Comment étudier les anomalies génétiques des petits ruminants avec les outils génomiques actuellement disponibles

1. p. 1
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Stéphane Fabre
Les anomalies génétiques :
comment les étudier avec les
outils génomiques disponibles ?
Projet doctoral HOMLET co-financé par:
CASDAR n°20ART1532777
https://idele.fr/presage/

2. p. 2
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Qu’est-ce qu’une anomalie génétique?
Phénotype déviant (± délétère)
par rapport à la population
Mutation dans l’ADN
naturelle, rare et héréditaire

Anomalie Génétique
A effet dominant
A effet récessif
normal
normal
anomalie
anomalie

3. p. 3
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Quels sont les outils de la génomique pour étudier les anomalies ?
« Puces » de génotypages – des milliers de marqueurs génétiques balisant le génome
(5 000 – 15 000 – 50 000 – 600 000 SNP)
Des génomes de référence
Séquenceurs haut-débit – 14.1012 bases (Tb) en 72h  génomes complets séquencés (3Gb)
Bases de données génomiques
Plateformes de bio-informatique
Bases de données animales
Identification individuelle
Données zootechniques
Les anomalies observées
Cas Contrôles
Méthodes statistiques

4. p. 4
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Comment identifier une anomalie génétique ?
Phénotype
Lanata caput
héritable
Génotype
Mutation dans le
gène TOUF
Approche génétique classique
Tissus biologiques disponibles
Analyses génétiques
Génotype
Sélection génomique
(des milliers de génotypes)
Programmes « 1000 génomes »
(des centaines de séquences)
Approche génétique inverse
Analyses statistiques / bioinformatiques
Mutations
Phénotype??

5. p. 5
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Exemples d’études d’anomalies touchant à la
santé et au bien-être des ovins
• Epidermolyse bulleuse, altération de la peau
Approche de génétique classique
• Dyskinésie ciliaire, syndrome respiratoire
Approche de génétique inverse

6. p. 6
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Approche génétique classique. Cas de l’Epidermolyse Bulleuse ovine
Observation de cas
Lésions sévères de la
peau et des muqueuses
Mort des agneaux
Mouton Churra
Epidermolyse bulleuse
jonctionnelle
https://www.eurogct.org/epidermolysisbullosa

7. p. 7
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Approche génétique classique. Cas de l’Epidermolyse Bulleuse ovine
Observation de cas
Lésions sévères de la
peau et des muqueuses
Mort des agneaux
Mouton Churra
Collecte échantillons
28 cas atteints
28 sains
Parenté connue
Génotypage
50 000 SNP
ITGB4 candidat
Annotation du génome ovin
Mutation récessive dans
le gène ITGB4
Integrin ß4
(délétion 4pb exon 33)
Test de diagnostic
génétique
GWAS
Chromosome 11 (Suarez-Vega et al. PLOS One 2015)
Epidermolyse bulleuse
jonctionnelle
Séquençage
ITGB4

8. p. 8
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19 janvier 2023
Approche génétique classique. Cas de l’Epidermolyse Bulleuse ovine
Observation de cas
Lésions sévères de la
peau et des muqueuses
Mort des agneaux
Mouton Vendéen
Epidermolyse bulleuse
jonctionnelle
(Fabre et al. Anim. Genet. 2021)
Test de diagnostic génétique
(4200 animaux)
Mutation récessive dans le
gène ITGB4
(SNP exon 23, codon Stop)
• Fréquence 12% de porteurs
• Gestion pour limiter
l’apparition de cas
Collecte échantillons
6 cas atteints
4 frères ou soeurs sains
7 parents sains
Génotypage
Mutation candidate ITGB4 « Churra »
Pas de porteur
ITGB4
Recherche variants dans tous
les gènes candidats connus
(bibliographie E. bullosa)
Séquençage génome complet

9. p. 9
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19 janvier 2023
Approche génétique inverse. Cas de la dyskinésie ciliaire ovine
Génotype
Sélection génomique
(des milliers de génotypes)
Programmes « 1000 génomes »
(des centaines de séquences)
Race ovine Lacaune Lait
35 000 (« puces » 15 000 ou 50 000 SNP)
31 génomes complets

10. p. 10
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
La transmission d’une anomalie génétique délétère avec un déterminisme récessif crée
un biais dans la représentation des génotypes (déficit)
Deux copies
mutées donnent
l’anomalie
L’animal homozygote muté n’est jamais
(ou très rarement) génotypé !!!
On observe un déficit d’animaux
homozygotes pour certaines régions
du génome
Génotypage
(1 mois)
Approche génétique inverse. Cas de la dyskinésie ciliaire ovine
Phénotype délétère (possiblement létal)

11. p. 11
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19 janvier 2023
Approche génétique inverse. Identification du déficit en homozygotes
Etape 1 – Identification d’haplotypes avec une fréq>1%
 𝑃 − 𝑃𝑜𝑖𝑠𝑠𝑜𝑛 < 1,9 × 10 (5 ‰, nb chr ovins=26) ;
 Déficit = de 75 à 100%
 Regroupement des haplotypes de 20 marqueurs
consécutifs avec les mêmes caractéristiques
Deficient
Homozygous
Haplotype
=DHH
Etape 3 – Identification d’haplotypes en déficit
Nombre de descendants
homozygotes attendus
Nombre de descendants
homozygotes observés
Etape 2 – Pour chaque haplotype, comparaison nombre d’animaux
homozygotes Att et Obs

12. p. 12
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19 janvier 2023
Approche génétique inverse. Identification du déficit en homozygotes
LDHH11, 4 et 6
LDHH9
Ben Braiek et al., GSE 2021
 35 221 génotypages  31 703 informatifs
 7 LDHH indépendants
Lacaune
7 mutations potentielles
causales d’anomalies
génétiques récessives

13. p. 13
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19 janvier 2023
Approche génétique inverse. Analyse des bases de données « animal »
Ben Braiek et al., GSE 2021
Embryons Fœtus Nouveau-né Jeune
Fécondation Naissance
gestation croissance de l’agneau
Génotypage
(1 mois)
Taux de réussite à
l’Insémination
0: brebis non gestante
1: brebis gestante
Proxy pour de la
perte embryonnaire
Taux de mort-nés
0: pas de mort-né dans la portée
1: au moins un mort-né dans la portée
Proxy pour la
mortalité périnatale

14. p. 14
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Approche génétique inverse. Analyse des bases de données « animal »
Ben Braiek et al., GSE 2021
DHH/+
DHH/+
?
12,5% de descendants
DHH/DHH
Acc. à risque vs Acc. non à risque (autres combinaisons)
1 155 835 accouplements
(2006-2018)
Utilisation d’un modèle logistique binaire pour comparer taux de réussite à l’Insémination et taux de mort-nés
 Effet fixe à tester: Type d’accouplements (à risque ; non à risque)
 Effets fixes: mois IA, numéro de lactation, prolificité (taux mort-nés)
?
~1% de descendants
DHH/DHH
?
0% de descendants
DHH/DHH
?
0% de descendants
DHH/DHH
DHH/+
+/+
+/+ +/+
DHH/+ +/+

15. p. 15
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Approche génétique inverse. Analyse des bases de données « animal »
LDHH6 et fréquent et porte
une mutation récessive qui
affecterait la viabilité
périnatale
Ben Braiek et al., GSE 2021

16. p. 16
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
En l’absence de matériel biologique d’animal homozygote, on cherche la mutation à l’état hétérozygote chez les porteurs
Hypothèses: Fort déséquilibre de liaison entre l’haplotype et la mutation & spécifique de la race Lacaune
2 porteurs hétérozygotes
de LDHH6
Nombreux non-
porteurs (98)
Alignement sur
Oar_rambouillet_v1.0
(BWA v0.7.17-r1188)
Détection variants (localisation)
(GATK HaplotypeCaller)
Annotation fonctionnelle des
variants (SnpEff v4.3t)
Nextflow v20.10.0 et
Sarek pipeline v2.6.1
Approche génétique inverse. Analyse bio-informatique, bases de données « génome »
100 WGS
Statut connu
à LDHH6
69 moutons
(14 autres races)
31 LAC
Ben Braiek et al., Genes 2022

17. p. 17
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Extraction des variants de type SNP et InDels localisés dans la région LDHH6 ± 1 Mb
LDHH6
-1 Mb +1 Mb
Corrélation entre
+/+ +/DHH DHH/DHH
0/0 0/1 1/1
Statut :
Génotype :
Annotation fonctionnelle variants prédits avec impact modéré à fort (SnpEff, PolyPhen ,SIFT)
Corrélation=1
Approche génétique inverse. Analyse bio-informatique, bases de données « génome »
Ben Braiek et al., Genes 2022

18. p. 18
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Approche génétique inverse. Analyse bio-informatique, bases de données « génome »
LDHH6 porte une mutation perte de fonction du gène CCDC65
(Coiled-Coil Domain Containing 65)
CCDC65
Phénotype??
Ben Braiek et al., Genes 2022

19. p. 19
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19 janvier 2023
Approche génétique inverse. Analyse bibliographique
Rôle de CCDC65 dans le mouvement des structures ciliées
Adapté de (Morohoshi et al., 2020 ; Gui et al., 2019 ; Horani et al., 2013 ; Poprzeczko et al., 2019 ; Kurkowiak et
al., 2015)
CCDC65
Syndrome humain de Dyskinésie ciliaire (OMIM 615504)
détresse respiratoire néonatale, maladie des voies aériennes supérieures et inférieures
récurrente et bronchectasie (infection).

20. p. 20
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
• Repérer les brebis issues de pères porteurs de LDHH6 dans les élevages
(bases de données « animal »)
• Prises de sang et génotypage spécifique CCDC65 des brebis
(test de diagnostic génétique sur 2900 animaux, 14% de porteurs)
• Réalisation et suivi des accouplements à risque de l’Insémination jusqu’à la naissance
 DG par échographie à 45 jours
 Biopsie auriculaire des agneaux nés (Pince TSU) / Génotypage CCDC65
 Observations durant la croissance, Autopsie si mortalité
Approche génétique inverse. Quelle est l’anomalie associée à CCDC65?
CCDC65

21. p. 21
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Validation de la causalité par accouplements à risque mutation CCDC65
17 brebis
Accouplements à risque
Taux de réussite à l’IA
11 gestantes
6 vides
65%
(~69% moy pop)
Suivi des mises-bas (11 brebis)
16 agneaux
Prolificité 1,5
Gestation: 139-159j
4 agneaux morts
(taux de mortalité de 25%)
(~10-15% moy pop)
Naissance
Fécondation
(IA)
croissance de l’agneau
Sevrage (1 mois)
Echographie
J45-60
CCDC65
4 agneaux morts homozygotes
(100% des agneaux morts sont liés à la mutation)
Influence du génotype sur la viabilité
G/G
(n=5)
GT
(n=6)
T/T
(n=5)
Total
(n=16)
Vivants 5 6 1 12
Morts - - 4 4
Ben Braiek et al., Genes 2022

22. p. 22
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
17 brebis
Accouplements à risque
Naissance
Fécondation
(IA)
croissance de l’agneau
Sevrage (1 mois)
Echographie
J45-60
 Les agneaux homozygotes T/T ont un gain de poids quotidien plus faible (0-15j)
et présentent des difficultés respiratoires (tachypnée)
CCDC65
15 16 19 25
Mortalité juvénile
?
Validation de la causalité par accouplements à risque mutation CCDC65

23. p. 23
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
CCDC65
Approche génétique inverse. Cas de la dyskinésie ciliaire ovine
Autopsie des agneaux morts
Système cœur-poumon
Hépatisation des lobes pulmonaires
Suspicion de pneumonie
Perte du rôle de
CCDC65 dans le
mouvement des
microtubules
Alteration du
mouvement
des cils des
voies
aériennes
Défaut
excrétion du
mucus
Détresse
respiratoire
(i.e.
tachypnée)
Mort en lien avec
l’insuffisance respiratoire
et l’infection pulmonaire
Infection bactérienne
(effet de l’environnement)
Dyskinésie ciliaire ovine
Traitement chronique
corticoïde +
antibiotique
Survie
Ben Braiek et al., Genes 2022

24. p. 24
Webinaire UMT STAR
19 janvier 2023
Un grand merci à vous toutes et tous
Maxime Ben Braeik