
Novos experimentos devem ser realizados para
verificar se uma maior produção poderia ser obtida
em cultivos com tempos de incubação superiores a
30 dias;
O aproveitamento dos resíduos de laranja com
umidade inicial alta e sem a necessidade de
secagem prévia, reduziriam ainda mais os custos de
produção destas importantes enzimas.
33

34. 7. Referências bibliográficas
Aproveitamento do resíduo de laranja para a
produção de enzimas
lignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr)
Ana Maria ALEXANDRINO, Haroldo Garcia de FARIA,
Cristina
Giatti Marques de SOUZA, Rosane Marina PERALTA
Revista Ciência e Tecnologia de Alimentos
Recebido para publicação em 1/8/2006
Aceito para publicação em 23/4/2007
Campinas, 27(2): 364-368, abr.-jun. 2007
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35. BRIGADA!
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