1. 遠赤色蛍光蛋白monomeric Plum を発現するトランスジェニックブタの作出
渡邊將人1,2、松成ひとみ1,3、○小林美里奈1、中野和明1、前原美樹1、金井貴博1、松村幸奈1、林田豪太1、
倉本桃子 1、坂井理恵子1、梅山一大1,2、渡辺信之4、小野寺雅史4、長屋昌樹2、長嶋比呂志1,2
1明大農、2明治大学バイオリソース研究国際インスティテュート、 3JST, ERATO, 中内幹細胞制御プロジェクト、4国立成育医療研究センター
背景と目的
我々はこれまでに緑色蛍光タンパク質 (GFP)や赤色蛍光タンパク質 (Kusabira-Orange, KO)を発現するトランスジェニック (Tg)ブタを作出してきた.
これら蛍光マーカー遺伝子を発現するTg動物は移植・再生医学研究において非常に有用である. 本研究では、長波長の遠赤色蛍光タンパク
質 (最大蛍光波長: 649 nm)であるmonomeric Plum (mPlum)を発現するTgクローンブタの作出を目的とした. 長波長の蛍光タンパク質は短波長
の蛍光タンパク質と比べて自家蛍光の影響を受けにくい利点を持ち、cell tracking等の研究利用により有用である.
材料と方法
■ 核ドナー細胞の樹立 ■ mPlum発現ベクターの構造 (CAG-mPlum)
Sal I BamH I
4.3 kb
CMV-IE Chicken Rabbit Puromycin
enhancer beta-actin promoter beta-globin poly (A) N-acetyl-transferase
ブタ胎仔線維芽細胞 (PFF) intron
mPlum cDNA
エレクトロポレーション
■ 体細胞核移植 (SCNT)による胎仔作出 核ドナー細胞
培養 (37℃, 2 days)
体外成熟 除核 細胞挿入 融合 活性化
ピューロマイシンによる
薬剤選択 (2.5 µg/ml)
[体外成熟培地] 5 μg/ml サイトカラシンB, [融合培地] [活性化用電解液]
培養 (37℃, 12 days) NCSU23 + 0.6 mM cysteine, 10 ng/ml EGF, 10% 0.1 μg/ml デメコルシン 280 mM Mannitol, 0.15 mM MgCl2 0.5 mM 280 mM Mannitol, 0.1 mM MgCl2
pFF, 10 IU/ml eCG and hCG (前半22 hのみ） (第一極体とその直下の Hepes, 0.01% (w/v) PVA, 280 mOsmol 0.05 mM CaCl2, 0.01% (w/v) PVA
FACSによる 前半22 h：5% CO2 細胞質を吸引除去) 融合条件 [活性化条件]
後半17-18 h：5% CO2, 5% O2, 90% N2 [AC] 1 MHz, 4V, 5 sec, [DC] 267 V/mm, 20 µsec [DC] 150V/mm, 100 µsec
mPlum陽性画分
ソーティング 倍数体化 体外発生能の検証
Scriptaid処理 体外培養 培養2日目と7日目に 胎仔回収 (36-37日)
正常分割率、胚盤胞形成率を算出
5, 6日後
[倍数体化処理 (3 h)]
+5 µg/mlサイトカラシンB, [体外培養 ] [発情同期化]
1000 IU eCG
500 nM Scriptaid (~96 h) PZM-5 (機能性ペプチド研究所) 胚移植 1500 IU hCG
[Scriptaid処理 (13-15 h)] (96 h~) PZM-5 +10% FBS 個体間の蛍光発現強度・特徴の解析
mPlum核ドナー細胞樹立 500 nM Scriptaid 5% CO2, 5% O2, 90% N2 レシピエントブタ 次世代ドナー細胞の樹立
結果
表1. CAG-mPlumを導入したクローン胚の体外発生能 Wild-Type mPlum-1 mPlum-2 mPlum-3
培養 正常 胚盤胞 平均細胞数
胚数 分割率 (%) 形成率 (%) (Mean ± SEM)
PFF 40 92.5 [37/40] 75.0 [30/40] 99.9 ± 8.8
胎仔
mPlum 42 81.0 [34/42] 78.6 [33/42] 88.3 ± 6.0
両者の体外発生能に有意差 (P<0.05)はみられなかった
PFF mPlum
Li
Li Li Li
St St St
明視野 In
St
In In
In Kd Kd Kd Kd
内臓
胚盤胞でmPlum蛍光
蛍光 発現が観察された
図1. クローン胚盤胞のmPlum蛍光発現 (day 7) 樹立
細胞
表2. CAG-mPlumを導入したクローン胎仔の作出 (妊娠36-37日)
正常胎仔 図2. クローン胎仔・内臓・細胞のmPlum蛍光発現 (妊娠36-37日目)
レシピエントNo. 移植胚数 正常胎仔数
作出効率 (%) ・ 得られた3頭の胎仔全てに全身性蛍光発現が認められた
・ 蛍光強度には個体間の差が見られた
P155 103 3 2.9% [ Li: 肝臓, St: 胃, Kd: 腎臓, In: 腸]
結論
CAG-mPlum遺伝子の導入は、ブタSCNT胚の発生を阻害せず、遠赤色蛍光タンパク質mPlumを全身発現するTgクローンブタ胎仔の作出が可能
なことが明らかとなった. 全身性蛍光発現が確認された胎仔の細胞を核ドナー細胞としてmPlumブタ産仔の作出を行うことができる.