17. การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย วิธี ASA อาศัยความจำเพาะของไพรเมอร์ในการทำ PCR โดยจะแบ่งไพรเมอร์เป็น 2 แบบ คือ Normal Primer และ Mutant Primer หลักการคือ DNA ปกติ จะเกิดผลิตภัณฑ์ ได้กับ ไพรเมอร์ปกติ ส่วน DNA ที่ Mutant จะเกิด Product ได้กับไพรเมอร์ที่ Mutant Normal Heterozygote Mutant N M N M N M ASA Control การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
18.
19. วิธีการดำเนินงาน สกัด DNA เก็บ Stock DNA ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค PCR ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค ASA หาความเข้มข้นของ DNA ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค RFLP สรุปผลการตรวจสอบ สร้าง Haplotype Block การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
20. สกัด DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
21. สกัด DNA Plasma Buffy coat RBC การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) ตั้งทิ้งไว้ 10 นาที
22. สกัด DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
30. เก็บ Stock DNA นำหลอด DNA ที่ละลายใน TE แล้ว ไป Centrifuge ด้วยระบบ Quick run โดยการกดปุ่ม Quick run ค้างไว้ DNA ที่ละลายใน TE Transfer DNA ลงในหลอด Efpendrop เก็บรักษาในตู้ Freeze ที่อุณหภูมิ -25 o C ใช้ระบบ Quick run Eppendrop ขนาด 1.6 ml การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
31. หาความเข้มข้นของ DNA Dilute DNA 25 เท่า ปริมาณ 1000 µl น้ำที่ sterile แล้ว 960 µl DNA จาก Stock 40 µl Mix ให้เข้ากันดี แปลค่า OD 260nm เป็นค่าความเข้มข้น [OD 260nm = 1 = 50 ng/ µl ] หาค่า OD ด้วยเครื่อง Spectrophotometer โดยใช้ความยาวคลื่น 260 nm และ 280 nm การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
32. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค PCR Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ณ บริเวณ Exon 11 ด้วย Primer Exon 11 ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
33. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค RFLP Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ณ บริเวณ Exon 17 ด้วย primer exon 17 ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ Hpa II ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ที่ตัดแล้ว ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
34. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค ASA Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ด้วยเครื่อง PCR โดยใช้เทคนิค ASA รัน DNA ที่ PCR แล้วด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
40. สรุปและวิเคราะห์ผลการทดลอง ความผิดปกติของยีนที่เกิดขึ้นบริเวณ Exon 11 เป็นการมิวเตชั่นแบบ Deletion คือมีการขาดหายไปของลำดับเบส ทำให้กรดอะมิโนขาดหายไป ส่วนความผิดปกติที่ Exon 17 นั้นเกิดจาก SNPs ที่เปลี่ยนแปลงจาก G เป็น A หรือ T ซึ่งเป็นผลให้เอนไซม์ไม่สามารถตัดได้ ภาพที่ 5 บริเวณที่ถูกตัดด้วย Hpa II T C C G G C T T A G G C C G A A SNPs การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )