Este documento describe diferentes técnicas de observación microscópica de muestras biológicas, incluyendo observación en fresco, tinción simple, tinción diferencial y tinción especial. La observación en fresco permite ver características como movilidad y división celular sin alterar la morfología, mientras que las tinciones usan colorantes para mejorar el contraste y distinguir entre tipos de microorganismos. Algunas tinciones comunes son la tinción de Gram, tinción de Ziehl-Neelsen y tinción de esporas.

1. TECNICAS DE OBSERVACIÓN
MICROSCOPICA

3. 1. Observación en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:
• La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen.
• Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
• Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la
división celular
• Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones
celulares como vacuolas y materias grasa.
2. Observación con tinciones
• Para observar las características morfológicas de las bacterias
• Identificación y diferenciación de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tinción diferencial o selectiva).
Lunes
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

4. 1. Observación en fresco
•preparación en fresco simple
•preparación en gota pendiente
2. Observación con tinciones
•Tinción simple: un solo colorante.
•Tinción diferencial: más de un colorante
•Tinción especial
Tinción negativa: colorea el medio que rodea a la
bacteria permaneciendo ésta sin teñir.
Lunes
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

5. Porta objeto
Muestra
1. Colocar una gota de SSF o
agua en un porta
2.- Tomar la muestra con el asa
de siembra o un gotero
Procedimiento para un preparado en fresco
("entre porta y cubre")

6. Observación microscópica
1. Observación en fresco
 Bacterias: Leptospiras, treponemas (M.
campo oscuro)

7. Observación microscópica
1. Observación en fresco : (SSF)
 Parásitos : Trofozoitos, larvas.

8. Observación microscópica
1. Observación en fresco
 Hongos: Levaduras

9. Observación microscópica
1. Observación en fresco con modificaciones
 Hongos
 NaOH 10% (hifas)

10. Procedimiento para un preparado en fresco
en gota pendiente

11. 2. TINCIONES O COLORACIONES

13. COLORANTE: DEFINICIÓN
• Son compuestos orgánicos que tienen alguna
afinidad específica por algún componente.
• Los colorantes son compuestos químicos
utilizados para aumentar el contraste

14. COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: más comúnmente usados
 básicos: Consisten en un catión coloreado unido a un anión
incoloro. Tiñen la célula bacteriana uniformemente (ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos )
 (cromatina nuclear de pro y eucariotas)
 (más usados en citología bacteriana).
• Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica,
el cristal violeta
 ácidos: Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. No
tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de contraste
(coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas de las
células eucariotas(Rx básicas)
 Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.

15. COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles
• Se combinan con los componentes lipídicos de
la célula, usados para revelar la localización de
los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.

16. COLORACIONES : Tipos
• Vitales
– Son aquellas que se practican sobre células que están
vivas, mediante la introducción de un colorante en la
circulación de un organismo vivo.
– Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
• Supravitales
– son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos,
pero que están aislados del organismo del que proceden.
• No vitales
– se realizan sobre células muertas.

17. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
a) Frotis o película (extensión)
b) La fijación
c) Coloración.

18. Tinción de células para la observación
microscópica
Extensión de una fina capa
de células sobre el porta
Secado al aire
Fijación por flameado del porta
Adición del colorante
lavado y secado
Se coloca una gota de aceite
de inmersión sobre el porta y
se observa con el objetivo de
100X

20. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
a) Frotis o película (extensión)
• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados

22. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
b) La fijación:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)
TIPOS
– CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)
– FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales
de etanol absoluto y éter)
Metanol

23. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
c) Coloración. SIMPLE : Positiva o negativa

24. Tinción simple de azul de metileno.
Frotis y fijación
Tinción
1.- Poner una gota de agua en
un porta
2.- Tomar la muestra con el asa
de siembra
3.-Extender sobre el agua y
fijar a la llama del mechero
1.- Cubrir la preparación
con Azul de Metileno 5’
2.- Lavar con agua, dejar
secar y observar al
microscopio
Micrococcus luteus
Lunes

25. 1.- Colocar una gota de
Nigrosina en un porta
2.- Tomar muestra del
microorganismo con el asa,
flamear el tubo y tapar
3.- Mezclar con la
Nigrosina y extender por
todo el porta. Secar al aire
y observar
Tinción negativa.
Lunes
cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas

26.  Hongos
 Tinción negativa

27. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
c) Coloración. Diferencial o compuesta
se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos
Etapas :
1. tinción primaria
2. Tinción de contraste o secundaria
- Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHL-
NEELSEN, ESPORAS

29. TERMINOS
• Los mordientes, aunque no son
colorantes, intensifican la tinción
porque aumentan la afinidad de la
célula por el colorante. También se
pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras
celulares externas, como los flagelos,
que debido a su delgadez no podrían
ser visualizados de otra forma.

30. Diferencias en la pared celular

31. Frotis y fijación
1.- Poner una gota de
agua en un porta
2.- Tomar la muestra con
el asa de siembra
3.- Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero
Tinción
1.- Cubrir la
preparación con
Cristal Violeta 2’
2.- Añadir Lugol
(mordiente) durante 1’
3.- Decolorar con Alcohol
96º hasta que no suelte
colorante
4.- Lavar con agua 5.- Teñir con Safranina 1’ 6.- Lavar con agua, dejar
secar y observar al
microscopio
L-3.2.3.- Tinción de Gram
Lunes

32. Tinción de Gram
Paso 1
Paso 2
Paso 3
Paso 4
Tinción del frotis
Previamente fijado al calor,
con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las células se tiñen
de color azul-violeta.
Añadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos
Todas las células siguen
de color azul-violeta.
Decolorar con alcohol
Las células Gram +
siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.
Tinción de contraste
Con safranina 2 minutos.
Las células G+
se ven azul-violeta.
Las G- rosas o rojas.
Gram +
Gram -

33. PROCEDIMIENTO COLORACION
GRAM

34. Cocos Gram - Bacilos Gram -
Tinción de Gram
Lunes

35. COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN
fundamento de esta técnica diferencial se basa en la propiedad
de la pared celular Orden Actinomycetales. (acidos micólicos)
• Resiste la decoloración con alcohol y un ácido fuerte cuando
• VARIANTES
• Caliente : Mycobacterium
• En frío (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora E

38. Frotis y fijación
1.-Poner una gota de agua en un
porta
2.- Tomar la muestra de un
cultivo de Mycobacterium
3.-Extender sobre el agua y
fijar a la llama del mechero
1.-Cubrir la preparación con
Fuchina fenicada
2.-Calentar con un hisopo de
algodón empapado en alcohol y
prendido con la llama del mechero
hasta la emisión de vapores.
Mantener durante 5 minutos.
3.-Lavar con agua y
decolorar con alcohol
ácido
4.-Teñir con Azul de
Metileno 1’
5.-Lavar con agua, dejar
secar y observar al
microscopio
Miercoles
Tinción
Tinción de ácido-alcohol-resistente.

39. Tinción de esporas.
Frotis y fijación
1.-Poner una gota de
agua en un porta
2.-Tomar la muestra de un
cultivo de Bacillus
3.-Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero
1.-Cubrir la
preparación con Verde
Malaquita
2.-Calentar, con un
hisopo de algodón
empapado en alcohol y
prendido con la llama
del mechero, hasta la
emisión de vapores.
Mantener caliente
durante 5 minutos.
3.-Lavar con agua 4.-Teñir con Safranina 1’
5.-Lavar con agua, dejar
secar y observar al
microscopio
Tinción
Bacterias
Esporas
Miercoles

44. La tinción de flagelos de Leifson
• 1.Se fija químicamente la suspensión bacteriana,
mediante formol, y se hace la extensión en un
portaobjetos.
• 2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.
• 3.Se cubre la preparación con una mezcla de ácido
tánico y el colorante rosanilina, de preparación
extemporánea. El ácido tánico engruesa los flagelos y
la rosanilina los tiñe.
• 4.Se retira el exceso de colorante con agua.
5. Por último, se deja secar al aire, antes de su
observación al microscopio.

45. • Figura 3.11Tinciones específicas. (a) La tinción de Wirtz-Conklin se utiliza para observar
endosporas. Bacilius cereus (b) La tinción de Leifson revela que este microorganismo posee
flagelos, lo cual contribuye a su identificación como Spirillum volutans..(c) La tinción negativa
con tinta china permite observar que esta bacteria posee cápsula, lo que facilita su
identiticación como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumonía.

46. Tinción Uso Técnicas
Tinciones
simples
Un colorante; proporciona contraste para
observar mejor un organismo completo
Se tine con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina
básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi
todas las bacterias; la rnayoría de los tejidos no se tiñen.
Tínciones
diferenciales
Tinción de Gram Dos o más colorantes; distingue entre
bacterias Gram positivas y Gram negativas
Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con
una solución de iodo (mordiente). Todas las células quedan tenidas de color
violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.
Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el
colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram
positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.
Tinción de
ácido-alcohol
resistencia
(Ziehl-Neelsen)
Dos colorantes; distingue entre las
micobacterias (ácido-alcohol resistentes) y el
resto de las bacterias
Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores
durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora
brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes
permanecen teñidas de rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con el
colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes
continúan tenidas de rojo, las otras se tiñen de azul.
Tinciones
especificas
Tinción de
esporas de
Wirtz-Cortitlin
Tiñe selectivamente las endosporas Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de
vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe
con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula
toma el color rosa.
Tinción de
flagelos de
Leifson
Permite observar los flagelos A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de ácido tánico
(mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el
colorante los fine.
Tinción negativa Revela la presencia de cápsulas Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparación en fresco del
espécimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cápsula, que
se observa como una región clara alrededor de la célula.
Técnicas de tinción para bacterias

47. Imágenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos
microscopios. (a) La microscopía de campo claro permite observar la forma y las
estructuras internas de mayor tamaño, como el núcleo. (b) La imagen de
contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el característico halo. (c) La
microscopía de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de
Nomarsky es casi tridimensional.

48. PARASITOS: Plasmodium
• GIEMSA O WRIGHT

49. COLORACION LEISHMAN

50. HONGOS
• AZUL DE LACTOFENOL
• T. MENTAGROPHYTES

51. COLORACION DE TEJIDOS
HEMTOXILINA /EOSINA

52. Hay alguna pregunta…?
o de lo contrario…
…seguimos en la
próxima clase !!!