Este documento proporciona información sobre diferentes tipos de tinción de microorganismos, incluyendo tinción de Gram, ácido-resistente, esporas y cápsula. Explica los conceptos clave como cromóforo, auxócromo y colorante, y los pasos para la preparación y lectura de diferentes tinciones. El objetivo es conocer las ventajas de la tinción de microorganismos y aprender habilidades para identificar bacterias usando tinciones diferenciales y selectivas.

1. Introducción a las tinciones
n Tinción de Gram
n Tinción de Cápsula
n Tinción de Esporas
n Tinción de Ziehl-Neelsen
n Tinción Negativa (Dugid)

2. Objetivos
n Conocer las ventajas de la tinción de microorganismos
n Conocer el mecanismo básico de una tinción
n Aprender las destrezas del proceso de preparación de
un frotis y el ensayo de diferentes tinciones
diferenciales y selectivas: Gram, ácido-resistente,
esporas y cápsula
n Establecer las diferencias entre bacterias basadas en las
tinciones

3. CROMÓFORO
• Da la característica de color a una substancia pero no tiñe, ya que carece de
afinidad o capacidad para unirse a fibras o tejidos.
-NO2 -N=N- -N=O -N=
Nitro Azo Nitroso Indámico
C=S- N -N=N+- -S= N+
N O- -N-
Tiocarbonil Acina Azoxi Tiacina
Un grupo cromóforo + un anillo bencénico = cromógeno (no tiñe)

4. AUXÓCROMO
• Grupo que le confiere a una substancia la
propiedad de disociación electrolítica, es decir,
formar sales y por lo tanto da la capacidad a un
cormógeno de fijarse y teñir.
• OH-
• H+

5. COLORANTE
+ NO2
NO2
NO2NO2
NO2NO2
NO2
NO2
NO2 NO2
-OH
OHO-
+ H+
Anillo bencénico
Cromóforo
Ciamógeno
(amarillo)
No tiñe
Auxócromo
Ac. pícrico
El color proviene
de los grupos NO2
y sus propiedades
Tintoriales del -OH
Disociación

6. Tipos de colorantes
n Básicos- Tienen carga catiónica. La porción del
cromógeno tiene carga positiva y poseen gran afinidad
por los componentes celulares negativos.
n Estos colorantes son los más utilizados debido a que las
bacterias tienen una superficie con carga negativa.
n Ejemplo: Azul de metileno, cristal violeta y
carbolfucsina

7. Tipos de colorantes (cont.)
n Ácidos- Tienen carga aniónica. La porción del
cromógeno es negativa y tienen gran afinidad
por los componentes celulares positivos.
n Las sales de sodio, potasio, calcio o amoniaco
de ácidos con color son ionizados para producir
un cromógeno con carga negativa.

8. MORDENTE
• Cualquier substancia que forme compuestos
insolubles con los colorantes y determine su
fijación a una estructura determinada.
• Ejemplo: Lugol (I), fenol, oxalato de amonio, ácido tánico,
sulfato de anilina, etc.

9. FIJADOR
• Substancia que va a permitir conservar en su
lugar a las estructuras correspondientes por
medio de la coagulación de sus moléculas.
• Ejemplo: metanol, formol, tetróxido de osmio, calor (no >
60ºC)

10. Preparación del frotis:
n Limpiar la laminilla con papel de lentes. Libre de grasa
n Prepara el frotis
n Medio líquido- solo se coloca de 2 a 3 asadas del
cultivo en la laminilla. (Agitar)
n Medio sólido- se coloca una gotita de agua en la
laminilla y se diluye la porción de cultivo en ella.
Se esparce bien.
n Secar a temperatura ambiente
n Fijación por calor

12. TINCIONES
• Simple
• Usa un solo colorante
• Diferenciales: Gram y Ziehl-Neelsen
• Usa dos colorantes
• Primario
• Secundario o de contraste
• Mordente
• Diferenciación (decoloración)
• Selectivas
• Usa uno o más colorantes
• Mordente

13. TEORÍAS
• Física: Es un fenómeno o proceso físico, es una reacción
entre dos substancias sin formación de un nuevo
compuesto. Todas las reacciones se explican por
fenómenos de capilaridad, ósmosis, adsorción y
absorción.
• Química: Es una reacción donde se forma un compuesto
nuevo con propiedades físicas y químicas diferentes a las
que muestras las substancias originales reaccionantes.

14. TINCIONES
+ AM+ Cl -
+ NaCl
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+

15. Tinción simple
n Utilizada para observar la forma, la
agrupación, el tamaño y la presencia de
esporas.
n Se utiliza un solo colorante.
n tinción directa se tiñe a la bacteria.
n Tinción negativa tiñe el fondo pero no a la
bacteria

16. TINCIÓN SIMPLE
• Permite observar la forma, tamaño, agrupación de
las bacterias usando un solo colorante
(generalmente básico)

18. Tinción diferencial
n Tinción diferencial: es una gran herramienta para
separar y clasificar a los microorganismos.
n Utiliza dos colorantes y un mordente.
n El primer colorante aplicado es el primario. Después de
él suele hacerse la diferenciación (decoloración). El
colorante secundario o de contraste, se adiciona para
establecer la diferenciación de las bacterias.
n Ejemplo: Tinción Gram y Ziehl-Neelsen

19. Tinción de GRAM
n Colorante primario- cristal violeta, tiñe la bacteria de
color morado
n Agente mordente- Yodo- forma un complejo insoluble
con cristal violeta y los compuestos protoplásmicos.
Ayuda a adherir el tinte a la célula. Ayuda a resistir la
decoloración
n Agente decolorante- alcohol etílico al 95% y acetona, el
cual sirve como solvente de lípidos y agente
deshidratante de proteínas.
n Colorante secundario-safranina-tiñe de rojo a la
bacteria

20. Preparación de la tinción de
Gram
n Preparación del frotis
n Cristal violeta (30 segundos -
1minuto)
n Lavar con agua
n Yodo (1 minuto)
n Lavar con agua
n Alcohol etílico-acetona
suavemente (5-15 segundos)
n Lavar con agua
n Safranina (45-60 segundos)
n Lavar con agua
n Secar al aire

21. Gram + Gram-Bacteria

22. Gram positivo Gram negativo
Fijación
Cristal violeta
Mordente (Yodo)
Decoloración
Colorante de
contraste

23. Resultados de Gram

24. TINCIÓN DE GRAM
Tinción de Gram de una muestra de líquido cerebro-
espinal infectado con Bacillus anthracis

25. Tinción Alcohol-Ácido Resistente
n Las familias Mycobacteriae y Nocardiaceae son
alcohol-ácido resistente.
n Los microorganismos alcohol-ácido resistentes se
caracterizan por tener una pared celular gruesa de
cera (lipoidal) que contiene ácido micólico.
n Los organismos que son decolorados por el
alcohol ácido no son ácido resistente.

27. Tinción Alcohol-Ácido Resistente:
Ziehl-Neelsen
n Colorante primario- Carbolfucsina (fenol 5%). Puede
penetrar la pared
n Agente decolorante- alcohol ácido (3% HCl +95%
alcohol etílico)
n Colorante secundario o contrasto: Azul de metileno se
utiliza para teñir de azul las bacterias que quedaron
incoloras

29. Preparación de la tinción
alcohol-ácido resistente
n Preparar un frotis
n Carbolfucsina (3 minutos). Cubrir completamente y
calentar a emisión de vapores por 5 minutos. No hervir.
n Lavar con agua
n Decolorar con alcohol etílico-HCl
n Lavar con agua
n Azul de metileno por 1-2 minutos
n Lavar con agua
n Secar al aire

30. Tinción de esporas
Método de Schaffer-Fulton
n Célula vegetativa- forma metabólicamente activa =
bacterias
n Esporas- forma metabólicamente inactiva y altamente
resistente
n Los miembros del género anaerobio Clostridium,
Desulfotomaculum y Bacillus pueden existir
metabólicamente activos o inactivos.

31. Formación de esporas como
método de sobrevivencia
§ Condiciones ambientales
hostiles, ocurre esporo-
génesis la cual forma la
espora. Condiciones ambien-
tales favorables, ocurre
germinación, lo cual forma la
célula vegetativa

33. Preparación de la tinción
de esporas
n Preparar el frotis
n Verde Malaquita (2-3 minutos) a emisión de
vapores
n Dejar enfriar la laminilla y enjuagar con agua
n Safranina (30 segundos)
n Lavar con agua
n Secar al aire

34. TINCIÓN DE SCHAEFFER Y
FULTON

35. Tinción de cápsula
n Cápsula: estructura gelatinosa secretada por
algunas bacterias
n Las células que tienen cápsula son virulentas y
causan enfermedades ya que protegen a la célula
de la acción fagocítica del hospedero.
n La mayoría de las cápsulas están compuestas de
polisacáridos, por lo que son solubles en agua.

36. Tinción de cápsula
§ Colorante primario- Cristal Violeta 1%- tiñe todo el
frotis color oscuro
§ Decolorante y Colorante de contraste- Sulfato de
Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario
§ No se enjuaga con agua por que la cápsula es
soluble en agua.- función de decolorante
§ El CuSO4 es absorbido en el material de la
cápsula que ha sido decolorada - función de
colorante de contraste

37. Preparación de tinción de cápsula
n Preparación de un frotis grueso
n Dejar secar a temperatura ambiente
n Cristal violeta 1% (5-7 minutos)
n Enjuagar con CuSO4
n Secar al aire

38. Tinción negativa
(Dugid)
n Ideal para poder observar la estructura de la
cápsula
n La tinción se logra mediante una mezcla del
colorante y el cultivo de bacteria
n El colorante utilizado es “ India Ink”(Tinta
China)
n Se le conoce como efecto de cielo estrellado

39. Pasos a seguir para tinción negativa de
cápsula

40. TINCIÓN DE KNAYSI. PARED
CELULAR
• Preparar el frotis
• Mordente de Kaysi (ácido tánico a sturación +
alumbre de potasio) 10 minutos
• Enjuagar con agua
• Colocar 1 gota de fucsina
• Colcar un cubreobjetos
• Observar a inmersión

41. PARED CELULAR

42. PARED CELULAR
Péptidoglicana
Mordente
Fucisna
Pared celular Soma

43. TINCIÓN DE LOS FLAGELOS
• Los flagelos son estructuras demasiado finas
para poder ser visibles en el microscopio de luz.
• Frotis
• Mordente de ácido tánico para formar un
precipitado denso en la pared celular y en
los flagelos
• Teñir con fuscina básica

44. FLAGELO BACTERIANO

45. TINCIÓN DEL NUCLEOIDE
BACTERIANO
• Tinción de Feulgen la cual es específica
para el DNA.
• Frotis fijado con tetróxido de osmio
• Digerir con KOH calentando
• Cubrir con el colorante de Shift

46. CUERPOS CROMÁTICOS
(NÚCLEO) FEULGEN

47. GRÁNULOS METACROMÁTICOS
• Preparar el frotis
• Azul de metileno de Löeffler 15 segundos
• Enjuagar con agua
• Observar a inmersión

48. GRÁNULOS METACROMÁTICOS