Entseiu mikrobiologikoa

ENTSEIU MIKROBIOLOGIKOAK Egitaraua

ANALISIA ETA KONTROLA

PROGRAMAZIOA

1. MIKROBIOLOGIA

 Mikrobiologiaren kontzeptua eta historia
 Izaki bizidunen sailkapena
 Zelulak: motak eta egitura
 Célula prokariotoa
 Birusak eta beste izaki ez-zelularrak
 Monera Erreinua
 Protista Erreinua

2. METABOLISMO MIKROBIANOA

 Mikroorganismoen metabolismoa: mantenu erreakzioak
 Biosintesia, polimerizazioa eta muntaketa
 Mkroorganismoen hazkuntza

3. MIKROBIOLOGIA APLIKATUA

 Mikroorganismoen baliagarritasuna
 Populazio mikrobianoa
 Mikroorganismoen controla
 Familia esanguratsuenak

4. PRAKTIKAK

 Zelulen behaketa
 Hazkuntza-inguruen prestaketa
 Laborategiko giroko mikroorganismoak
 Hazkuntza puruak lortzeko teknikak
 Mikroorganismo bizigarriak berreskuratzea
 Hazkuntza-inguru hautagarriak eta bereizgarriak prestaketa
 Bakterio-tindaketak
 Ezezagun morfologiko baten tindaketen bitarteko ezagutzea
 Mikroorganimoen zenbaketa
 Ingurumen baldintzen eragina bakterioen hazkundean
 Onddoen (lizunak eta legamiak) kultiboa
 Urokultiboa
 Koprokultiboa

Entseiu mikrobiologikoak 1



 Esne gordinaren azterketa mikrobiologikoa
 Uraren analisi mikrobiologikoa
 Elikagaien analisi mikrobiologikoa
 Antibiogramak




1. Unitatea: MIKROBIOLOGIAREN KONTZEPTU ETA HISTORIA

A. Definizioa: Mikrobiologia mikroorganismoak aztertzen dituen zientzia da. Beraz,

Biologiaren atala da.

Zer dira mikroorganismoak? Zentzu orokorrean, begiz ikustezinak diren
bizidunak. Objetu bat 0,1 mm bat baino txikiagoa bada, begiak ezin du kusi, eta 1 mm
izanda ere detaile gutxi igarri daiteke. Beraz, 1 mm edo gutxiago duten bizidunak
mikroorganismoak dira eta mikrobiologiaren eremuan sartzen dira.

Mikroorganismoak: animalia batzuk, protista, monera, alga asko, bakterioak eta
birusak dira.

Ondorio bezala, mikroskopioa behar beharrezkoa da bizidun hauek aztertzeko,
beraz mikrobiologiak ezinbestekoa du mikroskopia.

B. Mikrobiologiaren garapena.

1632-1723: Antony van Leeuwenhoek. (1. deskribapena) Testua 1

1664: Robert Hooke (zelula hitza 1. aldiz erabili)

1665: Francesco Redi, zizareak okelan. Testua 2

XVIII mendea: Lazzaro Spallanzani, infusioak, berotu eta itxi

XIX mendea: François Appert, elikagaiak kontserbatu. XIX mendearen
erdialdean, zientifiko batzuk konturatzen hasiak zieren erlazio kausala dagoela
mikroorganismoen garapena infusioetan eta infusio hauek jasastzen dituzten aldaketak;
hau da, mikroorganismoek aldaketa kimikoak sortzen dituzte infusioetan.

1861: Louis Pasteur (1822-1895), mikroorganismoak airean zeudela frogatu
zuen. Irudia 3

1870: John Tyndall, bakterioen faseak: tyndalizazioa.

1876: Robert Koch (1843-1910), mikroorganismo batek gaixotasun bat
(tuberkulosia).

1880: Ferdinand Cohn, endosporak.




1884: H.C. Gram-ek tindaketa teknika bat asmatu zuen. Gaur egun ere oraindik
erabiltzen dena. Teknika horri esker bakterioak bi taldetan sailkatzen dira:

Gram + eta Gram –

1920-1935: Bizidun guztion prozesu metabolikoak antzekoak dira, hau da
“biokimikaren batasuna”

1934: Mikroskopio elektronikoaren sorrerak mikroorganismoen barne
egituraren ezagupenean bultzada handia eman zuen. Ordurarte mikrobiologia aparteko
zientzia bezala hartzen bazen ere, aldi honetan gainontzeko zientzien garapenean
lagungarri bihurtu zen. Genetikan adibidez, ekarpen handiak eman ziren:

1944: Avery, McLeod eta McCarthy-k eraldaketa bakterianoa DNA-k eragiten
duela frogatu zuten

1953: Watson eta Crick, DNA-ren egitura eta molekula horren bikoizketa eta
funtzionamendua.

C. Mikroorganismoak eta prozesu kimikoak

Infusioetan gertatzen diren prozesu kimikoak bi motatakoak dira nagusiki:

 Ustelketa: Eraldaketa hauetan usain txarra duten gaiak sortzen dira, eta okela
gertatzen da proteinak deskonposatzerakoan
 Hartzidura: Prozesu honetan alkoholak edota azido organikoak sortzen dira
gluzidoak –landare eta fruituen osagai nagusiak- deskonposatzerakoan.

1837an hondakin hauek ikertu ziren eta bertan zelula biziak zeudela konturatu ziren
biologoak. Kimikariek, berriz elementu inorganikoak zirela pentsatzen zuten- Pasteurek
frogatu zuen hondakin hauek bizirik zirela, legamiak, hain zuzen.

1857-1876an Pasteurek hartzidura laktikoa eta alkoholikoa bereizi eta aztertu zituen.
Hartzidura mota bakoitzak gai kimiko eta mikroorganismo bereziak zituela ikusi zituen:

 Mikroorganismo batzuk aerobioak (oxigenoaren beharra) zirela eta beste
batzuk anaerobioak.
 Hartzidura arnasketa baino efizientzia energetiko txikiagoa zuela

Ingurumenaren mikrobiologiaren gurasoak ondoko bi hauek ditugu:

S. Winograsky (1856-1953) eta M. Beijerinch (1851-1931)




Mtaeria organikoa zoruan eraldaketak sortzen zituela behatu zuten eta egoera eta
baldintza desberdinetara egokitzen zirela konturatu ziren. Adibidez, materia organikoa
deskonposatzen zen lekuetan NO3-ak agertzen zirela konturatu ziren. Orduan, hondakin
urak NO3-tan aberatsak zirela ikusi zuten. Suposatu zuten mikroorganismoek NH4 NO3-
ra eraldatzen zutela. Hortik aurrera beste zenbait eraldaketa ikusi ziren, guztietan ziklo
biokimikoak parte hartzen dutelarik.

S2- --------------------- S

Fe2+ --------------------> Fe3+

H2 -------------------- H-

N2 ------------------- NH4

Ziklo biokimikoak.

D. Mikroorganismoak eta gaixotasunak

1793: Hunter-ek bi gizakiren arteko gaixotasun (gonorrea) kutsakorraren
transmisioa frogatu zuen.

1840: J.L. Schönlein-ek frogatu zuen gizakion larruaren zenbait gaixotasun
onddo batzuk sortzen zituztela

Semmelweis-ek “fiebre perperal” izeneko gaixotasuna ospitaleko
langileek transmititzen zietela ameei frogatu zuen.

Henle-k mikroorganismo konkretu bat eta gaixotasun konkretu baten
arteko erlazioa frogatzeko beharrezkoa zela mikroorganismoa isolatzea frogatu zuen.

1864: Lister-ek kirurgia antiseptikoa aurrera eramateko prozedurak prestatu
zituen eta hasiera batean harrera oso ona ez bazuten izan ere, denboraz emaitzek lortu
zituen euren onarpena. Euskarri teorikorik gabe bazen ere, prozedura hauek nahiko
froga ez-zuzenak eman zizkioten “zenbait gaixotasun mikroorganismoek sortzen zutela”
zioen teoriari.

1876: Robert Koch-ek karbunkoa bakterio batzuk sortzen zutela frogatu zuen.
Erakutsi zuen osasuntsu ziren arratoiak kutsatzen zirela gaixorik zeudenen odola hartuz
gero. Ondoren, bakterioak hazi zituen, eta hazkundea behatzen orduz ordu, ikusi zuen
baziloak zuntz luze bihurtzen zirela. Euren barruan gorputz obalatu eta errefringenteak
agertzen ziren eta hauek beste inguru batetara pasatuz gero zuntzak berriro agertzen
zirela.




Koch-ek egindako esperientziak bat zetozen Henl-k proposaturiko irizpideekin,
erlazioa lortzeko mikroorganismo eta gaixotasunaren artean. Irizpideak hauek dira
(Koch-en postulatuak):

 Mikroorganismoak gaixorik dauden indibiduoengan agertu behar du beti eta ez
ondo dauden indibiduoengan.
 Mikroorganismoa gaixoarengandik lortu eta isolatu behar da hazkuntza puruan.
 Gaixotasuna agertu behar da garbia den hazkuntza batetik lortutako
mikroorganismoa sartzen denean ostalari gaitzikor eta osasuntsu batean.
 Mikrrorganismoa berriro isolatu behar da esperimentuen bitartez kutsaturiko
gaixoarengandik

Koch lehena izan zenez irizpide hauek praktketan jartzen gaur egun Koch-en
postulatuak deitzen ditugu. Irudia 4

Urte batzuk pasatuta Pasteur eta Joubert karbunko aztertzari ekin zioten, Kochen
lanen berri izan gabe, eta antzeko emaitzak lortu zituzten. Ezer berri ez bazuten gehitu
ere, Kochen lanak baieztatu zituzten eta zenbait froga gehitu zituzten erakusteko bazilo
hori eta ez besterik karbunkoaren kausa zela.

Hurrengo urteetan, Pariseko eta Berlingo institutuak munduko antzindariak
bihurtu ziren. Alemaniako eskolak, Kochen zuzendaritzapean, gizakiaren gaixotasun
kutsakor garrantzitsuen eragileen isolaketa, kultibo eta ezagupena aztertzeko erabil zuen
denbora eta bitartekoak. Frantsesek, beriz, Pasteuren zuzendaritzapean, arazo latzagoari
heldu zion: nola gertzen da gaixotasuna animaliaren gorputzean eta nola izaten da
osaketa eta nola lortzen du inmunitatea.

25 urtetan, gizakion gaixotasun garrantzitsuen eragileak aurkitu eta ezagutu
zituzten eta, beste aldetik, gaixotasunei aurre egiteko metodoak garatu ere.

1892: D. Iwanowsky-k, bakterio baino xikiagoak ziren eragile infekziosoak
aurkitu zituen, birusak. Ez zekien zer ziren, baina argi zegoen bizidun talde berezia
osatzen zutela, guztiz desberdina bai egitura bai garatzeko era ordurarte ezagutzen
zituzten izaki zelularrak




Irakurgaiak eta irudiak

1. Irakurgaia




2. Irakurgaia




Irudia 3




4. Irakurgaia




mente la madre la que cuenta como primer autor. También, todo lo que alcanza a la mujer -infec-
ci6n, intoxicación, desórdenes nerviosos- tiene el riesgo de que se continúe a través de la descendencia, mucho más
que en el caso del hombre. De lo que le resultan a la mujer responsabilidades y deberes par- ticulares hacia sí misma,
hacia su propia integridad.
En cambio, y por la misma razón, la sociedad tendrá hacia la mujer deberes de protección, de sal- vaguardia y
vigilancia.
Si es verdad -como decfa Ju1liot de La Moran- diere- que la evolución del papel jurídico de la mujer encuentra tal
vez una explicación en el progreso de la biología, está permitido esperar que esta evolución no haya llegado a su
término. Sin ir hasta reivindicar para la mujer una primacía que respondería a su prevalencia biológica, estimamos
que una igualdad en todos los campos es lo menos que se le debe.
La verdad biológica ya ha servido a la causa del sexo femenino; debe servirle todavía.


2. Unitatea: IZAKI BIZIDUNEN SAILKAPENA

A. Sarrera

Izaki bizidun guztiek hiru ezaugarri komun dituzte:

 Konposizio berdina
 Metabolismo desberdinan izan arren, helburuak berdinak dituzte:
i. Materia konplexuak (makromolekulak) sintetizatzea (proteinak,
DNA,...)
ii. Energia lortzea
 Oinarrizko egitura finkoa: organismo guztiak zelulez osatuta daude

Hiru ezaugarri hauen salbuespena birusak dira, zelularik ez dituztelako. Bestalde,
izaki bizidunak hiru taldetan bana daitezke: izaki zelulabakarrak, zelulanitzak eta
egitura zenozitikoak

B. Antolaketa maila
 Izaki zelulabakarra: Izaki mikroskopikoak, bakterio gehienak, zenbait alga
eta onddo

 Izaki zelulanitzak:
o Bereizketa gabekoa:
 Zelula gutxi dituzte
 Zelula guztiak berdinak dira
 Koloniak osatzen dituzte
 Onddo eta alga batzuk
o Berezitakoak:
 Zelula askoz osaturik
 Zelula desberdinak
 Zelulak taldeka elkartuta, ehunak osatzen dituzte eta hauek
organoak eta hauek aparatuak
 Egitura zenozitikoa: Organismoa ez dago zelulaz osaturik. Mugarik gabeko
masa da. Zelula baten erdibiketatik sortzen da. Erdibiketa nuklearra egoten
da, baina ez da ehunik sortzen. Talde garrantzitsuenak mixomizetoak (onddo
batzuk) dira.

C. Izaki bizidunen sailkapenerako irizpideak

Aristotelen denboretan izaki bizidunak bi erreinutan banatzen ziren: Animalia eta
landare erreinuak. Bi erreinuak elkarren artean oso desberdinak ziren, batzuk
energia lortzeko materia organikoa eta besteek materia inorganikoa erabiltzen zuten;
batzuen mugimendua eta besteen mugimendu eza; klorofila izatea ala ez; karbono
iturri desberdina izatea,...

XVIII-XIX. mende haseran animalikuluen (mikroorganismoak) aurkikuntzarekin
batera beste sailkapen bat egitera bultzatu zuten. Mikroorganismo asko animalia
(protozoo) eta landare erreinutan sartu zituzten.



Baina mikroorganismo gehiago ezagutzearekin batera beste sailkapen batzuk egin
zituzten:

 Flagelatu fotosintetikoak
o Fotosintesia
o Mugimendua
 Onddo mukiduna
o Onddoak
o Mugimendua Taula 1

Esfuerzo final (hacia 1860) para asignar los microorgasnismos a los reinos vegetal o
animal

Vegetales Grupos discutidos Animales

Pequeños metazoos
 Roíferos
 Nematodos
(algunos)
 Artrópodos
(algunos)
Algas (fotosintéticas) Protozoos
Formas inmóviles Flagelados fotosintéticos Flagelados no fotosin.
Hongos (no fotosintéticos) Hongos mucosos Protozoos ameboides
Bacterias

1866an Haeckel-ek hiru erreinutako sailkapena proposatu zuen, hirugarren erreinuan
protista izeneko mikroorganismoak sartzen zituelarik. Bereiztu gabeko zelulaz
osatutako mikroorganismo zelulanitz eta zelula bakarrak sartu zituen.

Taula 2

Grupos que componen los tres reinos de organismos propuestos por Haeckel (1866)

Propiedades Vegetales Animales
Multicelulares; diferenciación profunda Plantas con semillas Vertebrados
de las células y tejidos
Helechos Invertebrados

Musgos y hepáticas
Protistas
Unicelulares, cenocíticos, o Algas, Protozoos, Hongos y bacterias
multicelulares; estos últimos con poca o
ninguna diferenciación de células y
tejidos

D. Izaki bizdunen taldeen ezaugarriak
 Monera erreinua. Organismo prokariotoak dira soilik, beraz, antolaketa
zelular prokariotoa duten zelulabakarrak dira denak. Nutrizio mota guztiak




dituzte, asexualki ugaltzen dira, nahiz eta, material genetikoaren truke soilak
bezalako sexualitate-modu oso primitibo batzuk agertu. Bakterioak,
zianofizeoak eta mikoplasmak sartzen dira bertan.

 Protista erreinua. Organismo zelulabakar eukariotoak dira eta ehun
antolaketarik ez duten izaki kolonialez osatuta dago; landareetatik eta
animalietatik bereizten dira garapenik ez dutelako, ezta ehunik ere, eta
onddoetatik, berriz, beren bizitzako etaparen batean zilioak eta flageloak
dituztelako. Erreinu honetan protozooak, beste organismo urtar, eta nahiko
ezezagunak diren parasito batzuk eta algak sartzen dira.

 Onddoen erreinua (Fungi). Organismo eukariotoak dira, esporaz ugaltzen
dira, ez dute garapen enbrionariorik, beren bizi-zikloaren etapa guztietan ez
dute ziliorik ezta flagelorik ere eta denek nutrizio heterotrofoa dute.
Legamiak bezalako onddo zelulabakarrak eta lizuna eta perretxikoak
bezalako onddo zelulanitzak biltzen ditu, baita likenak ere.

 Animalia erreinua (Metazooak). Organismo zelulanitz eukariotikoak dira,
nutrizio heterotrofoa dute, ugalketa sexuala eta ondoren garapen
enbrionarioa; garapen horretan zehar blastula izeneko egoera bat izaten da
beti. Erreinu honetan eskuarki animali zelulanitz bezala kontsideratuak izan
diren organismoak sartzen dira.

 Plantae erreinua (Metafitoak). Organismo zelulanitz eukariotoak dira,
nutrizio autotrofo fotosintetikoa dute, ugalketa sexuala eta garapen
enbrionario bakuna (ez da blastula egoerara iristen). Belaunaldi alternantzia
izan ohi da bi ugalketa-motekin. Goroldioak, iratzeak, gimnospermoak
(haziak agerian) eta angiospermoak (haziak estalita – loreak) biltzen ditu.

3. Unitatea: ZELULAK: MOTAK ETA EGITURAK




1. Sarrera

Izaki bizdunok osatzen gaituen egiturarik txikiena zein den jakiteak jakinmina
eragin du historian zehar. Antzinako Grezian hasi ziren arazoei erantzuna emateko
teoriak pentsatzen. XVII. Mendera arte oso gutxi aurreratu zuten, proposatutako
hipotesiak frogatzeko baliabiderik ez zutelako.

1950. urtean Zacahry eta Francis Janseen-ek lehen mikroskopio konposatua asmatu
zuten, tutu batean bi lente ganbil jarrita. Handik urte batzuetara, Robert Hooke-k
(1635-1703) mikroskopio konposatua erabiliz, kortxozko xafla mehe batzuk behatu
zituen 1665. urtean, eta ikusitakoa deskribatzerakoan hitz ezin egokiagoak erabili
zituen:

“...argi eta garbi ikusi ahal izan dut xafla zulatuta dagoela erabat, poroz beteta
dagoela, abaraska baten antzera. Poro edo zelula horiek ez dira batere sakonak,
baina ugariak bai, oso ugariak dira...”

Hooke izan zen egitura biologiko bat deskribatzeko zelula hitza erabili zuen lehena.

Garai hartan, mikroskopiogileak ziren objetu txikiak behatzen ibiltzen zirenak.
Antony van Leeuwenhoek-ek (1632-1723) adibidez, mikroskopi bakun eta garatu
gabeak, baina bereizmen handikoak erabiliz, makina bat mikroorganismo aurkitu
zituen: infusorioak, algak, onddoak, bakterioak, etab. Malpighi-k (1628-1694) ere
hamaika behaketa desberdin egin zituen, kapilarrak, intsektuak, landareak, etab.

Brisseau de Mirbel eta Jean Baptiste de Lamarck-ek 1809. urtean eta Henri
Dutrochet-ek 1837an, izaki bizidunok zelulaz eratuta geundela esan zuten, eta zelula
horiek bizi-funtzio independienteak zituztela.

Urte haietan, 1831 inguruan, Robert Brown-ek egindako ikeerketen ondorioz, beste
ororkortze nagusi batera iritsi ziren, zelulen barruan nukleoa dagoela aurkitu
baitzuten.

Teoria zelularra finkatzeko bidea, beraz, eginda zegoen, berandu baino lehen
etorriko zena bi biologi alemanen –Matthias Jakob Schleiden (1804-1881) eta
Theodor Schwann (1810-1882) biologoen – lanaren ondorioz. Schleidenek
landareen zelularen jatorriari buruzko lana argitaratu zuen 1838. urtean eta nukleoak
zelularen garapenaren duen zereginari buruzko hipotesia plazaratu zuen. Schawnn
bere aldetik, animaliak aztertu zituen. Berak egindako behaketak eta Schleindenek
egin zizkion oharrak kontuan hartuta “izaki bizidun guztien oinarrizko zatiak zelulaz
osatuta daude” esan zuen 1839. urtean.

Schleinden eta Schwannek emandako oinarrizko ideia hori da, hain zuzen, teoria
zelularra gauzatu zuena:




“Animaliak nahiz landareak, independienteki, baina aldi berean batera
funtzinatzen duten zelulez eratuta daude”.

Zelularen jatorriari buruzko teoria zuzenak agertzeko mikroskopioak hobetu eta
tindaketa-metodoetan aurreratu ahala, zatiketa zelulararen nondik norakoaren berri
izaten hasi ziren. R. Virchow 1855. urtean “omnis cellula ex cellula” esan zuen.

Gaur egun egia unibertsaltzat dugun teoria zelularrak denbora luzea behar izan zuen
zientifikoen artean onartua izateko.

Walter Flemming-ek zelularen zatiketa-prozesuak ikusi zituen 1879. urtean.
Kromosomen kopurua beti berdina dela aurreratu zuen eta zelularen zatiketaz hitz
egiteko mitosi hitza erabiltzen hasi zen. Handik urte gutxi batzuetara animali eta
landare-zelulen meiosia beste batzuek deskribatu zuten.

1880-1900 urtealdian mikroskopio optikoz ikus zitezkeen organulurik gehienak
ikusi zituzten; izan ere, orduantxe hasi baitziren teknikak berriak erabiltzen:
tindaketa, ebakidurak, etab. Garai horretan ere, Ramon y Cajal-ek neuronari buruzko
teoria plazaratu zuen eta ondorioz, teoria zelularra ehun guztietara zabaldu zen.

XX. mendeanren haseran zelularen funtzionamendu ikertzeari ekin zioten. 1930-
1940. hamarkadatik aurrera aurrerapauso handia egin zuten zelularen ezagutzan,
tresna berri baten erabilerari esker: mikroskopio elektronikoa. Egitura zelularra
ezezik ultraegitura ere ikus zitekeen, hau da, organulu zelularren xehetasun guztiak.

Mendearen erdialdean zelularen azterketa biokimikoek eurenganatu zituzten eta
gaur egun prozesu zelular guztiak ezagutzen ditugu.

Egitura zelularrari buruzko ezagutzaren kronologia

Aurrerapen teknikoa Urtea Ideien aurrerapena




Mikroskopio konposatua 1590
1665 Hook-ek zelula deskribatu
1670 Espermatozoideak deskribatzeko
animalkulu hitza erabili
Malpighi eta Leeuwwenhoek-en 1680
lanak
Mikroskopio bidezko behaketa 1750 Zuntz-teoria
Nukleoa ikustea 1760
Dolland-ek lente akromatikoak 1780 Besikula-teoria
asmatu
1827 Teoria zelularraren aitzindari
izango diren lehen ideiak
Lehen mikroskopio konposatu 1833 Brown-ek nukleoa deskribatu
akromatikoa
1838
1839 Schawnn eta Schleiden-ek
teoriazelularra formulatu
1840 Purkinje-k proptoplasma terminoa
erabiltzen hasi
Abbe-k mikroskopioari zenbait 1855 Virchow-ek zelula oro beste zelula
hobekuntza batetik datorrela esan
1879 Flemming-ek mitosia deskribatu
Teknika mikroskopikoen 1880 Plastoak, mitokondriak eta Golgi-
aurrerakada handia ren aparatua deskribatu
Zeiss-ek lente berriak asmatu 1900 Sutton-ek gen-kromosoma
Lehen mikroskopio elektronikoa 1931 harremana ezarri
Fase-kontaste bidezko 1933 Organulu berriak deskribatu
mikroskopioa Organulu desberdinen funtzioa
Teknika berrien garapena: 1955
zentrifugazioa, zitokimika,...
“Microscopio electrónico de 1965 Mintz plasmatikoaren eredua
barrido”
Kriohausturako mikroskopio 1979
elektronikoa
Teknika berriak..... 1980 Organuluen ultraegitura
1990




ZELULA EUKARIOTA:

a.- Organuloak:

Eukariotak diren zeluletan DNA mintzez inguraturik dago, nukleoa eratuz. Zitoplasma
organulo zelular desberdinetan oso aberatsa eta ugaria da. Era honetako antolaketa
ondorengo erreinuetan agertzen zaigu: Protista, Fungi, Landare eta Animalia.

Argazkiak konparatu
Ondorengo irudiak kontutan hartuz erantzun itzazu ondoko galderak:

A B

1.- Zein da handiena?

2.- Zein da konplexuena?

3.- Zeinek dauka nukleoa?

4.- Zein da zelulabakarra?

5.- Zer organismo izan daiteke A argazkikoa?
 Bakterioa
 Beste izakiren bat

6.- Zer organismo izan daiteke B argazkikoa?
 Bakterioa
 Beste organismoren bat

Zelula eukariotak bizi forma eta mota (landare eta animalia) guztietan komunak diren
organuloak dituzte:




Animalia eta Landare zeluletan agertzen diren organuloak

Organuloa Irudia Funtzioa

Proteina eta fosfolipidoz osaturiko geruza da. Kanpo eta
Mintz Plasmatikoa barne inguruak bereizten ditu eta elkartrukeak kontrolatu
egiten ditu.

Zelularen barne medioa da. Bertan, metabolismo
Zitoplasma
zelularra eta molekulen mugimendua burutzen da.

Mintzez inguraturiko zonaldea nukleoplasma eta DNAz
Nukleoa
osaturik nagusiki.

DNA Kondentsatutako DNA zuntzak dira. Informazio
(Kromosoma) genetikoa biltzen dute.

Arnasketa zelularra egiten dute. Materia organikoa
Mitokondria
ATPan bilakatzen dute (energia)




Erribosoma Proteinak sintetizatzen dituzte (itzulpena).

Erribosometan sortutako proteinak garraiatu eta bildu
Erretikulu
egiten dute. Baita ere, lipidoak sintetizatzen ditu, eta,
endoplasmatikoa
mintz nuklearra eratzen dute.

Erretikulu endoplasmatikotik jasotako proteinak bildu eta
Golgi aparatua sailkatu egiten ditu. Pareta zelularra eratzen du.
Lisosomak sortzen ditu.

Golgi eta Erretikuloan jatorria duten eta sustantzia
Besikulak
biltzen dituzten esfera txikiak dira

Digeri entzimak biltzen dituzten mintzez inguraturiko
Lisosomak
esfera txikiak. Eurei esker elikagaiak digeritu egiten dira.

Landare zelulari babesa, euskarria eta egitura
Pareta Zelularra mantentzen laguntzen dio. Zelulosaz osaturiko mintzez
egina dago.

Fotosintesia egiten duen organuloa: materia inorganikoa
Kloroplastoa
materia organikoan bilakatzen da.




Zilioa eta flageloak eratzen dituzten mikrotubulo
Zentrioloak zilindrikoen multzoa. Animali zeluletan zatiketa
zelularrean parte hartzen du.

Amiloplastoak Fotosintesia sortutako almidoia biltzen duen organuloa.

Zilioak eta
Mugimendu zelularra eragiten duten organuloak dira.
Flageloak

Bakuolak
Erreserba sustantziak edo hondakinak biltzen ditu.

Forma Animalietan aldakorra eta landareetan prismatikoa.

b.- Animali eta landare zelula:




Aurrekoaren laburpen gisa zera esan dezakegu: Landare zelulak erregularragoa eta
prismatikoagoa den forma erakusten duela, animali zelulak oso aldakorrak diren formak
agertzen duten neurrian. Organuloak ere desberdinak dira: landareak kloroplastoak, pareta
zelularra, amiloplastoak eta zitoplasmaren bolumenaren gehiena okupatzen duen bakuola
handi bat dute. Animali zelulak aurreko organulorik ez du eta bai ordea zentrioloak eta
lisosomak.

PRAKTIKETAKO PROGRAMA




Segurtasun neurriak mikrobiologiako laborategian araudia

PRAKTIKAK

 Kultibo-medioen prestaketa
 Mikroorganismoen ereinketa eta kultiboa
 Mikroorganismoak ingurugiroan
 Mikroorganismoen isolaketa eta identifikazioa lagin batetatik
 Mikroorganismoen behaketa

MIKROBIOLOGIA LABORATEGIAN JARRAITU

BEHARREZKO ARAU OROKORRAK




1. Liburu, poltsa eta arropa guztia lan-eremutik at egon behar dute. Lan-eremuan, lanerako
beharrezkoak diren gauzak soilik egon daitezke (koadernoak, protokoloak, lanerako
tresnak), eta ahal bezain garbi, ordenatu eta huts mantenu behar da lan-eremua.

2. Bata eraman beharra dago, era hortan gu eta gure arropak babestuko baititugu (bai
kontaminazioa eta bai koloratzaile eta substantzia kimikoen ekintza). Ez irten laborategitik
laborategiko batarekin (kafea hartzera, hitzegitera, klasera...).

3. Laborategian jatea (txiklea mastekatzea barne), edatea edo erretzea debekatuta dago.
Ekiditu eskuak zein beste edozein objektu ahoratzea. Ez haginka egin boligrafoari. Ez ikutu
aurpegia, begiak etabar.

4. Ezer egin baino lehen, protokoloa irakurri. Zer egin behar den eta nola egin behar den
aurrez jakiteak istripuak gutxitzen ditu eta denbora hobeto erabiltzea baimentzen du.

5. Praktika egun bakoitzaren hasieran azalpen labur bat emango da. Ez hasi lanean
azalpenak eta protokoloa irakurri baino lehen. Metodoa edo esperimentuaren helburua
ulertzen ez duzunean, galdetu irakasleari.

6. Praktika hazterakoan desinfektatu lan-eremua desinfetatzailearekin (desinfektatzailea
paperezko toaila batekin zabaldu mahai gainean eta lehortzen utzi). Prozedura bera
errepikatu lana amaitutakoan. Praktika amaitzean mahaia txukundu.

7. Erabilitako gauza guztiak izen, talde, data eta experimentuarekin errotulatu, era hortan
materilaren erabilera ez-zuzena ekidituko baitugu.

8. Lanean zehar, kontaminazioak erraz ditzaketen aire korrenteak ekiditu . Saio-hodi
esterilak edo kultibodunak gradilatan bertikalki mantendu behar dira. Sekula ez mahai
gainean etzanda.

9. Praktiketan egindakoaren ohar guztiak laborategiko koadernoan idatzi.

10.Kontuz metxeroekin , batez ere metxeroaren bestaldean dagoen zerbait hartu nahi




denean. Istripuak ekiditzeko, itzali metxeroak beharez direnean.

11.Kontaminatutako materiale guztia eta erabiliko ez diren kultibo guztiak garbitu edo
bota baino lehen, esterilizatu beharra dago. Esterilizatu beharreko materialea ontzi egokietan
utzi. Pipetak, portak eta kubreak mahaietan dauden lixibiadun untxietara botako dira.

12.Paperak, poxpoloak eta beste material ez kutsagarriak sakar-ontzira botako dira. Inoiz ere
ez, harraskara.

13.Laborategitik atera baino lehen, bai aldi batez edo behin-betiko, eskuak xaboi
germizidaz garbitu behar dira.

14. Edozein istripu edo arazoren aurrean (ebaketak, erredurak, kultiboen isurketak...),
irakasleari jakinarazi berehala dagokion neurriak har daitezen.

KULTIBO MEDIOEN PRESTAKETA

Kultibo-medioak: laborategian mikroorganismoak hazteko erabili daiteken edozein
sustantzia (solido edo likidoa) da;

Kultibo medioaren konposaketan sustratu natural bat (odol plasma edo esnea adibidez)
edota gatz eta sustantzia kimikoen kontzentrazio ezagunak parte har dezakete.
Jatorriaren arabera kultibo-medioak talde desberdinetan sailka daitezke:

Konplexua: honen konposaketan liseritutako konposatuak, landare edo animali
ehunen estraktuak, kaseina... auki daitezke. Mikroorganismoak hazteko
beharrezko dituzten elementu guztiak egongo dira, nahiz eta konposaketa eta
kontzentrazio zehatzak ez ezagutu.
Definitua : kontzentrazio ezagunean aurkitzen diren sustantzia kimiko puruez
osatutako kultibo medioa. Hazkuntzarako beharrezko diren konposatu guztiak
egongo dira, hauek desberdinak izan daitezkeelarik mikroorganismoaren behar




nutrizional konkretuen arabera. Guztiek eskeintzen dute ura, energi iturria
(adibidez karbohidratoak eta gatz ezorganikoak), konposatu nitrogenatuak eta
hazkuntzarako beste faktore batzuk.

Kultibo medioa solidoa bada, solidifikatzaile bezala agarra erabiltzen da (nahiz eta beste
batzuk ere erabil daitezken agarra ez denean egokia, adibidez, mikroorganismoak agarra
erabiltzeko ahalmena duenean).

Ezin formula daieteke mikroorganismo guztien hazkuntza baimen dezakeen kultibo-
medioa. Hala ere, Mueller-Hinton agarra bezalako kultibo medio konplexuetan bakterio
askok hazteko gaitasuna dute eta horregatik sarritan erabiltzen dira.

Mikroorganismoen isolaketa eta identifikaziorako kultibo-medio hautakorrak edota
bereizgarriak erabiltzen dira.

Medio hautakorren konposaketan parte hartzen duten konposaturen bat edo gehiago
zenbait mikroorganismoren hazkuntza inhibitzeko ahalmena izango dute, eta ondorioz,
mikroorganismo edo mikroorganismo-talde konkretuen hazkuntza soilik gertatuko da.
Hauen artean ditugu: MacConkey agarra, Manitol agarra eta beste asko.

Kultibo-medioetan hazi ondoren mikroorganismoen itxuraren arabera (kolonien
tamaina, kolorea, distira, ertzaren izaera...) espezie ezberdinak daudela antzeman
dezakegu. Hala ere, mikroorganismo askok kolonia desberdinezinak ematen dituzte.
Kultibo-medio bereizgarrietan ordea, nahiz eta koloniaren itxura berdintzua izan,
kolonien arteko bereizketa lortuko dugu. Medio bereizgarri hauetan, hazkuntzan zehar,
erreakzioren batek koloniaren kolorea edo beste ezaugarriren bat aldaerazi dezake
erreakzio positiboa eta negatiboa duten koloniak bereiztuko ditugularik.

Kultibo-medio solidoen prestaketa

Medio deshidratu batetatik abiatuz prozedura orokora honako hau litzateke:

 Medio deshidratatua pisatu




 Ur destilatua gehitu
 Nahasketa irakin
 Autoklabatu
 Hontzietan banadu

Agarra duen kultibo-medioa Petri kutxatiletan prestatu nahi badugu, prosedura
aipaturikoa litzateke. Medioa saiodietan nahi dugunean, nahasketa irakin eta
autoklabatu baino lehen saiodietan banaduko dugu.

Agarra ez duten medioek normalki ez dute irekin beharrrik.

Laborategiko balantza arrunta Irabiagailu magnetikoa duen plaka

Kultibo-medioaren pH-a finkatzeko,




batzutan pHmetroa erabili beharko dugu. Kultibo medio solidoak prestatzeko medioa
saiodiaren barruan dagoela esterilizatzen da
autoklabean, eta ondoren erdi etzanda
solidifikatu arte utziko dugu. Era hortan
ereintza-azalera handiagoa izango da.

MIKROORGANISMOEN EREINKETA ETA
KULTIBOA

Laborategian mikroorganismo baten azterketarako, beharrezkoa
izaten da gehienetan mikroorganismoa kopuru handitan lortzea, hau
da, mikroorganismoaren hazkuntza kultibo-medioan lortzea. Behin
kultibo-medio egokia aukeratu ondoren, mikroorganismoa bertan
ereingo dugu. Honetarako, inokulazioa egiten denean, teknika
aseptikoa erabili behar da, era hortan kutsadurak ekidingo direlarik.
Erabili beharreko tresna guztiak aldez aurretik esterilizatu egin behar
dira eta prozesu osoa suaren ondoan egin behar da.
Mikroorganismoen transferentzia ereintza-euskarri bati loturiko
platino edo kromo-nikelezko alanbre batekin egin daiteke. Alanbre Kutsadura ekiditzeko maiz fluxu
laminarreko
honek diametro txikiko kiribila izango du muturrean. Ereinketa kanpaietan egiten da lana.
ziztadaren bidez egiten bada, ordea, kiribilik ez da egongo eta
ereintz-euskarriaren alanbrea zuzena izango da.




Ereinketa

Ereinketa saiodietan edo Petri kutxatiletan egin daiteke. Saiodien kasuan kultibo-medio solido edo
likidoa erabil daiteke. Solidoa deneko kasuan, lortu nahi dugun helburuaren arabera, ziztadaren bidezko
ereinketa edo azalekoa erabiliko da. Azken kasu honetan agar inklinatua duten saiodiak erabiltzen dira.

.

Ereintza-euskarria suaren gainean ia bertikalki jarri
behar da gori-gori jarri arte. Honela euskarriaren luzera
osoa esterilizaturik geratuko da.

Esterilitate baldintzak ez galtzeko beti suaren ondoan
egin beharko dugu lan.

Saiodi batean mikroorganismoen kultiboa izango dugu,
hau ezkerreko eskuarekin hartu, eskubiko eskuko
atzamar txikiarekin tapoia kendu eta suaren ondoan
mantendu behar da.

Saiodiaren ahoa suaren gainetik pasatu, esterilizatutako
ereintza-euskarria saiodian sartu eta segundu batzuz,
beirarekin kontaktuan dagoela, hozten utziko da.

Behin hotzituta, inokuloa hartuko dugu, euskarria
saioditik etara eta berriro ere saiodiaren ahoa sutatik




pasatu eta itxi egingo dugu.

.

Inokulatu nahi dugun saiodia hartu, ireki, ahoa sutatik
pasatu eta zelulak dituen ereintza-euskarria saiodiaren
hondoraino sartu behar da. Ondoren, euskarria
ateratzen gaudenean zigi-zaga egingo dugu kultibo-
medioaren azalean.

Amaitzeko, hodiaren ahoa sutatik pasatu eta tapatu
egingo dugu.

Ereintza-euskarria ere sutatik pasatu behar da bertan
dauden mikroorganismoak hiltzeko

Ereinketa Petri kutxatilan egitean pausu berdinak jarraitu behar dira. Kutxatilak suaren ondoan ireki
beharko dira esterilitatea mantentzeko. Kultibo-medioa likidoa denean inokuloa (euskarrian dauden
zelulak) medioan murgildu beharko da.

Ereinketa egiteko beste modu batzuk:

1. Ziztadaren bidezko ereinketa. Zenbait teknika diagnostikotan erabiltzen da. Eukarriaren alanbrea
zuzena izango da eta medioa ziztatzeko erabiliko da.




Ereintza-euskarri arrunta eta ziztadaren teknikan erabiltzen dena;
lehenak kiribil bat du puntan, eta bigarrenean alanbrea zuzena da

2. Kutxatiletan ildoango ereinketa. Kultibo-medio likido zein solido batetatik abiatuz inokuloa
euskarrirekin hartu eta Petri kutxatilak zigi-ziga eginez inokulatuko ditugu.

Ereinketa egiterakoan ereintza-euskarriarekin zigi-zaga mugimenduak egiteko euskarria
ahal bezain horizontalen erabiliko dugu, era hortan agarraren apurketa gutxitu egingo baita.

Ereinketa hontatik abiatuz murrizketa bidezko ereinketa egin daiteke. Kasu hontan asmoa kolonia
isolatuak lortzea litzateke.

Murrizketa bidezko ereinketa:

1. Inokuloa ildoango ereinketaren bidez kutxatilaren albo batetan erein
(marra gorriak). Ondoren euskarria esterilizatu.

2. Euskarri esterilarekin ildoango teknikaren bidez marra urdinak egin.
Asmoa marra gorrietako microorganismo batzuk (marra urdinekin
ikustzen ditugunak) azalera handiago batetan sakabanatzea da.

3. Prozedura berdina jarraituz marra laranjak eta urdin argiak egin




(euskarria esterilizatu marra berriak egin baino lehen).

4. Kutxatila tenperatura egokian inkubatu hondoren hazkuntza
gertatuko da eta kolonia isolatuak garatuko dira.

3. Hedadura bidezko ereinketa. Kasu hontan mikroorganismoak likidoan suspendituta egongo dira eta
Petri kutxatilen gainazal osoa inokulatuko dugu likido horrekin. Pipeta esterilak erabili behar dira, hauen
bidez, mikroorganismoak dituen likidoaren bolumen jakina (0.1-0.2ml) hartu ahal izateko. Hartutako
bolumena kutxatilako agarraren gainean kokatuko dugu. Inokulua beirazko euskarri batekin heda daiteke
(Digradsky euskarriarekin). Beirazko euskarria esterilizatzeko alkoholarekin buzti eta euskarria
sugarretik igaroko dugu alkohola erre dadin (esterilitatea ziurtatzeko hiru aldiz erreko dugu). Ereinketa
metodo honek lagineko mikroorganismo bizien kopurua ezagutzeko balio du (kolonia formatzaileen
unitateak edo ufc).

4. Sakonerako ereinketa. Laginaren bolumen jakin bat (mililitro bat adibidez) agarra duen eta baina
solidifikatu gabeko kultibo-medioarekin (demagun 15 mililitro) nahastuko dugu (agar duen kultibo-
medioa autoklabean esterilizatu ondoren tenperatura hortan likido egoeran aurkituko dugu. Tenperatura
jeistean agarra solidifikatu egingo da). Nahasketa irabiatu eta Petri kutxatila esteriletara botako dugu.
Ondoren mahai gainean zortzi itsurako mugimenduak egingo ditugu apur batez (nahastu eta kutxatila
osoan heda dadin). Agarra solidifikatzean mikroorganismoak agarraren barruan hasi eta kolonien
kontaketa egin ahal izango da.

5. Suspentsioaren bidezko ereinketa, ingurune likido batetik beste ingurune likido batetara.




Inkubazioa

Kultiboak, aztertzen ari garen mikroorganismoaren tenperatura optimoan inkubatu behar dira hazkuntza
egokia lortu ahal izateko. Petri kutxatilak inkubatzean alderantzizko posizioan jarri behar dira, horrela
kondentsatziorik ez baita gertatuko goikaldean eta kondentsazioko tantak ez dira kultiboaren gainean
eroriko. Tenperaturaz aparte, mikroorganismoen oxigeno beharra kontutan hartu behar da.
Mikroorganismoa anaerobio bada, esterila den parafinarekin estali daiteke.

Berogailuak mikroorganismoen inkubazioa tenperatura egokian egiteko erabiliko dira.

Berogailuaren barruan Petri kutxatilak agarra goialdean dutela inkubatuko dira.




MlKROORGANISMOAK INGURUGIROAN

Laborategia, beste edozein girotan bezala, mikroorganismo askorekin kolonizatuta
dago. Mikroorganismo hauek airean edo gainazaletan itsatsiak egon daitezke.
Mikrobiologoek, kontutan hartu behar dute ingurugiroko kutsadura lanerako erabiltzen
dituzten materialak kutsatu ez daitezen. Lehenengo praktikan, gure lan postuan dauden
ingurugiroko baldintzak aztertuko ditugu.

Materiala:

1. TSA edo CPA agar elikagarria duten Petri kutxatilak
2. Hisopo edo torundak

Prozedura:

 Bi kutxatila erabiliko ditugu:

o Bata mahaiaren gainean zabalik utxiko dugu 30 minutuz. Ondoren
kutxatila itxi eta berogailuan inkubatuko dugu. Airean
mikroorganismoak dauden detektatzeko erabiliko dugu proba hau.
o Torunda bat mahaiaren gainazaletik igaroko dugu (100 cm2 inguru) eta
bigarren kutxatila hedaduraz inokulatzeko erabiliko dugu (kontuz ibili
agarraren hausketa ekiditzeko).

 Kutxatilak 37° C-tan 18-24 orduz inkubatuko ditugu
 Kutxatilak aztertu eta kolonien tamaina, itxura eta kolorea deskribatu. Lortutako
kolonia kopurua UFC edo Kolonia Eratzaileen Unitateen Kopuru dela esango
dugu.
 Kolonia batzuren GRAM tindaketa egin morfologia aztertzeko.




Torundarekin laginaren ereinketa egiten.

MIKROORGANISMOEN ISOLAKETA ETA
IDENTIFIKAZIOA
LAGIN LIKIDO BATETATIK ABIATUZ

Ingurugirotik hartutako lagin gehienek, mikroorganismoen populazio mixtoak dituzte.
Lagin hoietan dauden mikroorganismoen ezaugarri espezifikoak aztertu baino lehen,
beharrezkoa da, populazio mixto hoietan dauden espeziek kultibo puruan isolatzea. Behin
mikroorganismoak isolatuta daudenean, zenbait proba biokimikoren bidez identifikatuko
ditugu.

ISOLAKETA

Isolaketarako beharko dugun materialea
honako hau da:

MacConkey eta Manitol
agarra kultibo-medio
hautakorrak dituzten plakak.
Agar nutritibo ez selektiboa




(TSA edo CPA) dituzten Lanpostuan aurkituko ditugu behar ditugun
materialeak
plakak.
Kultibo mixtoa duen lagin
problema.




Jarraitu beharreko metodoa:

Mikroorganismoen suspentzio bat izango dugu, eta suspentzio hortan aurkitzen diren
mikroorganismo desberdinak isolatzeko bi kultibo medio inokulatuko ditugu.

Bikote bakoitzak honako hauek izango ditu:

Mikroorganismoen suspentzio bat (lagin-problema),
2 Petri kutxatila McConkey kultibo-medioarekin eta
2 Petri kutxatila Gatz-manitol kultibo-medioarekin

Murrizketa bidezko ereinketaren bidez kultibo medio hautakorra duten kutxatilak ereingo
dira , eta tenperatura egokian inkubatu 24 orduz

Kultibo puruak ditugula baieztatzeko normalean berrereinketak hiruzpalau aldiz egin
behar izaten dira, baina gure kasuan McConkey-an bi berrereinketa egongo ditugu (ez
bait dugu denborarik berrereinketa gehiago egiteko):

 Esperimentuaren lehen egunean mikroorganismoen
suspentziorekin bi McConkey kutxatila inokulatuko ditugu.
 Inkubazioaren ondoren, bigarren egunean, bi motatako koloniak
egertu beharko lirateke: kolonia laktosa positiboak eta kolonia
laktosa negatiboak . Lortutako bi kolonia isolatuak aukeratu
(kolonia bat laktosa positiboa eta bestea laktosa negatiboa) eta
berrereinketa egingo dugu McConkey kutxatila berri banetan
murrizketa bidezko ereinketaren teknikaren bidez.

Gatz-manitolean kasuan kultibo bakarra egingo da. Normalean ereinketa bakarrarekin ez
genuke isolaketa ziurtatuko, baina mikroorganismoen suspentzioa irakaslearentzat
ezaguna da, eta kontutan izanik suspentzioa osatzen duten mikroorganismoak,
kontaminaziorik ez badago ez litzateke arazorik egon beharko kultibo bakarrean isolaketa
lortzeko (gainerako mikroorganismo motak ez lirateke haziko). Medio hontan ez da




berrereinketarik egingo mikroorganismoen suspentziotik abiatuz haz daitezkeen
mikroorganismoek hazkuntza geldoa aurkezten dutelako (48 orduz inkubatu beharko
ditugu kutxatilak), eta ondorioz ez genukeelako denborarik izango berrereinketak
egiteko.

Isolaketa prosesuaren ondoren, experimentuaren hirugarren egunean honako kultibo
hauek izan beharko genituzte:

Bi MacConkey Petri kutxatila
Bata kolonia laktosa positiboak dituena
Bestea kolonia laktosa negatiboekin

Bi Gatz-Manitol kutxatila koloniekin.

McConkey Agarra

Kultibo-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu.
Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu:

Gatz biliarrak eta kristal-bioleta : bakterio Gram positiboen
hazkuntza) eta zenbait Gram negatibo sentikorrena) inhibitzen
du. Ondorioz, Gram negatiboak hasiko dira.

Laktosa eta Glukosa 10:1 proportzioan. Mikroorganismo
gehienek glukosa erabiltzeko gaitasuna dute, eta gutxi batzuk
laktosa ere erabili dezakete. Mikroorganismoek glukosa soilik
erabiltzen badute glukosaren hartzidura egitean konposagai
azido gutxi ekoiztuko dituzte. Aldiz, glukosa eta laktosa
erabiltzen badute, hartziduran konposatu azido asko ekoiztuko




dituzte.

pH indikatzailea. Koloniak azido asko ekoizten badituzte kolore gorria izango
dute (hots, laktosa erabiltzen dutenean). Ekoiztutako azido kopurua txikia
denean koloniak zuriak izango dira.

MacConkey agarrean hazitako koloniak.
Kolonia zuriak laktosa negatiboak dira, eta kolonia gorriak laktosa positiboak.

Manitol-gatz agarra

Kultibo-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu.
Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu:

Kloruro sodikoaren kontzentrazio altua (7.5%). Gatz
kontzentrazio altua jasan dezaketen mikroorganismoak soilik
haziko dira.

Manitola. Manitolaren hartzidura ematen bada azidoak
ekoiztuko dira kopuru handitan.

pH indikatzailea. Medioa berez gorrizka da, eta manitol
positiboak diren kolonien inguruan halo horia ikusi ahal izango
dugu (azidoen ekoizpenaren ondorioz).




Hazkuntzaren ondoren kolonia manitol positiboen inguruan halo horia
eratuko da.
Halo horiaren hedapena gerta daiteke kutxatila osoa hori gera daitekeeelarik.




IDENTIFIKAZIOA

Identifikaziorako, lehenengo aztertu egingo ditugu gure kultiboak puruak diren
beieztatzeko.

Gram tintaketaren bidez, kolonien morfologia zelularra aztertuko dugu.

 Kolonia isolatu bana aukeratuko dugu McConkey agarrean
kutxatila bakoitzetik. Kolonia hori zelula bakarraren hazkuntzaren
ondorioa izanik, kolonia hortan agertuko diren organismo guztiak
berdinak izan beharko lirateke. Horrela izanik kolonia bakarraren
Gran tindaketa egiten badugu zelula guztiek Gram tindaketarekiko
emaitza berdina eman beharko da (zelula guztiak edo Gram
positibo edo Gram negatibo izango dira), eta morfologia berdina
aurkeztuko dute (denak bazilo, koko edo beste morfologiaren bat
izango dute, baina denak morfologia bakarra izango dira). Horrela
ez balitz, berereinketak egin beharko genituzke.
 Gauza berdina gertatu bejarko litzateke Gatz-manitol agarrarekin.

Kultibo puruak ditugula baieztatu ondoren, proba biokimikoak egingo ditugu. McConkey
agarreko koloniak proba biokimikoak egin baino lehen kultibo medio ez selektiboan
kultibatuko ditugu (TSA edo CPA). Arrazoia oso simplea da: kultibo-medio
hautakorretatik abiatuz egiten baditugu proba biokimikoak, gerta daiteke proba
biokimikoen emaitzak aldatzea (baldintza ez estandarrak erabiltzen ditugulako).

Lagin probleman dauden bakteria mota ezberdinak isolatu eta medio ez-hautakorrean
hazi ondoren, identifikaziorako beharrezkoak diren froga biokimikoen bateriak egingo
dira. Zein proba egingo den erabakitzeko dagokion eskema jarraitu.




Honako proba biokimiko hauek egin ditzakegu:

Katalasaren proba.

Karbohidratoen metabolismo oxidatzaile aerobikoan amaierako produktuetariko bat ur
oxigenatua da (H2O2). Produktu hau toxikoa izanik, mikroorganismoek konposatu hau
suntsitzeko metodoak dituzte, hauen artean katalasa entzimaren ekintza dagoelarik.
Katalasak honako erreakzioa burutuz ur oxigenatua suntzitu egingo du:

H2O2 ---------> H2O + 1/2 O2

Katalasa mikroorganismo aerobio eta aukerazko anaerobioetan egoten da, eta ez dugu
aurkituko aerotoleratzaileetan (azido laktikoaren bakterioak) eta anaerobioetan.

Proba hau egiteko, porta baten gainean eta ur tantakarik gabe, aztertu nahi ditugun
mikroorganismoak jarriko ditugu (ereintza-euskarria erabiliko dugu Petri kutxatilatik
portara mikroorganismoen transferentzia egiteko). Ondoren ur oxigenatuaren diluzioa
gehituko dugu mikroorganismoen gainean. Burbuilak azalduko balira adierazitako
erreakzioa ematen dela esango genuke, hots, mikroorganismoak katalasa entzima
daukala.

Oxidasaren proba.

Arnasketa kate aerobioan c zitokromoa duten mikroorganismoak identifikatzeko
erabiltzen da (enterobakterioek ez dute, eta Pseudomona-k bai).

Proba hau egiteko jadanik prestatuta dauden erreaktibo kometzialak erabiliko ditugu.
Ereintza-euskarriarekin mikroorganismoen kolonia bat hartuko dugu eta erreaktiboak
dituen paperrraren gainean jarriko ditugu (urik gabe). Paperaren kolorea zuria izatetik
urdina izatera igarotzen bada proba positiboa dela esango dugu (mikroorganismoa




oxidasa positiboa dela).

Koagulasaren proba.
Odolean fibrinogenoa dago, eta mikroorganismo batzuk fibrinogenoa polimerizatu eta
fibrina sortzen duten entzimak dituzte. Proba hontan entzima hori duten
mikroorganismoak identifikatuko ditugu. Proba komertziala izango da, eta kontrol
positiboa eta negatiboa izango ditu. Koagulasa entzimaren presentzia birulentzia faktorea
da.

Proba hontan latex bolatxoak izango ditugu fibrinogenoarekin estalita. Mikroorganismoa
kultibo-medio solidotik ereintza euskarriarekin hartu eta dagokion tanpoiaren tanta
batetan suspendituko dugu. Ondoren latex bolatxoen tanta bat gehituko ditugu.
Mikroorganismoa eta bolatxoak nahastu eta minutu pare batez mugitu egingo ditugu
(errotazio mugimendua). Mikroorganismoaren paretan koagulasa entzima egonik latex
bolatxoak bildu egingo dira eta bikorrak azalduko dira.

Koagulasaren proba komertziala: Goian ezkerrean, kontrol positiboa. Goian eskuman, kontrol negatiboa.
Behean ezkerrean, lagin positibo bat. Behean eskuman, hutsik.




Proba biokimikoen bateria saiodietan. Inokulatu gabeko saiodiak. Ezkerretik eskumara:
indolaren proba, urearen proba, Metilo gorriaren proba, Vorgues-proskauer proba, Zitratoaren proba, KIA
multi-proba medioa.




IMViC.

Lau proba biokimikoz osoturiko proba da eta enterobakterioen desberdintzapenerako
erabiltzen da. Probak honako hauek dira:

Indolaren proba (I).

Proba hau egiteko behar den kultibo-medio likidoa (salda) saiodian izango dugu. Medio
inokulatu eta berogailuan inkubatuko dugu 37°C-tan 24 orduz. Ondoren Kovacs
erreaktiboa gehituko dugu kontu handiz kultibo medioaren gainean kokatuko delarik
erreaktiboa (erreaktiboa oliotsua baita). Interfasean eraztun gorria eratzen bada
mikroorganismoak medioan dagoen triptofanoaren degradazioz indola ekoiztu duela
adieraziko du. Kolore aldaketarik ez bada ematen proba negatiboa izango da.

Metilo gorriaren proba (M).

Saiodian MR-VP salda (Metilo gorria-Vorgues-Proskauer salda) izango dugu.
Indolarekin bezala inokulatu, inkubatu eta irakurketa egiteko MR erreaktiboa gehituko
dugu. Erreakzio gorria izanik proba posiboa izango da. Negatiboan ez da kolore
aldaketarik emango.

Vorgues-Proskauer proba (V).

Saiodian MR-VP salda izango dugu (Metilo gorriaren proban ere medio berdina da).
Inkubazioaren ondoren VP1 eta VP2 Erreaktiboak gehituko dira eta proba positiboa
izanik kolore gorria emango du. Negatiboan ez da kolore aldaketarik emango
Metilo gorriaren proban eta Vorgues-Proskauerren proban enterobakteriak burutu




dezakeen hartzidura mota aztertzen da. Hatzidura bi motatakoa izan daiteke: hartzidura
azido-mixtoa edo hartzidura butilenglikolikoa. Lehen kasuan azidoen ekoizpen
garrantzitsua gertatzen da eta ondorioz Metilo gorriaren proba positiboa irtetzen da
(azidotasun aldaketa bortitsa detektatzen da). Hartzidura butilenglikolikoan ez da azidoen
ekoizpen garrantzitsurik ematen eta besteak beste, azetoina ekoizten da. Vorgues-
Proskauerren proban erreaktiboak gehitzean azetoinaren presentzia detektatuko dugu.
Metilo gorriaren proba eta Vorgues-Proskauer proba ezin dira biak batera positibo izan.

Zitratoaren proba (C).

Saiodian zitratoa duen medioa solidoa daukagu. Jatorriz medioa orlegia da eta
inokulazioaren eta inkubazioaren ondoren mikroorganismoak zitratoa erabiltzeko
gaitasuna badu kolore aldaketa emango da (medioa urdina bilakatuko da).




Urearen proba.

Salda hontako kultibo-medioak urea izango du (NH2-CO-NH2 ). Mikroorganismoak urea
erabiltzeko gaitasuna izanik, amonioa askatuko da eta ondorioz pH aldaketa emango da
(pH-a gehitu egingo da nabarmenki, eta medioaren kolorea gorria bilakatuko da). Kolore
aldaketa ematen bada proba positiboa dugula esango dugu.

KIA (Kligler Iron Agar) muti-proba kultibo-
medioa.

KIA medioa multi-proba medioa dela esango dugu zenbait gauza
desberdin jakiteko erabili ahal daitekeen medioa delako. Medio
solidoa da eta siodietan izango dugu (argazkian, inolkulatu gabeko
medioa ezkerraldekoa da).

Medioa ziztadaz inokulatu eta ondoren zigi-zaga egingo dugu
medioaren azalean.

Besteak beste, medioko osagaien artean honako hauek daude:

 sulfato ferrosoa
 glukosa kontzentrazio baxuan
KIA
 laktosa kontzentrazio handitan
 pH indikatzailea daude.

Mikroorganismoak sulfatoa elektroi hartzaile bezala erabiltzeko gai
bada arnasketa anaerobioaren bidez, sulfidrikoa ekoiztuko da, eta




medioan burdin ferroso ioia dagoenez, FeS eratuko da. Sulfuro
ferrosoa eratu eta prezipitatzean prezipitatu beltza ikus daiteke.

Mikroorganismoaren metabolismo hartzitzailearen ondorioz CO2
ekoizten bada, medioa ziztatutako lekuan burbuilak agertuko dira.
Batzutan, gasaren produkzioaren ondorioz medioak gora egin edo
apurtu egin daiteke (argazkian eskumako saiodian gertatzen den
bezala).

Mikroorganismoak glukosa erabilitzeko ahalmena badu baina
laktosa erabiltzekoa ez, hartzidura egitean azido kopuru txikia
eratuko da. Azidoaren ekoizpenak medioaren kolore aldaketa
erakarriko du saiodiaren hondoan (gorritik horira), baina azalean
oxigenoaren prezentziaren ondorioz eta medioan dagoen peptonaren
erabileraren ondorioz amonioa ekoiztu eta pH-a altuagoa izango da,
kolore aldaketarik ez delarik nabarituko medioaren gikaldean.
Beraz, mikroorganismoak glukosaren hartzidura egiteko gai bada,
baina laktosarena ez, medioaren gainazala gorria izango da eta
hondoa horia.

Mikroorganismoak bai glukosa eta bai laktosa erabiltzeko gai bada,
hartziduraren ondorioz azido asko ekoiztuko dira eta amonioaren
ekoizpenak ezingo du medio osoaren azidifikatzea ekiditu. Ondorioz
medio bere osotasunean gorritik horira pasatuko da (argazkian
eskumako saiodian gertatzen den bezala).




Proba biokimikoen bateria komertziala.

Guk API 20E (Biomerieux, France) proba biokimikoen bateria komertziala erabiliko
dugu.

Plastikozko tiratxo batetan hodi eta kupula anitz izango ditugu eta hodi bakoitzean
deshidrataturik dagoen substratoa dago. Mikroorganismoen suspentzioa prestatu eta
proba komertziala inokulatzen (mikroorganismoa dagokion tanpoioan suspenditu eta hodi
eta kupula hoiek fabrikatzaileak adierazten duen eran inokulatuko ditugu) badugu
deshidratatutako konposatuak disolbatu eta mikroorganismoek erabiliko dituzte edo ez.
Hodi konkretu batetako konposatuen erabilera ematen bada, orduan medioan kolore
aldaketa emango da.

Inkubazio aldia (24 ordu) igaro ondoren kolore aldaketak emango dira. Aldaketa hoiek
proba positiboa den edo ez adieraziko dute. Kasuren batzutan erreaktiboak erabili
beharko ditugu erreakzioaren emaitza ezagutzeko.

API 20E proba biokimikoen bi bateria komertzial. bakoitza mikrooorganismo batekin
inokulatua izanda,
eta ondorioz proba desberdinen emaitzak desberdinak dira (kolore desberdinak ematen
dituzte).




MIKROORGANISMOEN BEHAKETA.

MIKROSKOPIOAREN
ERABILERA
1. Objetiboak, okulareak eta kondentsadorea
garbiak daudela ziurtatu. Ez baleude kontu
handiarekin garbitu.
2. Lagina 10X objektiboarekin fokatu. Fokatzeko
hasieran torloju makrometrikoa erabiltzen da.
Fokatze finagoa lortzeko torloju mikrometrikoa
erabiliko dugu.
3. Ondoren, 40X objektiboa jarri eta fokatzeko
torloju mikrometrikoa erabili (makrometrikoa ez
litzateke beharrezko izan beharko).
4. Laginaren gainean olio tanta bat jarri eta 100X
objektibora pasatu. Objektibo hau erabiltzeko
olioa beharrezkoa da, era hortan difrakzio
arazoak ekiditzen baitira. Fokatzeko torloju
mikrometrikoa erabili
5. Beharrezkoa izanik, argi kopurua kontrolatzeko,
diafragmaren bidez argiaren sarrera kontrolatu
6. Behaketa guztiak amaitu ondoren eta
mikroskopioa gorde aurretik objektiboak garbitu
egin beharko dira (batez ere 100X objektiboa
olioa kentzeko). Bukatzerakoan estalkia jarri.
7. Mikroskopioa erabiltzen ez den bitartean argi-
iturria itzalita mantendu.




TINDAKETEN PRESTAKETA
Mikroskopioarekin mikroorganismoak behatzeko, hauek
portatan jarri beharko ditugu. Horretarako portatan
bakterioen hedapena prestatu beharko dira. Kasu
guztietan portan oso garbi egon beharko dira.

Bakterio hedapenaren prestaketa

1. Ereintza-euskarriarekin ur tanta bat jarri portaren
erdian.
2. Suaren gainean euskarria bertikalki jarriz
esterilizatu gori jarri arte bere luzera osoan.
3. Bakterioen kultiboa duen hodia hartu, suaren
ondoan ireki eta sutatik pasa, tapoia sutatik gertu
mantenduz. Esterilizatutako euskarria hodian
sartu, hoztu beirarekin kontaktuan eta zelula
kantitate txiki bat hartu. Euskarria hoditik atera,
hodia sutatik pasatu eta hodia itxi.
4. Euskarriarekin hartutako zelulak portan dagoen
ur tantan suspenditu eta ondoren hedatu portaren
azalera zehar kapa fin eta homogeneo bat lortuz.
5. Euskarria esterilizatu.
6. Prestaketa lehortu arte itxaron.
7. Zelulak portaren azalean finkatzeko, porta bi
aldiz sutatik pasatu. Honela bakteriak portan
geratzea lortuko dugu. Azkenengo hau lortzeko
alkohola eta zenbait konposatu kimiko ere erabili
daitezke, baina beroa da erabiliena.




Medio likido batetik abiatzen bagara, pauso berdinak
jarraitu behar dira, baina ur tantarik ez dugu behar
izango (mikroorganismoen suspentsioa jadanik
badaukagulako).




BEHAKETA FRESKUAN
Muntai hezea

Legamia, onddo eta algak behatzeko erabiltzen den prestaketa mota. Bakterio biziak
ikusteko ere erabili daiteke.

Mikroorganismoaren tanta bat portan jartzen da eta kubreobjektuarekin estali (aire
burbuilak ekiditu beharko dira). Ondoren mikroskopioan behatzen da.

Zintzilikaturiko Tanta

Kultibo-medio likido batetan hazten ari diren mikroorganismoak ikusteko erabiliko
dugu teknika hau.

1. Kubreobjektu baten lau izkinetan baselina pixka bat jarriko dugu.
2. Ereintza-euskarrierekin kultiboaren tanta bat hartuko dugu eta kubreobjektoaren
erdian jarriko dugu.
3. Kubreobjektuari buelta eman eta induzturiko porta baten sakonaldearen gainean
kokatuko dugu laginaren tanta.

Mikroorganismoaren tanta

Behaketarako, mikroskopioaren lOX objektiboarekin tantaren ertza fokatuko dugu
(ertza itsura ondulatudun lerro bat bezala ikusiko da). Ondoren 40X objektiboa jarri,
berriz ere ertza fokatu, eta azkenez lOOX objetiboa jarriko dugu (olioarekin). Tantaren
ertzean bakterioak ikusiko ditugu. Bakterio hauek, baldin eta flageloak badituzte
mugitzen ikusiko ditugu.

Experimentu hontan, behaketa mikroskopikoa egitean, bakterioak ez daudenez
tindatuta, behaketa zaila izango da. Behar beharrezkoa izango da kondentzadoretik




sartzen zaigun argi kopurua oso ondo kontrolatzea mikroorganismoak ikusi ahal
izateko.

TINDAKETA BEREIZGARRIAK

Tindaketa berezgarriak bakterioak sailkatzeko edo bereizteko erabili daitezke bakterioek
tintatzeko orduan erakusten dituzten propietateen arabera.

GRAM tintaketa

Bakterioen azterketarako erabiltzen den tintaketa bereizgarri garrantzitsuena da.

Tintaketa honek bakterioak bi taldetan banatzen ditu, bakterioen pareta
zelularraren ezaugarrien arabera: GRAM positiboak eta GRAM negatiboak.

Tindaketa egiteko mikroorganismoaren hedapen bat egingo da porta batetan,
sugarrean finkatu, eta ondoren tindatu:

1. Lagina kristal bioteta koloratzaile basikoarekin estali (minutu bat)
Gram tindaketa:
2. Urarekin garbitu Bazilo Gram negatiboak
3. Lugolarekin estali (1 minutu). Lugola, iodoa duen fixatzailea da (Kristal
bioletaren finkapena baimentzen du).
4. Urarekin garbitu
5. Alkohol-azetonarekin dekoloratu (30 segundu). Gram negatiboetan,
pausu honek kristal bioleta kendu egingo du. Gram positiboetan ez da
dekolorazioa emango.
6. Urarekin garbitu
7. Safraninarekin edo fuktsinarekin tindatu (1 minutu). Kontraste tindaketa
da hau. Gram negatiboek kolore larrosa hartuko dute, eta Gram
Gram tindaketa:
positiboek kristal bioleta dutenez, azken koloratzaile hau ez da Koko Gram positiboak




antzemango.
8. Urarekin garbitu
9. Sikatu
10. Behaketa mikroskopikoa.

Beraz, kolore urdinak direnak GRAM positibok direla esango dugu, eta kolore
larrosadunak GRAM negatiboak, eta normalki tindaketaren emaitza paretaren
izaerarekin erlaziona dezakegu.

Dena den, GRAM positibo edo negatiboak izateak tindaketa baten ondorioz
Gram tindaketa:
lortzen dugun kolorea adierazten du (urdina edo larrosa), eta ez derrigorrez Koko Gram positiboak eta
pareta zelularraren izaera. Hala ere, mikroorganismo askorentzat, eta batez ere bazilo Gram negatiboak
guretzat garrantzitsuak izan daitezkeen mikroorganismo askorentzat,
tindaketaren emaitza eta paretaren izaera erlazionatzea posible da.

Tindatzaileak gehitu ondoren, porta urarekin Tindaktea ondoren porta sikatzen utziko dugu.
garbitzen




TINDAKETA SELEKTIBOA
Kapsularen tintaketa

Bakteria asko lodiera desberdina izan dezakeen kapsula batez inguraturik daude;
kapsula hauek zelula baino intentsitate txikiagoarekin tintatzen dira, eta ondorioz,
tindaketa arruntekin ez dira nabarmentzen. Kapsula hauek behatzeko tindaketa mota
egokia tindaketa negatiboa da. Tindaketa hontan koloratzaile azidoak erabiltzen dira
(koloratzaile azidoetan kolorea gatzaren ioi negatiboan oinarrituta dago, eta zelula
gehienak kanpoaldean karga negatiboa dutenez, ez dute koloratzailea hartzen eta
koloratzailea zelula inguratzen dagoen likidoan geratuko da).

Portaren izkina batetan tinta txina edo negrosina tanta bat jartzen dugu. Ereintza
euskarriarekin mikroorganismoen kopuru txiki bat hartuko dugu eta koloratzailearen
tantan suspendituko ditugu. Ondoren, beste porta baten ertzarekin eta koloratzailearen
tantatik hasita frotis bat egiten da portaren luzeran zehar. Era hontan koloratzailearen
kapa fin bat lortzen da, kapa fin hortan mikroorganismoak egongo direlarik. Lagina
airean lehortzen usten da, eta ondoren mikroskopioan behatzen da. Bakterioak dauden
lekuan kolore argia izango dugu (koloratzailerik gabe).

Tindaketa mota hau bakterioen morfologia ikusteko ere erabili daiteke.

Kapsulen tindaketa: hutsune zuriak kapsulen presentzia adierazten dute




Endosporen tintaketa

Bacillus eta Clostridium generoetako espezieek ingurune baldintzekiko oso
erresistenteak diren egiturak eratzen dituzte: endosporak. Endosporak, zelula
begetatiboak ez bezala, denbora epe luzetan baldintza desfaboragarrietan iraun
dezakete. Egitura hauek, tintatzaileekiko ere erresistentzia erakusten dute, tintaketa
mota gehienetan ez direlarik koloreztatzen. Hala ere, tintatu ondoren, koloratzailea
kentzea oso zaila da. Endosporak tintatzeko tintatzaile kontzentratuak berotan erabiltzen
dira.

Endosporen tindaketa: Wirtz metodoa

Endospora asko dituen bakterio kultibo zahar baten tanta bat portan jarri eta lehortzen
utzi (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium). Beroarekin fixatu. Malakita berdearekin
estali eta berotu lurrina irten arte. Horrela mantendu hiru minutuz. Urarekin garbitu eta
kontrastea lortzeko fuksina koloratzailea gehituko diogu minutu batez. Esporak kolore
berdea hartuko dute eta zelulek larrosa.

Endoporen tindaketa: endosporak kolore orlegi argia azaltzen dute, eta zelula begetatiboak larrosa.
Endosporak zelula begetatiboen barruan edo aske ager daitezke.

Gorputz metakromatikoen tindaketa

Bakterio batzuk polifosfatoz osoturiko bikorrak dituzte (gorputz metakromatikoak edo
bolutina bikorrak). Bikor hauek koloratzaile basikoekin tindatu eta koloratzailearen argi
xurgapenaren ezaugarriak alda ditzakete (horregaitik deritze metakromatikoak). Egitura
hauek lehenengo aldiz Spirillum volutans espezien aurkitu ziren (horregaitik bolutina




bikorrak izena). Lactobacillus generoan ere agertzen den egitura da (yogurta egiteko
Lactobacillus vulgaricus eta Streptococcus thermophilus erabiltzen dira)

Egitura zelular gehienak koloratzaile basikoekin tintatzen dira hauen inguruko pH-a
puntu isoelektrikoaren gainetik dagoenean (5 baino handiagoa). Bolutina osagai azidoez
osatua dagoenez, koloratzaile basikoekin tindatu ahal izateko medioaren azidotasuna
jeitsi egin beharko da bolutina bikorren eta koloratzaile basikoaren arteko afinitatea
lortzeko (pH <4).

Albert tintaketa

1. Lactobacillus kultiboaren (yogurta) hedapena portan egin eta airean lehortu.
2. Albert tintatzailearekin 5 minutuz estali.
3. Tintatzailea kendu, lugola gehitu minutu batez, urarekin garbitu, lehortu eta
100X objektiboarekin mikroskopioan behatu.

Gorputz metakromatikoak orlegi-urdin kolorez tintaturik ikusten dira, bakterioaren
gainontzeko zatiak orlegi argiak. Lactobacillus zelulen barruan puntotxoen segida bat
bezala azalduko dira gorputz metakromatikoak.

Yogurteko Lactobacillus -en barruan gorputz metakromatikoen tindaketa.
Gorputz metakromatikoak hiladatan agertzen dira baziloen barruan aurkitzen dutelarik,
eta batzutan kokoen hiladak dirudite.




ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

TEMA: Recuento de hongos en un alimento balanceado de marca comercial para
pollos
OBJETIVO: Determinar la presencia y recuento de hongos en un alimento
TÉCNICA: Método de las diluciones sucesivas y siembra en superficie de Agar
FUNDAMENTO: El presente análisis permite determinar la presencia de hongos
contaminantes, sean éstos ambientales o propios del alimento por contaminación
durante o después de su elaboración.
DESARROLLO: Pesar exactamente 10 gr del alimento a analizar cuya población
fúngica se desea estudiar. Añadir la muestra de alimento a 90 ml de H2O d/e (agua
destilada estéril contenida en un erlenmeyer, agitar hasta alcanzar la mayor disolución
posible. El contenido del erlenmeyer (agua más alimento) constituye la “suspensión
madre” .
Tener preparado 10 tubos de ensayos estériles con 9 ml de H2O d/e cada uno y 10
placas de Petri estériles con 0,1 ml de Rosa de Bengala (colorante), 0,1ml de
Clorenfenicol (antibiótico inhibidor de crecimiento bacteriano) y 10 ml de Agar papa
dextrosa (o Saboraud Glucosa).
Colocar en el primer tubo 1 ml de la suspensión madre , de esta forma obtendremos así
la primera dilución de la muestra, esto equivale a la dilución 1:10 que es lo mismo 10-1.
Colocar 1 ml de la dilución 1:10 al segundo tubo, obtendremos así la segunda dilución,
esto equivale a la dilución 1:100 que es lo mismo 10-2.
Colocar 1 ml de la dilución 1:100 al tercer tubo, obtendremos así la tercera dulución,
Colocar 1 ml de la dilución 1:1000 al cuarto tubo, obtendremos así la cuarta dilución,
Colocar 1 ml de la dilución 1:10000 al quinto tubo, obtendremos así la quinta dilución,
En todos los casos se hace por duplicado (utilizando de esta manera los 10 tubos
estériles con 9 ml de H2O d/e.
Nota: cuando se preparen las placas de Petri colocar en la placa estéril el colorante y




Nota: cuando se preparen las placas de Petri colocar en la placa estéril el colorante y
antibiótico y luego agregar el Agar estéril a una temperatura que pueda ser soportado
por la mano. (tener cuidado que solidifica muy rápidamente).
Una vez agregado el Agar agitar la placa por movimientos giratorios sobre la mesada.

En cada una de las placas de Petri se colocará 0,1 ml de cada uno de los tubos (utilizar
por cada una de las diluciones una pipeta estéril distinta) Tendremos así 5 placas
originales y 5 duplicados.
Proceder a sembrar la muestra sobre la superficie del Agar con espátula de Drigalsky
estéril (flameado sobre la llama y enfriada sobre la tapa de la placa). Dejar secar
sobre mesada y luego proceder a incubar las 10 placas previo rótulo con la dilución
que contiene, en forma invertida en estufa de cultivo a 27ºC durante 5 días.
Al cabo del 5º día de incubación proceder al realizar el recuento de colonias.

RECUENTO
Generalmente las placas que contienen las diluciones 1:10 y 1:100 (primeras dos
diluciones no se tienen en cuenta por la gran cantidad de colonias.
Se comienza la lectura de la última dilución hacia atrás.
Contar las colonias crecidas en cada una de las placas originales (se supone que tiene
que se idético al contaje en su duplicado).
El total de colonias se multiplica por 10 por el factor de dilución, es decir:
p. ej.: en la placa 5 cuya dilución es de 1:100000 lo que equivale a 10-5 se contaron 8
colonias, tendremos:
8 X 10 X 105 = 800.000 UFC/gr de alimento
Cuanto mayor sea la dilución, menor será el númeo de colonias que se tienen que
contar.
Nota: cuidado que no se multiplica p. ej.:X 10-5 sino por 105)




(Ver esquema de trabajo)

ESQUEMA DE TRABAJO:

MUESTRA
ALIMENTO 10 grs.

90 ml agua
destilada estéril
1 ml

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e 9 ml agua d/e

dil. 1:10 dil. 1:100 dil. 1:1000 dil. 1:10000 dil. 1:100000

01 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml

0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb 0.1 ml Atb
0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color. 0.1 ml color.
10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml Agar 10 ml Agar


Entseiu mikrobiologikoa

Empfohlen

Empfohlen

Weitere ähnliche Inhalte

Andere mochten auch

Andere mochten auch (20)

Ähnlich wie Entseiu mikrobiologikoa

Ähnlich wie Entseiu mikrobiologikoa (20)

Mehr von Juan Arbulu Arin

Mehr von Juan Arbulu Arin (20)

Entseiu mikrobiologikoa