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90. CONTENIDO 1 Pág. Índice de figuras 2 Introducción 3 Capítulo I: Los moluscos 5 Generalidades 5 Moluscos de interés médico 6 Medidas de control de los moluscos 9 Capítulo II: Extractos y compuestos aislados de plantas con actividad 11 molusquicida Capítulo III: Evaluación de las actividades de extractos y compuestos aislados de plantas sobre moluscos 30 Evaluación del efecto molusquicida: prueba de inmersión 30 Pautas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) 30 Determinación de parámetros 32 Actividad ovicida 34 Determinación de las dosis subletal (DL50) y letal (DL90) con acción 34 ovicida Evaluación de la influencia de la dosis subletal (DL50) en los parámetros reproductivos 34 Pruebas bioquímicas 35 Valoración de la influencia de las concentraciones letal (CL90) y subletal (CL50) en algunos parámetros bioquímicos 35 Actividad miracidicida y cercaricida 36 Otras pruebas 37 Conclusiones 38 Agradecimiento 39 Referencias Bibliográficas 40

91. ÍNDICE DE FIGURAS Nº Pág. I Molusquicidas sintéticos. 10 II Glicoalcaloides esteroidales con actividad molusquicida. 14 III Glicósidos triterpénicos con actividad molusquicida. 16 IV Componentes aislados de Ambrosia marítima. 18 V Actividad molusquicida de los ácidos anacárdicos aislados de 2 Anacardium occidentale. 20 VI Componente aislado de Azaridachta indica. 21 VII Componente aislado de Euphorbia splendens (E. milli). 23 VIII Compuestos aislados de Croton campestri. 25 IX Compuesto aislado de Croton floribundus. Derivados del ácido kaurenóico. 26 X Compuestos aislados de Artemisia judaica y Hammada scoparia. 28

92. INTRODUCCIÓN Desde el comienzo, el hombre satisfacía sus necesidades con lo que encontraba en la naturaleza; la búsqueda de alimento en el reino vegetal, le permitió descubrir que algunas plantas eran venenosas y otras podían producirle alivio del dolor, aumento de sudoración, entre otros efectos. Tal vez, utilizó plantas medicinales mediante la observación de las conductas de algunos animales, como perros y gatos, cuando las consumían para mejorar su función digestiva (Barquero, 2007). El uso de las plantas, como fuente alimenticia y medicinal data, aproximadamente, desde hace 60.000 años. La información acumulada a lo largo del tiempo, se transmitió de forma oral, luego con el establecimiento de las diferentes civilizaciones y el nacimiento de la escritura se originaron los registros como Pen Tsao; Papiro de Ebers; Rig Veda; De Materia Medica con la revisión más importante en castellano Plantas Medicinales: El Dioscórides Renovado; De Simplicibus Medicinis; Los Roles de la Medicina; Regimen Sanitatis Salernitatum; farmacopeas de los Aztecas, Mayas e Incas, como el Códice Badiano; en los cuales quedaron plasmadas las bondades y precauciones derivadas del uso de las plantas. Todos estos documentos ponen de manifiesto la utilización de las plantas con fines terapéuticos en todo el mundo desde épocas remotas (Miranda et al., 2005; Barquero, 2007). Para el siglo XVII se presentaron casos emblemáticos que evidenciaron las propiedades curativas de varias plantas, por ejemplo, la cinchona (Cinchona L. sp.), opio (Papaver somniferum L.) y belladona (Atropa belladonna L.), así como de los principios activos separados a partir de ellas: quinina, morfina y atropina, respectivamente. Todas las sustancias que se conocían, empleadas con fines medicinales, provenían únicamente de la naturaleza, de fuentes minerales, animales y vegetales; pero con la obtención de la úrea, en 1828, se abrió un abanico de 3

93. posibilidades, dentro de la Química Orgánica, para la producción de fármacos por medio de la síntesis (Calleja, 1999; Barquero, 2007). El auge de los fármacos de origen sintético, intentó desplazar la utilización de las plantas en la terapéutica médica (Calleja, 1999), sin embargo, hoy en día el 80% de la población mundial, aproximadamente, no tiene acceso al sistema moderno de salud y por lo tanto, a los productos alopáticos (Farnsworth et al., 1985), por lo que las plantas medicinales todavía constituyen un gran recurso en el tratamiento de muchas enfermedades, no sólo por la actividad de los extractos sino de los compuestos químicos activos que se aislan de los mismos (Saénz, 2003; Miranda et al., 2005). Por otro lado, en varios países del mundo se observa una alta incidencia de enfermedades causadas por parásitos trematodos en cuyo ciclo de vida intervienen moluscos que actúan como hospederos intermediarios. El manejo de estas enfermedades infecciosas requiere un enfoque integral el cual incluye además de quimioterapia, métodos preventivos como medidas de control que interfieran en los ciclos de vida de los parásitos (Ojewole et al., 2004). Estudios parasitológicos y epidemiológicos han demostrado que eliminando al molusco se puede controlar o erradicar la enfermedad. Dentro de los métodos de control de moluscos el más desarrollado es el químico. Sin embargo, el elevado costo de estos productos, así como su toxicidad para la biota acompañante, han hecho que en la actualidad los estudios se orienten hacia la búsqueda de moluscocidas de origen vegetal, considerados selectivamente activos, biodegradables, ecosostenibles, económicos y fácilmente disponibles en las áreas afectadas (Hevia et al., 2008). En el presente trabajo se revisan algunas investigaciones realizadas a partir de plantas y su aplicación como agentes molusquicidas, con el fin de conocer al respecto y establecer una guía para ensayar esta actividad con los extractos y/o compuestos que se obtengan de las plantas objeto de estudio. 4

94. Capítulo I LOS MOLUSCOS GENERALIDADES Después de los artrópodos, el Phylum Mollusca es el grupo más abundante del reino animal, estimando un número por encima de las 100.000 especies existentes (Campbell Reece, 2007). Los moluscos poseen un gran éxito evolutivo con diversas formas, tamaños y gran adaptación en diferentes hábitats, con representantes en el medio acuático y terrestre. Las comunidades de agua fresca han sido menos estudiadas en comparación con las especies marinas dado su atractivo desde el punto de vista gastronómico y estético. No obstante, a los moluscos dulceacuícolas se les ha conocido por el rol que juegan en la salud pública y veterinaria lo que ha determinado el incremento de las investigaciones, además de que los caracoles no sólo causan daño a animales y humanos, sino que también ocasionan enfermedades a las plantas (Supian Ikhwanuddin, 2002; Abdelgaleil Badawy, 2006). Morfológicamente los moluscos son animales de cuerpo blando, caracterizados por un pie musculoso en la parte ventral que le sirve para reptar, minar o cavar; en la zona dorsal presenta un manto que se forma por el repliegue de la pared del cuerpo, el cual segrega conchas, placas o espículas calcáreas, y una masa visceral que contiene los órganos de los sistemas respiratorio, digestivo, circulatorio, nervioso y reproductivo. Muchos moluscos poseen una estructura membranosa llamada rádula con forma de lengua o dedo con hileras de dientes transversales utilizados para raspar el alimento (Campbell Reece, 2007). En base a sus características morfológicas el phylum Mollusca se divide, taxonómicamente, en siete clases: Polyplacophora (polipalcóforos o quitones), Scaphopoda (escafópodos), Aplacophora (aplacóforos), Monoplacophora (monoplacóforos), Bivalvia (pelicípodos), Cephalopoda (cefalópodos) y Gastropoda (gastrópodos) (Baswaid, 2002; Barrientos, 2003). 5

95. Las últimas tres clases son relevantes debido a su importancia económica por varias razones: muchos moluscos son fuente de alimentación para el hombre, otros son hospederos intermediarios de parásitos del hombre y de animales domésticos y, algunas especies, como las babosas, constituyen plagas en numerosos cultivos (Godan, 1983). Los bivalvos o moluscos de concha dividida incluyen más de 8000 especies, tienen su concha dividida en dos valvas, comprenden las formas más populares como almejas, ostras, mejillones, pepitonas y vieiras. Su importancia es enorme en el campo comercial, pues se consumen ampliamente como alimento y por su producción de perlas y nácar. Los cefalópodos con más de 650 especies, agrupan a los pulpos, calamares y nautilos, se mueven con rapidez y tienen una vista desarrollada. Tienen una gran importancia comercial como alimento predilecto de diversas culturas. Su inteligencia también los ha convertido en modelos importantes en estudios etológicos. Los gastrópodos, incluyen las babosas y caracoles, se caracterizan por la torsión del tubo digestivo, se han descrito más de 40.000 especies. Tienen importancia en los campos comercial, agrícola y sanitario. Además de ser una fuente de alimento en Europa y Asia, se les describe como plaga agrícola y en menor cantidad como plaga de materiales almacenados, por lo que han influido en el comercio internacional al actuar como plaga cuarentenaria. Algunos caracoles atacan cultivos acuáticos con poblaciones excesivas que obstruyen los filtros de tratamiento de agua (Monge- Nájera, 2003). MOLUSCOS DE INTERÉS MÉDICO La clase gastrópoda es importante desde el punto de vista médico porque incluye a los hospederos intermediarios de varios parásitos de los géneros Schistosoma Weinland, Fasciola L., Fasciolopsis Looss, Angiostrongylus Kamensky, 6

96. Paragonimus Braun, Equinostoma Rudolphi, entre otros (Chester et al., 1986); se caracterizan por la asimetría en su anatomía debido a la torsión de sus órganos viscerales y por la concha de una sola valva con espiral hacia la derecha o izquierda. Esta clase se subdivide en dos subclases: Prosobranchia y Pulmonata. La primera subclase comprende varias familias, entre ellas Pomatiospidae dentro de la cual se ubican los géneros Oncomelania Gredler y Tricula Benson. La subclase Pulmonata reúne otras familias como Planorbidae, principalmente, con los géneros Biomphalaria Preston, Indoplanorbis Annandale Prashad y Bulinus Müller, y Lymnaeidae que incluye especies del género Lymnaea Lamarck (Chester et al., 1986; Baswaid, 2002; Naranjo 2003). La vinculación de las formas larvarias de los parásitos Schistosoma mansoni Sambon y Fasciola hepatica L. con moluscos gastrópodos, en los que se hospedan de forma no permanente en una etapa de su vida, contribuye al desarrollo de dos enfermedades denominadas esquistosomiasis y fasciolosis, ocasionando daño tanto al hombre como a animales domésticos (Singh et al., 2004; Hevia et al., 2008). Se considera que la esquistosomiasis, también llamada bilharzia, es la segunda parasitosis después del paludismo, la sufren alrededor de 200.000.000 personas anualmente, con un rango de mortalidad aproximado de 200.000 enfermos por año. Se estima que existen cerca de 600.000.000 de personas en situación de riesgo de contraer la enfermedad, en Africa, las islas del Caribe, América Latina, el Mediterráneo oriental y el sudeste asiático (Hevia et al., 2008). Esta enfermedad se extiende con los programas de desarrollo ya sean de tipo agropecuario y energético, los cuales llevan implícitas construcciones de balsas, pantanos y canales de irrigación, o por actividades domésticas y recreativas que impliquen el contacto con agua dulce. En estos sitios las personas infectadas, por micción o defecación, depositan los huevos, de los que sale el miracidio que infecta al caracol, el cual emite las cercarias luego de varias semanas, las que penetran la piel 7

97. del hombre cuando éste entra en contacto con el agua. Las cercarias viajan por la circulación hasta alcanzar las vénulas mesentéricas donde se desarrollan los esquistosomas adultos con diferenciación de sexos (Corachán et al., 1998). Por otra parte, la fasciolosis es una enfermedad que afecta al ganado bovino y caprino, pero también presenta alta prevalencia en humanos (Vázquez Gutiérrez, 2007); según la Organización Mundial de la Salud 17 millones de personas, aproximadamente, están infestadas a nivel mundial (Wong et al., 2010). Atendiendo al ciclo evolutivo de Fasciola, la forma adulta de este parásito se localiza en los conductos biliares donde coloca centenares de huevos; por medio de la bilis llegan al intestino y luego van al exterior con las heces del hospedero. Cuando los huevos caen en agua dulce, dan origen a los miracidios los cuales invaden a los caracoles limneidos, que habitan lagunas temporales y corrientes mansas; dentro de ellos se transforman en esporocistos, redias, redias hijas y cercarias; estas últimas salen del caracol y se enquistan en pastos, plantas y cáscaras. Cuando son ingeridas por los huéspedes definitivos, en plantas contaminadas como los berros, pasan a través de la pared intestinal, migran hacia las vías biliares, alcanzando su madurez para generar un cuadro clínico caracterizado por un estado de hipersensibilidad y síntomas hepatobiliares (Brown Neva, 1985; Botero Restrepo, 1998). Es importante resaltar que nuestro país no escapa a esta enfermedad dada su ubicación geográfica. En el caso de la bilharzia, la zona endémica está circunscrita a las regiones Norte y Central, con presencia en el Distrito Capital y en los estados Miranda, Aragua, Carabobo y Guárico (Katz Sena, 2001). Con relación a la fasciolosis, se ha reportado en varios estados tales como Mérida, Trujillo, Lara, Yaracuy, Falcón, Portuguesa y Zulia (Meléndez et al., 1983). 8

98. MEDIDAS DE CONTROL DE LOS MOLUSCOS Además de una adecuada quimioterapia y programas de saneamiento ambiental, otra medida para hacerle frente a las enfermedades relacionadas con moluscos es el control de los mismos, suprimiendo los caracoles infectados para disminuir o eliminar la densidad poblacional de hospederos intermediarios y reducir potencialmente la infección del hombre por la interrupción del ciclo de vida de los parásitos (McCullough et al., 1980; Meepagala et al., 2004, Woldemichael et al., 2006). Para ello se cuenta con métodos ecológicos que alteran el biotopo del caracol, métodos de control biológico y químico. El método biológico se fundamenta en la utilización de organismos vivos como estrategia de control, dado que existen enemigos naturales que son depredadores o competidores con la especie indeseable (Madsen, 1990). El empleo de moluscos competidores como Marisa cornuarietis L., Tarebia granifera Lamarck y Melanoides tuberculata Müller, ha limitado y/o eliminado poblaciones de Biomphalaria glabrata Say (Pontier Jourdane, 2000). Otro ejemplo es el papel del pez Protopterus annectens Owen, el cual consume especies de caracoles hospedadores de trematodos en Sudán (Mahdi Amin, 1966). También se promueve la cría y protección de aves con hábitos acuáticos como los patos (Morales Pino, 1992). No obstante, dentro de los métodos de control de moluscos el más desarrollado es el químico (Hevia et al., 2008). Los molusquicidas sintéticos como sulfato de cobre (CuSO4), cianato de calcio (CaCN2), cloruro de cobre (CuCl2), pentaclorofenato de sodio (NaPCP) [1], N-tritilmorfolina (4-trifenil-metil-morfolina) (Trifenmorf®) [2], metomilo [S-metil-N-(metilcabamoiloxi)-tioacetimidato] [3], derivados de carbamatos como el dimetilditiocarbamato de zinc [4], niclosamida (sal de 2- aminoetanol; 5-cloro-N-(2-cloro-4-nitrofenil)-2-hidroxibenzamida) (Bayluscide®) [5] entre otros, son conocidos por tener efecto letal sobre las especies de moluscos (WHO, 1965; WHO, 1973; Jurberg et al., 1989; Abdelgaleil Badawy, 2006; Mezghani et al., 2009), sin embargo su acción biocida residual destruye la flora y 9

99. fauna asociadas con los caracoles que se desean eliminar (Figura I) (Cruz-Reyes et al., 1989). Estos hechos han dirigido la atención hacia el uso de nuevos molusquicidas que sean altamente efectivos, rápidamente biodegradables, de menor costo, accesibles y de fácil aplicación, con técnicas más simples que las empleadas para los moluscocidas sintéticos. Por ello, la importancia en la búsqueda de sustancias con estas propiedades a partir de plantas, abundantes en las zonas endémicas, de fácil extracción y que actúen selectivamente sin causar daño al medio ambiente (Jurberg et al., 1989). O + S N S N Figura I. Molusquicidas sintéticos 10 O-Na+ Cl Cl Cl Cl Cl [1] Pentaclorofenato de sodio N [2] N-tritilmorfolina S N S Zn2 S [4] dimetilditiocarbamato de zinc OH C HN NO2 Cl O Cl H2N OH [5] niclosamida O O HN [3] metomilo

100. Capítulo II EXTRACTOS Y COMPUESTOS AISLADOS DE PLANTAS CON ACTIVIDAD MOLUSQUICIDA Muchas plantas pertenecientes a diversas familias han sido objeto de ensayos como molusquicidas según lo refieren Kloos y McCullough (1982), Jurberg y colaboradores (1989), entre otros. Para ello, las especies se han seleccionado de forma aleatoria o por conocimiento de diferentes usos como catártico, analgésico, antipirético, antiasmático, antitusígeno, antiinflamatorio, antimalárico, leishmanicida, antimicrobiano, antihelmíntico, antiulceroso, contraceptivo, dispéptico, insecticida, antiofídico, entre otros (Singh et al., 1996; Singh Singh, 2005; El Babili et al., 2006; Sarmento et al., 2006). A continuación se citan algunas de las investigaciones que se han realizado con respecto a esta actividad. En la tercera década del siglo pasado se iniciaron las investigaciones sobre plantas molusquicidas. Archibald, en Sudán (1933) y Wager, en el sureste de Africa (1936) observaron que cuando los frutos de Balanites aegyptiaca Delile y B. maughamii Sprague (Balanitaceae), caían en el agua disminuía la población de moluscos; lo que impulsó el cultivo de estas plantas en las márgenes de los ríos en dichas localidades. También se obtuvieron resultados satisfactorios con la introducción de B. aegyptiaca en Puerto Rico, sembrada alrededor de un estanque infestado con Biomphalaria glabrata (Kloos McCullough, 1982; Marston Hostettmann, 1985). En 1939, Mozley, consideró que B. aegyptiaca, los frutos de Sapindus saponaria L. y Swartzia madagascariensis Desvaux, estaban entre las plantas molusquicidas más prometedoras. Los frutos de S. saponaria, usados en Africa y Suramérica como jabón y veneno para peces, controlaron una población de Bulinus (Physopsis) africanus Krauss en un criadero en Zanzibar. Luttermoser (1946) en Venezuela y Pinto Almeida (1944) en Brasil, demostraron que dichos frutos ejercían un efecto 11

101. letal sobre microorganismos y moluscos hospederos de Schistosoma y Fasciola (Torrealba et al., 1953). La combinación del extracto de S. saponaria y pentaclorofenato de sodio (NaPCP) [1], demostró poseer efecto sinérgico. A pesar de las experiencias antes mencionadas, ninguna de estas plantas, ni las venenosas para los peces, se explotaron para el control de moluscos. Sin embargo, a partir de este momento la búsqueda de plantas potencialmente molusquicidas se intensificó no sólo por el mayor número de ejemplares estudiados sino por el perfeccionamiento de los métodos y técnicas aplicados en la valoración (Kloos McCullough, 1982). En el continente asiático, específicamente en China se realizó un screnning más amplio con aproximadamente 600 plantas nativas, menos de 20 presentaron mediana toxicidad con valores de 10.000 ppm, por lo que no se consideraron para su uso a gran escala (Maegraith, 1958). En Brasil, Amorin Pessoa (1962) realizaron estudios aleatorios con nueve plantas indígenas del estado de Alagoas en Brasil, tres de ellas Paullinia pinnata L., Stenolobium velutinum Bentham y Piptadenia macrocarpa Bentham fueron medianamente molusquicidas (1000 ppm). A mediados de los años 60 se utilizó la primera planta, Phytolacca dodecandra L´Herit (Phytolaccaceae), para el control de la bilharzia, en una zona endémica en Etiopía. En este país las personas utilizaban los frutos de esta planta como sustituto del jabón. Por su parte, Lemma (1965) observó que en los sitios donde las personas lavaban su ropa utilizando los frutos, los caracoles morían. Silva y col. (1971) evaluaron 30 especies indígenas, cuatro fueron tóxicas sobre Biomphalaria straminea Dunker, pero solamente la corteza de Agonandra brasiliensis Bentham Hooker f. fue molusquicida a 100 ppm, no siendo práctico el uso de la planta para el control del molusco porque la corteza se regeneraba 12

102. lentamente. Este grupo de investigación no observó ninguna actividad con la corteza de Ziziphus undulata Reissek, pero Barbosa Mello (1969), reportaron 30% de mortalidad sobre B. glabrata, a una concentración de 10 ppm del extracto acuoso de Z. joazeiro Martius. En el noreste de Brasil, una revisión de 100 plantas, entre ellas Pithecellobium multiflorum (Kunt) Bentham y Piper tuberculatum Jacquin, presentaron actividad moluscocida (Kloos McCullough, 1982). Medina Woodbury (1979) estudiaron 198 plantas indígenas de Puerto Rico y dos de República Dominicana. Las plantas seleccionadas correspondían a géneros con actividad molusquicida conocida, plantas con efectos medicinales o tóxicos para el hombre y animales domésticos, y otras tomadas aleatoriamente de áreas infestadas con caracoles del género Lymnaea. De las 200 plantas ensayadas, los extractos acuosos de 30 de ellas fueron letales para L. cubensis Pfeiffer y L. columnella Say a 1000 ppm. El extracto de Hedychium coronarium J. Koenig fue el más potente en tanto que otras especies mostraron grandes variaciones; los niveles de toxicidad más altos se encontraron con mayor frecuencia en flores y hojas. Aunque el reducido número de especies ensayadas por Medina Woodbury (1979) no permite hacer una comparación entre las familias, la mayor proporción de plantas molusquicidas se encontró en las familias Solanaceae, Phytolaccaceae, Fabaceae, Rubiaceae y Euphorbiaceae. En los estudios sobre actividad moluscicida también se han observado contrastes y similitudes: en Puerto Rico, Jatropa curcas L. no tuvo efecto sobre Lymnaea sp., pero se reportó que sus raíces presentaron gran acción molusquicida en contra de Oncomelania quadrasi Gredler en Filipinas, mientras que con las semillas se observó actividad moderada sobre Bulinus truncatus Michaud en Sudan. Paullinia pinnata no fue tóxica para moluscos del género Lymnaea (Medina Woobury, 1979), pero causó total mortalidad a Biomphalaria glabrata (Amorin Pessoa, 1962). 13

103. Alzerreca y colaboradores (1981-1982), observaron que una mezcla de solasonina [6] y solamargina [7], componentes separados del fruto de Solanum mammosum L., fueron significativamente más tóxicos que los extractos crudos acuoso y metanólico, en contra de Lymnaea cubensis y Biomphalaria glabrata con una concentración letal (CL100) de 10ppm y 25 ppm, respectivamente. La tomatina [8] proveniente del Lycopersicon esculentum L. (tomate), presentó mejor actividad en contra de las dos especies de moluscos antes mencionadas, 10 ppm y 4 ppm. No obstante, las agliconas solasodina [10] y tomatidina [11], resultaron completamente inactivas. Cabe destacar TXH Į-solanina [9], tampoco presentó actividad, indicando que el cambio de la aglicona, solasodina [10] a solanidina [12] determinó este resultado (Figura II) (Hostettmann et al., 1982; Marston Hostettmann, 1985). HN O HN Nº COMPUESTO AGLICONA R [6] solasonina [10] 14 Glu-3Gal- 2 Ram [7] solamargina [10] 2 x Ram, Glc- [8] tomatina [11] Xil-3Glu-4Gal- 2 Glu [9] Į-solanina [12] Glu-3Gal- 2 Ram (Tomado y modificado de Marston Hostettmann, 1985) Figura II. Glicoalcaloides esteroidales con actividad molusquicida RO [10] solasodina: R=H O RO [11] tomatidina: R=H N RO [12] solanidina: R=H

104. Por otro lado, los productos de desecho de algunas plantas han reportado actividad contra los moluscos, por su contenido de saponinas (Marston Hostettmann, 1985). Así en Tanzania se observó que los desechos de la industria del sisal, Agave sisalana Perrine (Agavaceae), vertidos en los ríos, los mantenían libres de los moluscos transmisores de la esquistosomiasis. Aparentemente sin toxicidad para el ser humano, se propuso esta práctica como control, fomentándose el cultivo no sólo en ese país sino en Kenia y Brasil. Yucca shidigera Roezl ex Ortgies, otra especie de la familia Agaveceae, también ha reportado actividad molusquicida. Las hojas de chile (Capsicum frutescens L.) podrían ser una fuente de molusquicidas fácilmente disponible y económica. Un subproducto de la industria azucarera, la melaza, es fertilizante y también actúa contra los caracoles, hecho que se observó en los sistemas de irrigación donde era descargada, en un estado azucarero de Tanzania (Kloos McCullough, 1982). Los trabajos de campo son pocos, sin embargo, una de las especies estudiadas en este ámbito es Phytolacca dodecandra. En Etiopía, luego del hallazgo a mediados de los DxRVHOH[WUDFWRDFXRVRGHODVEDDVGH³HQGRG´VHDSOLFyHQSHTXHxRVODJRV canales, que servían de riego a cultivos de caña de azúcar, observándose resultados positivos en el control de moluscos. Esto permitió establecer un programa de control de esquistosomiasis en la población de Adwa al norte de Etiopía, durante cinco años; el programa fue existoso ya que en ese lapso de tiempo la infección con S. mansoni disminuyó. Además de la disponibilidad inmediata de la planta, ya que se adquirió en los mercados locales, el rendimiento fue comparable con el Bayluscide® (niclosamida) [4], siendo el único molusquicida sintético para el momento (Kloos McCullough, 1982; Marston Hostettmann, 1985). De acuerdo a los ensayos de laboratorio, la parte de la planta con mayor actividad son los frutos, altamente tóxicos para la mayoría de los huéspedes intermediarios de Schistosoma y Fasciola (Kloos McCullough, 1982). La actividad de P. dodecandra se le adjudica a las saponinas triterpenoidales: glicósidos del ácido 15

105. oleanólico, como la lemmatoxina C [13], lemmoglicotoxina A [14] y lemmatoxina [15]; glicósidos de la hederagenina [16] y bayogenina [17] (Figura III) (Marston Hostettmann, 1985). Su potencia se mantiene estable en un rango amplio de pH, temperatura, radiación ultravioleta y luego de su almacenamiento por un período mayor a cinco años, pero al igual que otras plantas y los molusquicidas sintéticos, son absorbidas por material suspendido. El endod no tiene acción sobre las masas de huevos de los caracoles a las concentraciones molusquicidas, lo que constituye una desventaja. En cuanto a la toxicidad de esta planta con respecto a otros organismos, existen opiniones encontradas con respecto a la acción sobre renacuajos, cercarias y miracidios de Schistosoma, peces, ranas y sanguijuelas. La toxicidad sobre mamíferos es comparable a otras plantas que contiene saponinas. Un ensayo preliminar como la irrigación de altas concentraciones a plantas locales en crecimiento no revela daño mutagénico. Sin embargo, la toxicidad crónica no ha sido estudiada adecuadamente (Kloos McCullough, 1982). Nº COMPUESTO R1 R2 16 Actividad (ppm) [13] lemmatoxina C Ram-2Glu-2Glu- H 3 (CL90) [14] lemmoglicotoxina A Glu-4Glu- 2 H 6 (CL100) Glu [15] lemmatoxina Glu-4Glu- 3 H 1,5 (CL90) Gal (Tomado y modificado de Marston Hostettmann, 1985) Figura III. Glicósidos triterpénicos con actividad molusquicida R1O COOR2 Ácido oleanólico: R1= R2= H

106. COMPUESTO R1 R2 17 Actividad (ppm) [16] Glu-4Glu- 2 Glu H 12 (CL100) COMPUESTO R1 R2 R3 Actividad (ppm) [17] Glu-4Glu- CH3 H 12 (CL100) (Tomado y modificado de Marston Hostettmann, 1985) R1O CH2OH COOR2 hederagenina: R1 = R2 = H COOR HO 3 R1O CH2OH R2 bayogenina: R1= R3= H, R2= CH3 Figura III. Glicósidos triterpénicos con actividad molusquicida (continuación) Por otro lado, a partir de 106 plantas de Nigeria se prepararon 181 extractos metanólicos, 23 de ellos causaron la muerte a la totalidad de los moluscos Bulinus globosus Morelet, a una concentración de 100 ppm. Este estudio incluyó la raíz de Cyrptogonone argentea (Pax) Prain, Rauwolfia caffra Sonder y Terminalia mollis M. A. Lawson; el tallo de Acioa emenii Aublet, la raíz y tallo de Bombax costatum Pellegrin Vuillet y de Combretum sp. Löfling; las hojas de Morinda lucida Bentham y Xiris anceps Lamarck y, los frutos de Dialium guineense Willdenow y Tetrapleura tetraptera Taubert. También se confirmó la actividad de Balanites aegyptiaca (Adewunmi Sofowora, 1980). Es importante considerar que cuando las partes de la planta que ofrecen actividad molusquicida son sólo raíces y tallos, la disponibilidad de las mismas estaría sujeta a la tasa de crecimiento, fuerza y trabajo necesario para su requerimiento. Otra situación es sí las secciones activas de las plantas son regenerativamente fructíferas (flores, hojas, frutos, semillas), haciendo

107. más fácil su cultivo, transporte y procesamiento para el aprovechamiento de sus propiedades (Kloos McCullough, 1982). Por más de 25 años se han realizado estudios con Ambrosia maritima L. (Asteraceae), una planta conocida en Egipto como damsissa, cuyo hábitat es el valle y delta del Nilo. Las flores y hojas presentan moderada actividad molusquicida, sin embargo los principios activos extraídos, ambrosina [18], damsina [19], ambos sesquiterpenos, poseen una alta actividad molusquicida (Figura IV). No se le atribuye toxicidad para el ganado vacuno y ovino, peces, ni para el ser humano ya que se han utilizado tradicionalmente los cocimientos e infusiones de las flores como diurético, antiespasmódico y para la hematuria causada por la infección con Schistosoma haematobium Bilharz. 18 O O O [19] damsina (Tomado de Marston Hostettmann, 1985) O O O [18] ambrosina Figura IV. Componentes aislados de Ambrosia maritima A pesar de que los ensayos de campo, a pequeña escala, indicaban cierta actividad moluscocida en aquellos canales de agua en los que la planta crecía, su uso en programas de control de moluscos se limitó debido a razones de orden ecológico. La escasa presencia de la planta en tierras con elevado contenido de sales y el hecho de considerarla perjudicial para el cultivo del pasto para el ganado determinó su reducción. Por otra parte, el alto costo en la extracción de los principios activos y su

108. inestabilidad en ensayos de campo frente a la alta incidencia de moluscos en extensas zonas de irrigación determinaron la poca utilidad en el control de los mismos (Kloos McCullough, 1982; Marston Hostettmann, 1985). El Anacardium occidentale L. (Anacardiaceae) es un árbol nativo de Brasil, introducido en India, Indonesia y sureste de Asia, cuenta con un gran valor económico y medicinal. El líquido de la cáscara de la nuez del merey (LCNM o CNSL) constituye una de las principales fuentes naturales de lípidos fenólicos no isoprenoides tales como ácidos anacárdicos [20] (Figura V), cardoles, cardanoles, metilcardoles y polímeros. Este líquido se utiliza comercialmente en la manufactura de ciertas resinas y plásticos que tienen propiedades eléctricas y de fricción poco comunes. También se le adjudican propiedades biológicas como larvicida, antifúngica, antibacteriana y molusquicida. (Dos Santos De Magalhaes, 1999; Rajesh et al., 2009). Con respecto a la acción moluscocida de este líquido existen pruebas preliminares que realizaron Pereira De Souza (1974), en las que los extractos hexánicos de la cáscara del fruto fueron letales para Biomphalaria glabrata. Luego Suillivan y colaboradores (1982), ensayaron la toxicidad de los ácidos anacárdicos insaturados frente a B. glabrata, siendo el componente trieno el más activo (CL50 0,35 ppm); los componentes dieno y monoeno fueron menos tóxicos para el molusco (CL50 0,9 ppm y CL50 1,4 ppm) y el componente saturado presentó menor toxicidad (CL50 ! 5 ppm) (Figura V). Esta diferencia indica que la cadena lateral insaturada juega un papel importante en la actividad molusquicida. Dada la potente acción del líquido extraído de la cáscara también se han llevado a cabo investigaciones de campo en Mozambique, a pesar que estos constituyentes causan dermatitis en humanos (Marston Hostettmann, 1985). En varias zonas endémicas existen plantas que además de ser comestibles han presentado actividad molusquicida, para ello las poblaciones rurales las han 19

109. combinado con el fin de conseguir mejores resultados. Un ejemplo lo constituye la acción conjunta de las hojas de Dichrostachys glomerata Chiobenda (Leguminosae), cuyos frutos se comen en Africa tropical, las hojas de Lophira alata Banks ex C.F. Gaertner, apreciada por el aceite de sus nueces y las hojas de Ximenia americana L., un arbusto que produce frutos que también se consumen en Africa. 20 COOH aa Nº COMPUESTO (R) ACTIVIDAD (ppm) (CL50) (CL90) [20] trieno (C15 : 3) 0,35 0,7 dieno (C15 : 2) 0,90 1,4 monoeno (C15 : 1) 1,40 1,9 saturado (C15 : 0) 5 5 (Tomado y modificado de Marston Hostettmann, 1985) OH R [20] ácidos anacárdicos Figura V. Actividad molusquicida de los ácidos anacárdicos aislados de Anacardium occidentale Los árboles de la familia Leguminosae como Acacia Miller, Pithecellobium Martius, Parkia Brown y Prosopis L. son plantas alimenticias de gran valor en climas semiáridos, debido al contenido proteico de sus semillas, la resistencia frente a la sequía y el cuidado mínimo para cultivarlas. Ellas también han presentado actividad en contra de moluscos. Esta complementaridad entre valor alimenticio y actividad molusquicida de determinadas especies vegetales, puede ser muy notoria pero a la vez poco probable de ser aprovechada principalmente para el control de moluscos en zonas donde son una fuente de alimento o se les considera sagradas (Kloos McCullough, 1982).

110. Existen plantas a las que se les reconocen varias propiedades, una de ellas Azaridacta indica A. Juss (Meliaceae), utilizada desde hace mucho tiempo en agricultura, en la industria y en medicina. Al neem se le adjudican varias propiedades, destacando su uso como antiinflamatorio, antipirético, antihelmíntico, antimalárico, antidiabético, antiulceroso, antimicrobiano; varias de ellas tienen correlación con los resultados encontrados en investigaciones (Van der Nat et al., 1991). La actividad molusquicida también se ha evaluado en esta planta. Las hojas, corteza y el aceite demostraron actividad en contra de los caracoles Lymnaea acuminata Lamarck e Indoplanorbis exustus Deshayes. El efecto tóxico de azadirachtina [21] (CL50 0,35 mg/L; 24 h; L. acuminata) fue mayor que los molusquicidas sintéticos (niclosamida [4]; CL50 11,8 mg/L; L. acuminata) (Figura VI) (Sing Agarwal, 1984; Singh et al., 1996 Dahanukar et al., 2000). CO2Me OH O AcO OH [21] azadirachtina 21 O (Tomado de Van der Nat et al., 1991) MeO2C O O O HO O O H H Figura VI. Componente aislado de Azaridachta indica Dentro de la familia Euphorbiaceae la actividad molusquicida también ha sido objeto de estudio, varía de unas especies a otras y entre las diferentes partes de una misma planta (Al-Zanbagi et al., 2000). Los extractos de plantas como Croton macrostachys Hochstetter ex A. Richard, Croton tiglium L. y Euphorbia royleana Boissier, han reportado una marcada actividad contra caracoles acuáticos (Zani et al., 1993). Las

111. pruebas con el látex de Euphorbia tirucalli L. demostraron actividad contra Biomphalaria glabrata a una CL90 de 85 ppm (Jurberg et al., 1985). En un reporte de Mendes y colaboradores (1984), se expone la actividad de los extractos hexánicos y etanólicos de varias plantas, entre ellas Euphorbia splendens var. hislopii N.E.B. [Sin. Euphorbia milii Des Moulins. var splendens (Hook) Ursch Leandri] (Carter 1994), destacándose por la acción moluscicida y ovicida de hojas, tallos y corteza, a una concentración letal de 100 ppm. E. splendens es originaria de Madagascar, se ha clonado en zonas tropicales y subtropicales, se le conoce como corona de Cristo, corona de espinas y es fácilmente cultivable en macetas y jardines. Se le considera como una de las plantas molusquicidas más interesantes estudiadas hasta el momento, dado que su látex también tiene actividad contra moluscos hospederos intermediarios de trematodos como Biomphalaria glabrata, B. tenagophila Orbigny, B. pfeifferi Krauss (De Vasconcellos Schall, 1986; Schall et al., 1998), Bulinus sp. (Schall et al., 1998) y Lymnaea columella, tanto en condiciones de laboratorio como de campo (De Vasconcellos Schall, 1986; De Vasconcellos Amorim, 2003a,b). Por ejemplo, para Biomphalaria glabrata y B. tenagophila, el látex de esta planta presentó una concentración letal (CL90) menor a 0,5 ppm en pruebas de laboratorio y no más de 4 ppm en los ensayos de campo realizados por De Vasconcellos Schall (1986). Posteriormente, en el fraccionamiento fitoquímico de E. milii L. se aislaron ocho diterpenos a partir de las fracciones activas del látex. Uno de ellos denominado milliamina L [22] resultó más activo en contra de Biomphalaria glabrata [CL100 = 2,5 μgL-1, 24 h] que la niclosamida [5] (CL100 = 0,25 mgL-1, 24 h), empleada para el control del caracol (Figura VII) (Zani et al., 1993). 22

112. O [22] milliamina L 23 (Tomado de Zani et al., 1993) H N NH2 O O O O OH HO Figura VII. Componente aislado de Euphorbia splendens (E. milli) De acuerdo con determinados criterios de evaluación, los resultados fueron favorables para E. splendens var. hislopii (E. milii), lo que permitió que el Instituto Oswaldo Cruz, obtuviera una patente de biotecnología con respecto al método de recolección, extracción y aplicación del látex, como moluscicida (Fiocruz, 2000; Mello-Silva et al., 2006). La especie de E. milli que se encuentran en Tailandia, se cree que fue introducida por los inmigrantes chinos y a lo largo del tiempo han surgido varias especies híbridas. Los ensayos del látex de 12 híbridos, frente Indoplanorbis exustus, permitieron conocer que la efectividad sobre este molusco varía de un híbrido a otro. Los mejores resultados se obtuvieron con E. milli Dang-udom con CL50 de 18 ppm y CL90 de 20,5 ppm, en 48 horas (Bunguorn et al., 2005). Subsecuentes estudios con E. splendens (E. milii) han permitido identificar los efectos del látex en función de la concentración subletal (CL50) o de la dosis subletal media (DL50), determinando concentraciones de glucosa, ácido úrico y proteínas totales en la hemolinfa y glicógeno tanto en la glándula digestiva como en la masa cefalopodal, en contra de Biomphalaria glabrata sanos (Mello-Silva et al., 2006) e

113. infectados con S. mansoni (Mello-Silva et al., 2010). Del mismo modo se ha evaluado la actividad reproductiva, observando la interferencia del látex en la ovipostura y maduración de los huevos (Mello-Silva et al., 2007) En Arabia Saudita, Al-Zanbagi y col. (2000), prepararon varios extractos de Jatropha glauca Vahl, Euphorbia helioscopia L. y Euphorbia schimperiana Hochstetter ex A. Richard con diferentes solventes. Los extractos metanólico y clorofórmico, del material botánico seco, fueron los más efectivos frente a Biomphalaria pfeifferi, con valores para la DL50 en un rango de 7,6 a 50,8 ppm y para la DL90 de 11,8 a 68,2 ppm. Esta actividad es mayor que la reportada para Jatropha aceroides Hutchinson, J. aethiopica Müller Argoviensis, J. curcas L. y J. gossypifolia L. (El-Kheir El- Tohami, 1979; Singh Agrawal, 1990, 1992 a,b). Singh y colaboradores (2004), evaluaron las propiedades molusquicidas de varios extractos del látex de Euphorbia pulcherima Willdenow ex Klotzsch y Euphorbia hirta L., dos plantas medicinales de India, en contra de dos caracoles L. acuminata e I. exustus, ambos hospederos intermediarios de Fasciola hepatica y F. gigantica Cobbold, causantes de la fasciolasis en ganado vacuno y otros animales al norte de India. Los autores verificaron que los extractos de látex con diferentes solventes tuvieron mayor actividad que algunos de los molusquicidas sintéticos tipo carbamato, organofosfato y piretroides sintéticos. El extracto acuoso del látex de plantas como Thevetia peruviana (Persoon) K. M. Schumann y Alstonia scholaris (L.) R. Brown, de la familia Apocinaceae, presentaron gran actividad tóxica en los caracoles L. acuminata e I. exustus, mayor que los molusquicidas sintéticos usados comúnmente (Singh Singh, 2005). También ha sido objeto de estudio el Croton campestri Saint-Hilaire, utilizado tradicionalmente como purgante, en afecciones de los conductos biliares y en el tratamiento de sífilis. El extracto en diclorometano de la corteza de las raíces fue 24

114. evaluado sobre B. truncatus, huésped intermediario de S. haematobium, presentando actividad a una concentración de 20 ppm. Tres fracciones también mostraron efectos molusquicidas, cada una de ellas con diferentes proporciones de los diterpenos: velamona [23], acetato de velamolona [24] y velamolona [25] (Figura VIII). Estos diterpenos fueron aislados y presentaron una actividad del 100% a 3ppm, 6 ppm y 20 ppm, respectivamente (El Babili et al., 2006). Nº COMPUESTO R [23] velamona Me [24] acetato de velamolona CH2OAc [25] velamolona CH2OH 25 (Tomado de El Babili et al., 2006) R O Figura VIII. Compuestos aislados de Croton campestri O Medina y colaboradores (2009) describieron la actividad molusquicida contra Biomphalaria glabrata de varios extractos de hojas y corteza de Croton floribundus Sprengel. Todos los extractos presentaron alta actividad molusquicida, pero el extracto metanólico de la corteza mostró mayor actividad contra los moluscos (CL50 4,2 ppm y CL90 11,5 ppm). El ácido kaurenóico [26], aislado de la corteza de esta planta también presentó actividad contra B. glabrata, con valores de CL50 1,16 ppm y CL90 4,28 ppm. Este compuesto también tuvo actividad contra cercarias de S. mansoni, ocasionando la muerte del 99,5% de los organismos en 30 minutos a una concentración de 10 ppm. En esta investigación también se realizaron ensayos con dos derivados del ácido kaurenóico [26] para estudiar la relación de la estructura con la actividad molusquicida. Tanto el ácido 16-metoxi-ent-kauran-19-óico [27] como el ent-kaur-16-en-19-oato de metilo [28], fueron evaluados a concentraciones de 2 y 10 ppm; el compuesto [27] mostró actividad similar al ácido kaurenóico [26], mientras que el compuesto [28], no exhibió ninguna actividad. Estos resultados podrían indicar

115. que la presencia del grupo ácido (-COOH) tiene una importante relación con la actividad molusquicida del compuesto original [26] (Figura IX). [27] ácido 16-metoxi-ent-kauran-19-óico 26 OCH3 CH3 H3C COOCH3 [28] ent-kaur-16-en-19-oato de metilo (Tomado y modificado de Medina et al., 2009) CH3 H3C COOH [26] ácido kaurenóico CH3 H3C COOH CH3 Figura IX. Compuesto aislado de Croton floribundus. Derivados del ácido kaurenóico Por otro lado, Sarmento et al. (2006) seleccionaron cinco especies del género Solanum L. del noreste de Brasil, Solanum agrarium Sendtner, S. jabrense Agra M. Nee, S. megalonyx Sendtner, S. melissarum Bohs, S. stipulaceum Broussonet ex Roemer Schultes y dos especies de la selva Atlántica, S. paludosum Dunal y S. paraibanum Agra, para estudiar sus propiedades molusquicidas en contra de B. glabrata. Los resultados indicaron que seis de ellas exhibieron actividad, pero los valores de CL90 de S. jabrense y S. stipulaceum indican que sus extractos pueden emplearse en el control de la schistosomiasis, especialmente en el noreste de Brasil, donde las plantas y la enfermedad son endémicas. Los aceites esenciales de Eucalyptus camaldulensis Dehnh (Myrtaceae), Mentha microphylla Koch (Labiatae) y Lantana camara L. (Verbenaceae) fueron probados contra los caracoles terrestres, Theba pisana Müller y Eobania vermiculata Müller, responsables de daño en plantas ornamentales, vegetales y árboles cítricos. Los aceites esenciales de L. camara y M. microphylla mostraron pronunciada actividad molusquicida frente a T. pisana, siendo el aceite de L. camara el que posee mayor

116. actividad comparado con el metomilo [5] como compuesto de referencia (Abdelgaleil Badawy, 2006). Azare y colaboradores (2007) investigaron la Alternanthera sessilis (L.) R. Brown ex De Candolle, planta indígena del oeste de Africa, perteneciente a la familia Amaranthaceae, para evaluar la actividad frente a B. globosus, hospedero intermediario del S. haematobium. Tanto el extracto crudo acuoso de las hojas secas como el de las hojas frescas, exhibió potente actividad molusquicida. En un estudio biodirigido se demostró que el extracto en éter de petróleo de las partes aéreas de Artemisia judaica L. y el extracto clorofórmico de las semillas de Simmondsia chinensis (Link) Schneider, conocida como jojoba, poseen un razonable potencial molusquicida contra el caracol terrestre Eobania vermiculata Müller (0,18 y 0,39 mg/caracol). Los compuestos aislados del aceite esencial de A. judaica, piperitona [29] y trans-cinamato de etilo [30] presentaron una marcada actividad molusquicida con DL50 de 0,067 mg/caracol y 0,055 mg/caracol, respectivamente (Figura X). Los principios activos aislados de S. chinensis mostraron baja toxicidad (Abdelgaleil et al., 2007). Extractos crudos acuoso y etanólico de diferentes partes de Dalbergia sissoo Roxburg (Leguminosae), fueron evaluados en contra de las masas de huevos y adultos de Biomphalaria pfeifferi, el caracol, hospedero intermediario de S. mansoni, en Nigeria. Sólo los extractos crudos etanólicos de las frutos y raíces mostraron actividades significativas contra los caracoles adultos (valores de CL90 100 mg L-1: 74,33 y 93,93 mgL-1) y toxicidad con respecto a sus masas de huevos (CL90: 89,29 y 114,29 mgL-1) (Adenusi Odaibo, 2008). Los extractos de las hojas de Hammada scoparia (Pomel) Iljin, familia Chenopodiaceae, fueron ensayados sobre el molusco Galba truncatula Müller, uno de los intermediarios de Fasciola hepatica en Tunisia. De acuerdo a los resultados 27

117. obtenidos la actividad molusquicida de los extractos se correlaciona con la presencia de alcaloides. El extracto metanólico reportó una significativa actividad (CL50= 28,93 ppm), según los lineamientos establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Del fraccionamiento de dicho extracto, predominaron dos isoquinolinas, carnegina [31], y N-metilisosalsolina [32], la última presentó mayor actividad contra los caracoles (CL50 = 0,47 μM) comparada con el cloruro de cobre (Figura X) (Mezghani et al., 2009). En la evaluación de la actividad moluscocida de los extractos metanólicos de flores y frutos de Meryta denhamii Seemann frente a Lymnaea natalensis Krauss y Biomphalaria alexandrina Ehrenberg, los efectos fueron similares sobre los caracoles Biomphalaria, con una DL50 de 85 mg/L, tanto con las flores como con los frutos. Los valores de DL50 para L. natalensis fueron 72,4 y 100 mg/L, para flores y frutos, respectivamente. Además, en los caracoles expuestos a la fracción más activa (flores), fueron estimados parámetros bioquímicos: concentración de glucosa y contenido proteico, tanto en tejido como en hemolinfa, y glicógeno sólo en tejido (Hassan et al., 2010). H3CO H3CO (Tomado de Abdelgaleil et al., 2007; Mezghani et al., 2009) Figura X. Componente aislado de Artemisia judaica y Hammada scoparia 28 O [29] piperitona O O [30] trans-cinamato de etilo N CH3 CH3 HO [32] N-metilisosalsolina N CH3 CH3 H3CO [31] carnegina

118. También se han llevado a cabo ensayos con Spirulina platensis (Nordstedt) Geitler, una microalga verde-azul conocida por su contenido en proteínas, vitaminas, minerales y otros nutrientes (Henrikson, 1994). Su cultivo mostró efecto letal sobre Biomphalaria alexandrina, con CL90 0,23%. También fue notable la falta y disminución de la oviposición a concentraciones de 0,19% y 0,07%, luego de una semana de exposición. Asimismo se observó su acción sobre miracidios y cercarias, al 2% durante 15 minutos de exposición (Mostafa Gawish, 2009). Se han presentado algunas investigaciones que evidencian la actividad moluscocida de varias especies de plantas pertenecientes a diversas familias, de las cuales se reportan distintos valores que, en mayor o menor grado, denotan la utilidad de las mismas en el control de moluscos de importancia médica, dado su rol como huéspedes intermediarios que intervienen en la transmisión de ciertas enfermedades parasitarias. A continuación se describen algunas pruebas para la evaluación de la actividad molusquicida de extractos vegetales, látex o compuestos puros. 29

119. Capítulo III EVALUACIÓN DE LAS ACTIVIDADES DE EXTRACTOS Y COMPUESTOS AISLADOS DE PLANTAS SOBRE MOLUSCOS En las evaluaciones de toxicidad aguda, los parámetros más empleados son la concentración letal media o subletal (CL50) y concentración letal (CL90), expresadas en ppm (mg L-1 o μg mL-1 ) o en porcentaje (%); la dosis letal media o subletal (DL50) y dosis letal (DL90), dadas en unidades de mg, μg kg-1 o mg/caracol, entre otros (Iannacone Alvariño, 2005; Abdelgaleil et al., 2007; Mezghani-Jarraya et al., 2009; Mostafa Gawish, 2009). No obstante, varios autores utilizan ambos términos como sinónimos (De Vasconcellos Schall, 1986; Lima et al., 2002; Dos Santos et al., 2003; Mello-Silva et al., 2006; Hevia et al., 2008). Estos parámetros se determinan a través de la aplicación de métodos estadísticos y/o programas computarizados (Finney, 1971; Mello-Silva et al., 2007; Mostafa Gawish, 2009). EVALUACIÓN DEL EFECTO MOLUSQUICIDA: PRUEBA DE INMERSIÓN Pautas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) La evaluación de la actividad moluscocida se lleva a cabo, principalmente, de acuerdo a los lineamientos planteados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (WHO, 1965; 1983). En un ensayo simple los caracoles, Biomphalaria glabrata por ejemplo, son colocados en una solución o suspensión que contiene el extracto y/o compuesto a ensayar en agua destilada. Los caracoles se consideran muertos cuando no se observan los latidos del corazón a través de un microscopio. La acción tóxica de los extractos y/o compuestos se cuantifica mediante los parámetros concentración letal (CL90), concentración subletal (CL50), expresados en partes por millón (ppm) 30

120. (Marston Hostettmann, 1985) o como porcentaje (%) de mortalidad de los moluscos (Mostafa Gawish, 2009). A continuación se exponen las pautas que permiten calificar a una planta como molusquicida, según lo expresado por Marston y Hostettmann (1985): 1. La actividad moluscocida debe ser alta. El extracto crudo deberá tener una actividad a concentraciones inferiores a 100 ppm. La actividad de los molusquicidas sintéticos más fuertes están por el orden de 1 ppm; como el Trifenmorf® [2], con una concentración letal (CL100) de 0,25 ppm, frente a B. glabrata, después de 24 h de exposición. Por lo tanto, para que los compuestos separados de plantas moluscocidas compitan con los productos sintéticos, los valores de CL100 deberían estar alrededor de esa magnitud (1 ppm) y aún mejor, si además tiene acción ovicida. 2. La planta debe crecer en forma abundante en la zona endémica, ya sea de forma natural o fácilmente cultivada. Es de gran valor que la parte usada de la planta sea de fácil regeneración, como frutos, hojas y flores, ya que utilizar raíces y tallos conducen a la destrucción de la misma. 3. La extracción de los principios activos con agua facilita el proceso comparado con el costo de los solventes orgánicos y de aparatos adicionales para la extracción, reduciendo la utilización en programas de control. 4. Los procesos de aplicación deben ser fáciles y seguros para el operador, además las formulaciones y condiciones de almacenamiento deben ser simples. 5. El extracto de la planta o principio activo molusquicida debe poseer baja toxicidad para los organismos diferentes al blanco, incluyendo al hombre. Conseguir compuestos selectivos sería una gran ventaja. 6. Los ensayos de campo determinarían la efectividad, estabilidad y el impacto en 31 el medio ambiente.

121. 32 Determinación de Parámetros La actividad molusquicida se evalúa mediante la determinación de las dosis media o subletal (DL50) y máxima o letal (DL90) (Piña et al., 1998; Abdelgaleil et al., 2007) o, concentraciones media o subletal (CL50) y letal o máxima (CL90) (Mostafa Gawish, 2009) del extracto, látex o compuesto puro. Las siguientes son algunas consideraciones con respecto a la prueba de inmersión: 1. Los ensayos se realizan con gran variedad de moluscos adultos (Cruz et al., 1989), generalmente, con especies de los géneros Biomphalaria, Bulinus, Lymnaea e Indoplanorbis, hospederos intermediarios de Schistosoma sp. y Fasciola sp. El género Oncomelania huésped de S. japonicum tiene hábitos anfibios planteando dificultad para las pruebas (Marston Hostettmann, 1985; Singh et al., 1996). 2. Los caracoles adultos pueden ser tomados del campo (lagos, drenajes, canales de agua) y aclimatados en el laboratorio de dos a cuatro días antes de iniciar las pruebas (Singh Singh, 2005; Mezghani et al., 2009). También se utilizan ejemplares de colonias mantenidas en laboratorio (Kubo et al., 1992; Laurens et al., 1997). Además de moluscos adultos, algunos autores evalúan esta actividad con caracoles jóvenes (1-3 días de nacidos) (Schall et al., 1998). 3. El número de moluscos para cada concentración es variable, pueden utilizarse de dos a diez (Kubo et al, 1986; Cruz et al., 1989; Schall et al., 1998; Al- Zanbagi et al., 2000; Sarmento et al., 2006). 4. En los ensayos se utilizan diferentes rangos de concentración, según sean extractos o compuestos puros. Por ejemplo, Al-Zanbagi y colaboradores (2000), manejaron concentraciones de 10 a 100 ppm para extractos. En los ensayos molusquicidas de varias saponinas utilizaron concentraciones de 2, 4, 8, 16 y 32 ppm (Hostettmann et al., 1982). Schall y colaboradores (1998), manejaron otra serie de concentraciones para la evaluación del látex de Euphorbia splendens var. hislopii: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5

122. 33 y 4 ppm. 5. El molusquicida de referencia más utilizado es niclosamida (Bayluscide®) [4], aunque también se emplean otros compuestos sintéticos como dicloruro de cobre (CuCl2), carbonato cúprico (CuCO3), entre otros (Lima et al., 2002; Azare et al., 2007; Mezghani-Jarraya et al., 2009). Sin embargo, en algunos ensayos no utilizan ningún molusquicida como control positivo (Schall et al., 1998; Bunguorn et al., 2005; Mostafa Gawish, 2009). 6. Los caracoles no se alimentan durante el tiempo de exposición con el extracto, látex o compuesto (Schall et al., 1998; Bunguorn et al., 2005). Aunque algunos autores si suministran alimento durante el curso del experimento (Abdelgaleil et al., 2007). 7. En la mayoría de las pruebas, el tiempo de exposición es de 24 horas, luego de ese lapso se registran las observaciones inmediatamente o cada 24 horas hasta un máximo de 96 horas (Laurens et al., 1997; Piña et al., 1998; Singh et al., 2004; Bunguorn et al., 2005; Mezghani-Jarraya et al., 2009). Sin embargo, existen protocolos donde los moluscos pueden estar en contacto con el extracto o compuesto a ensayar seis horas (Cruz et al., 1989), 48 horas (Mezghani- Jarraya et al., 2009), 72 horas (Piña et al., 1998), 96 horas (Singh et al., 2004) y exposición continua durante 04 semanas (Mostafa Gawish, 2009). 8. El principal criterio para declarar la muerte de los moluscos es el cese de la actividad cardíaca chequeada por un microscopio (Hostettmann et al., 1982; Sullivan et al., 1982). Aunque también se toma en cuenta la ausencia de la concha en los caracoles, falta de contracción del cuerpo dentro de la concha, cambio de color o decoloración de la concha, falta de sensibilidad al tocarlos con una aguja, no responden ante la presencia de comida o un desagradable olor (Lima et al., 2002; Bunguorn et al., 2005; Mezghani-Jarraya et al., 2009; Sharma et al., 2009; El-Kamali et al., 2010). 9. El número de repeticiones de esta prueba es variable; por duplicado (Azare et al., 2007), triplicado (Mostafa Gawish, 2009), cinco réplicas (Mezghani- Jarraya et al., 2009), sextuplicado (Singh et al., 2004).

123. 10. Las determinaciones de DL50, DL90 o CL90 también se llevan a cabo con otros invertebrados y peces que habitan los mismos ambientes de las especies de caracoles. Asimismo son importantes los estudios de campo (Cruz et al., 1989; Singh et al., 2004; Singh Sinhg, 2005). 34 ACTIVIDAD OVICIDA Determinación de las dosis subletal (DL50) y letal (DL90) con acción ovicida. 1. Colectar masas de huevos de las paredes de los acuarios o de láminas de plástico que estén dentro de los mismos, de 0 a 1 día después de su oviposición. 2. Para cada concentración (50, 200, 400, 800, 1000, 1500 y 2000 ppm) se coloca el mismo número de masas de huevos (04), cada una con 15 a 40 embriones, por un lapso de 96 horas. 3. Cada 24 horas, hasta un total de 96 horas, cada embrión en cada masa de huevos se observa por medio de un microscopio binocular. Los embriones se consideran muertos si se tornan opacos o se disgregan. 4. Para verificar la viabilidad de los embriones se utilizan dos controles uno con un molusquicida sintético y otro con el solvente del extracto, látex o compuesto a ensayar. 5. Los parámetros se determinan aplicando métodos estadísticos como el análisis Probit (Schall et al., 1998; Lima et al., 2002). Evaluación de la influencia de la dosis subletal (DL50) en los parámetros reproductivos. 1. Determinado número de caracoles se expone a la dosis letal media (DL50) del extracto, látex o compuesto, por un lapso de tiempo, 24 h, por ejemplo. Un número equivalente de especímenes se toma como grupo control.

124. 2. Posteriormente los moluscos se lavan y se dividen en varios grupos de acuerdo al número de réplicas que se planifiquen. 3. Los caracoles se observan al microscopio, semanalmente hasta cinco (05) semanas para registrar número de caracoles vivos, número de masas de huevos depositados por caracol, número de huevos/masa de huevos, número de huevos puestos/caracol y número de caracoles nacientes/semana (Mello-Silva et al., 2007). 35 PRUEBAS BIOQUÍMICAS Valoración de la influencia de las concentraciones letal (CL90) y subletal (CL50) en algunos parámetros bioquímicos. Algunas pruebas permiten evaluar los efectos de extractos, látex y/o compuestos sobre los moluscos, mediante la estimación de los parámetros bioquímicos como concentración de glucosa, ácido úrico, úrea y contenido proteico, tanto en hemolinfa como en tejido, y determinación de glicógeno sólo en tejidos: glándula digestiva y masa cefalopodal (Mello-Silva et al., 2006; Hassan et al., 2010). A continuación algunas notas con respecto a estas pruebas: 1. Los moluscos se exponen a las concentraciones letal (CL90) y/o subletal (CL50) del extracto, látex o compuesto, por 24 horas y una vez por semana hasta cuatro semanas. Igual número de caracoles se utiliza como grupo control (Hassan et al., 2010; Mello-Silva et al., 2010). 2. Luego de cada exposición se extrae la hemolinfa por punción cardíaca, se transfiere a microtubos y mantiene a -10 °C hasta su uso para la determinación de glucosa, ácido úrico y úrea, utilizando kits diagnósticos de laboratorios. Estos valores se expresan en mg/dL (Mello-Silva et al., 2010). 3. Luego de la disecación de los caracoles se separan la glándula digestiva y la masa cefalopodal, se pesan y refrigeran para la determinación de glicógeno por la reacción con el ácido 3,5-dinitrosalicílico (ADNS). La concentración de

125. glicógeno se expresa en mg de glucosa/g de tejido (Sumner, 1924; Pinheiro Gomes, 1994; Mello-Silva et al., 2006; Mello-Silva et al., 2010). 4. Tanto la hemolinfa como los tejidos se mantienen en baño de hielo durante los procedimientos de recolección (Mello-Silva et al., 2010). 5. Para la determinación de proteínas totales se utiliza la técnica descrita por 36 Lowry y colaboradores (1951). 6. Con los métodos que emplean reacciones colorimétricas deben realizarse varias lecturas en el espectrofotómetro (Mello-Silva et al., 2006). 7. Los parámetros bioquímicos también se determinan para el grupo control (Hassan et al., 2010). ACTIVIDAD MIRACIDICIDA Y CERCARICIDA Esta actividad permite investigar la acción de los extractos sobre miracidios y cercarias de S. mansoni, por ejemplo. Para ello se toman en cuenta las siguientes consideraciones: 1. Los huevos de S. mansoni y miracidios recién eclosionados se lavan y mantienen en agua desclorinada a 25 °C, antes de la prueba. 2. Las cercarias se recolectan en pequeñas cantidades de agua libre de cloro y se utilizan directamente después de expulsadas del caracol. 3. Los miracidios y cercarias se exponen a las diferentes concentraciones de extracto, en un volumen de 5 a 10 mL. Igual número de miracidios y/o cercarias se colocan en 10 mL de agua libre de cloro, para los respectivos grupos control. 4. Después de la exposición (15, 30 y 60 minutos) se realizan las observaciones al microscopio para chequear los movimientos y mortalidad de los miracidios y cercarias. Se deben tener en cuenta las réplicas para cada prueba. 5. La falta de movimiento de dichas formas evolutivas se utiliza como criterio de mortalidad (Medina et al., 2009; Mostafa Gawish, 2009).

126. 37 OTRAS PRUEBAS También se efectúan otros ensayos como valoración de la estabilidad del extracto, látex o compuesto en el agua, influencia del pH, absorción por el suelo, efecto de la temperatura, efecto en el ecosistema, efecto de la variedad, estación y sitio de recolección de la planta (Jurberg et al., 1989).

127. CONCLUSIONES Diversos países, dadas las condiciones socio-económicas, se encuentran afectados por una gran cantidad de enfermedades parasitarias. Algunas de ellas son causadas por trematodos, como Schistosoma sp. y Fasciola sp., que requieren de hospederos intermediarios para alcanzar su estado adulto. Dichos huéspedes son moluscos gástropodos, por lo que el control de los mismos, junto con una adecuada quimioterapia y saneamiento ambiental, son determinantes en la lucha contra estas parasitosis, que atacan tanto al hombre como animales de producción. Las acciones de control incluyen medidas de orden biológico, ecológico y químico. Atendiendo a esta última, los productos de origen sintético con acción molusquicida han sido utilizados durante años y aún continúan empleándose, no obstante, estos productos son caros, ocasionan severos daños al ecosistema, requieren ser aplicados por personal especializado y su acción no es específica generando toxicidad a otros organismos. Estos hechos han conducido las investigaciones hacia la búsqueda de agentes molusquicidas a partir de las plantas. Los ensayos desarrollados a nivel de laboratorio y de campo, han arrojado resultados meritorios no sólo con extractos crudos sino con compuestos puros, obtenidos de partes regenerativas de las plantas, que muestran actividades a concentraciones por debajo de 100 ppm, con muy poca o ninguna toxicidad sobre otros organismos. Adicionalmente, las plantas podrían cultivarse con facilidad, considerando viable su uso en el control de los moluscos a nivel de las comunidades afectadas; todo ello de acuerdo con los lineamientos de la Organización Mundial de la Salud, producto de la recopilación y discusión de los alcances de las investigaciones a lo largo de varios años. 38 .

128. AGRADECIMIENTO A la Dra. Nieves Elsa, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes-Venezuela por la revisión de esta publicación previa a la evaluación de la actividad molusquicida de algunos extractos y/o compuestos de origen vegetal. 39

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