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Extraccion de acidos nucleicos lab. Genetica UNAH

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Extraccion de acidos nucleicos lab. Genetica UNAH

  1. 1. LABORATORIO DE GENETICA 1 INTRODUCCION Los ácidos desoxiribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) son polímeros de nucleótidos formados por un azúcar de cinco carbones (desoxiribosa en el ADN y ribosa en el ARN), una base nitrogenada (que puede ser adenina, timina, citosina, guanina o uracilo) y una molécula de fosfato. La expresión de los genes es la base del metabolismo celular, y por ésta se entiende que el ADN se transcribe en ARN, que a su vez se traduce en proteínas. Esta secuencia ADNARN-proteínas constituye el dogma central de la biología molecular. Los estudios contemporáneos de ecología molecular se han esforzado en entender las funciones metabólicas de los diferentes componentes biológicos presentes en el ambiente y en conocer la diversidad biológica mediante el uso y aplicación de técnicas moleculares basadas en la amplificación de diversas regiones del ADN y ARN. La detección de la expresión de los genes o la presencia de mARN específicos nos permitirá acercarnos a temas como el impacto de los diferentes componentes físicos y biológicos del ambiente en la expresión del ADN (ya que la simple presencia de ADN no nos indica la actividad de los genes), así como a la regulación metabólica de las enzimas que son esenciales en el papel ecológico que juegan los organismos dentro de su ecosistema (ciclos biogeoquímicos, bioremediación, reciclaje de nutrientes), entre otros. En la extracción de los ácidos nucleicos, existen diferentes métodos que permiten su obtención partiendo de diferentes fuentes por ejemplo; plantas plásmidios, gtas de sangre, cabellos, células bacterianas, o eucariotas, etc. El método de extracción para la purificación de ADN depende de la aplicación del anterior. En esta práctica utilizaremos como muestra diferentes tejidos vegetales. El procedimiento se fundamenta en lisis celular por medios mecánicos y químicos, liberación del acido nucleíco con CTAB al 2% el cual rompe la membrana celular y nuclear purificando posteriormente el ADN con cloro formo luego el ADN es precipitado con Isopropanol frio para su purificación.
  2. 2. LABORATORIO DE GENETICA 2 MARCO TEORICO EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos los ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos existentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes: ácido nucleico diana; organismo fuente; material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.); resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación); uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de ADNc, etc) Métodos de extracción Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restosde células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. . Métodos de purificación Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes: extracción/precipitación; cromatografía; centrifugación; separación por afinidad. Extracción/precipitación
  3. 3. LABORATORIO DE GENETICA 3 A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse unacombinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la precipitación. También puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitación salina) o una precipitación de proteínas mediante cambio de pH. Cromatografía Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación: permeación sobre gel, intercambio iónico, adsorción selectiva o unión por afinidad. La permeación sobre gel aprovecha las propiedades de las partículas porosas del gel para tamizar moléculas. Se emplea una matriz con poros de tamaño definido, que dejan pasar las moléculas más pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que quedan eluidas en el volumen vacío. Así pues, las moléculas quedan eluidas por orden de tamaño decreciente. La cromatográfica de intercambio iónico es otra técnica, que se basa en la interacción electrostática de la molécula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos (polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden e luirse de las columnas de intercambio iónico con simples Tampones salinos. En la cromatografía de adsorción, los ácidos nucleicosse fijan selectivamente en sílice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por ejemplo, sales caotrópicas), mientras que otras moléculas biológicas no se fijan. A continuación, los ácidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampón hiposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores. Centrifugación La centrifugación selectiva constituye un método de purificación eficaz. Así, por ejemplo, la ultracentrifugación en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plásmidos. La centrifugación suele asociarse a otros métodos, como la cromatografía de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la permeación sobre gel y la centrifugación para separar el ADN o ARN de contaminantes más pequeños (sales, nucleótidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar según el tamaño. Algunos procedimientos combinan la adsorción selectiva en matriz Separación por afinidad En los últimos años, cada vez son más los métodos de purificación que combinan la inmovilización por afinidad de ácidos nucleicos y la separación magnética. Por ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partículas magnéticas revestidas deestreptavidina mediante oligo dT marcados con biotina, y el complejo de partículas puede eliminarse de la solución (y de los contaminantes libres) con un imán. Esta técnica en fase sólida simplifica la purificación de los ácidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de
  4. 4. LABORATORIO DE GENETICA 4 centrifugación, extracción orgánica y separación de fases por una operación de separación magnética, única y rápida. . Método de extracción y purificación con CTAB El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y está especialmente indicado para eliminar los polisacáridosy los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en genética molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validación para detectar OGM. Se han elaborado algunas variantes adicionales para adaptar el método a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin transformar. Principios del método del CTAB: lisis, extracción y precipitación Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentración salina y se precipita con etanol o isopropanol.
  5. 5. LABORATORIO DE GENETICA 5 PROCEDIMIENTOS 1) Pesar 600 mg de tejido foliar, adicionar el tejido foliar a un microtubo de 1.5 ml y triturar el tejido foliar con un micropistilo. 2) Macerar con 1 ml de CTAB 2% e incubar a 64 °C en un plato caliente durante 40 minutos.
  6. 6. LABORATORIO DE GENETICA 6 3) Agregar 500 µl de cloroformo: octanol (24:1), mezclar suavemente (hasta que se observe un color blanco). 4) Colocar el microtubo en una microcentrifuga y centrifugar por 15 minutos a 10,000 RPM.
  7. 7. LABORATORIO DE GENETICA 5) Extraer la fase acuosa (400-500 µl) y transferirla a un microtubo nuevo. 7
  8. 8. LABORATORIO DE GENETICA 8 6) Agregar 600 – 800 µl etanol absoluto o isopropanol y frio (punto de congelacion) mezclándose suavemente hasta observar la precipitación del acido nucleico. 7) Centrifugar 14,000 RPM durante 10 minutos. Descartar el sobrenadente con el cuidado de no descartar el pellet formado.
  9. 9. LABORATORIO DE GENETICA 9 8) Agregar 450 µl de alcohol 70% para lavar el pellet, descartar el etanol y dejar secar el pellet a temeratur 60°C en un plato caliente. 9) Agregar de 60 a120 µl de agua destilada dependiendo del tamaño del pellet y resuspender. Finalmente Almacenar a -20 °C
  10. 10. LABORATORIO DE GENETICA 10 DATOS Investigue los siguientes términos: EDTA ácido etilen diamino tetra acético es una sustancia utilizada como agente quelante que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinación octaédrica. Coordina metales pesados de forma reversible por cuatro posiciones acetato y dos amino, lo que lo convierte en un ligando hexadentado, y el más importante de los ligandos quelatos. CTAB El Bromuro de hexadecil trimeti lamonio o Bromuro de cetil trimetil amonio (C16H33)N(CH3)3Br) es una sal de amoniocuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran longitud, con actividad detergente. Se le conoce también por las siglas CTAB, del inglés Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide. Es
  11. 11. LABORATORIO DE GENETICA 11 un surfactante catiónico. Sus usos incluyen la utilización como solución tamponante para la extracción de ADN. Y es uno de los compuestos del antiséptico tópico Cetrimide. El catióncetiltrimetilamonio es un agente antiséptico efectivo contrabacterias y hongos. CLON un clon (griego ‘retoño’) es un conjunto de individuos genéticamente idénticos que descienden de un mismo individuo por mecanismos de reproducción asexual. ENZIMA Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica y estructural quecatalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. GEN Un gen es una secuencia ordenada de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN, en el caso de algunos virus) que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica, habitualmente proteínas pero también ARNm, ARNr y ARNt. PLASMIDO Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula.
  12. 12. LABORATORIO DE GENETICA 12 VECTOR Un vector génico es un agente que transfiere información genética, por algún medio, de un organismo a otro. Son utilizados enbiotecnología un Vector de clonación para portar el ADN recombinante desde una célula donadora hasta la célula receptora en los que se inserta el gen que se quiere transferir. A continuación se infecta la célula hospedadora con ese vector recombinante, obteniéndose la célula transgénica. Investigue y resuma un protocolo de extracción de ADN de tipo casero para tejidos animales y tejidos vegetales. PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN PARA TEJIDOS VEGETALES EXtracción de ADN de robles colombianos Dellaporta , el cual ha dado buenos resultados en los trabajos con plantas adelantados en el laboratorio de Biología Molecular dela Universidad Nacional sede Palmira . Uno de los problemas al trabajar con plantas es la composición de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extracción de todo su contenido, incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por acción mecánica, pulverizando el tejido con hielo seco o con nitrógeno líquido. En seguida, se deben destruir las membranas celulares de manera que el ADN, acompañado de otros compuestos (proteínas, enzimas, carbohidratos), quede disponible. La mezcla de tejido así obtenida se agrega a una solución buffer o tampón de extracción, en presencia de agentes quelantes, de soluciones de baja o alta fuerza iónica (para que sea soluble el ADN) y de altas concentraciones de NaCl. Los agentes quelantes (como el EDTA) se emplean para proteger el ADN de la acción de enzimas nucleasas; ellos capturan los iones magnesio y no permiten que actúen como cofactores de las nucleasas. Las altas concentraciones (5 M) de NaCl seemplean para prevenir la contaminación de la muestra con polisacáridos que afectan la pureza del ADN, pudiendo inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y endonucleasas de restricción; la base para la separación de los polisacáridos de los ácidos nucleicos, es su solubilidad diferencial en presencia de las altas concentraciones de NaCl los polisacáridos precipitan bajo la acción de fuerzas centrifugas. A la mezcla anterior se agrega un detergente aniónico como el SDS (sodio dedecil sulfato), que solubiliza proteínas, tejidos y membranas, evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los desechos o restos celulares. Para prevenir que el ADN extraído presente coloración gris o parda, la cual se debe a la actividad de polifenoloxidadas presentes en algunos tejidos, se incluye en el buffer de extracción P.V.P (polivinil pirrolidona)(6). Para separar las proteínas, se lleva la mezcla de tejido con el tampón a incubación a 65ºC con lo cual se desnaturalizan las proteínas. Para retirar las proteínas denaturadas y la mayoría de los polisacáridos, se
  13. 13. LABORATORIO DE GENETICA 13 agrega una sal como el acetato de potasio frío. Por centrifugación se separan tejidos, membranas, polisacáridos y proteínas de los ácidos nucleicos, los cuales quedan en el sobrenadante. Finalmente hay que separar el ADN de la fase acuosa, para lo cual se debe precipitar el mismo, usando un alcohol como el isopropanol, el cual es selectivo en la precipitación del ADN en presencia de ARN. Después de precipitado el ADN se disuelve en una solución tampón (TE de pH 8.0) o en agua bidestilada. El ARN se remueve adicionando enzima RNAasa a la solución. PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN PARA TEJIDOS ANIMALES Protocolo de extracción de ADN de de ADN de miniprep: Una miniprep es una extracción naturaleza plasmídica de un cultivo bacteriano El método más común para ello es romper las células de dicho cultivo mediante un choque alcalino de modo que sólo permee selectivamente su ADN plasmídico. Para ello, se toma un volumen de 2-5 mL de un cultivo crecido en medio líquido y se centrifuga, aislando así las células de aquél. Después, se resuspende dicho pellet y se expone dicha suspensión a una disolución que contiene NaOH y dodecilsulfato de sodio (SDS), la cual solubiliza en parte lamembrana externa de las bacterias Gram negativas, lo que produce la liberación del contenido celular de éstas: ADN genómico y plasmídico desnaturalizados, ARN, proteínas... Tras esto, se añade a la mezcla acetato potásico, acídico, lo cual neutraliza todo el debriscelular y provoca la rápida renaturalización del ADN plasmídico, que queda en suspensión, mientras que el genómico y el resto de componentes celulares se reticulan y precipitan ayudados por la alta concentración de sales, especialmente del recién generado dodecil sulfato de potasio. Finalmente, se centrifuga nuevamente la mezcla para aislar elsobrenadante, rico en el ADN plasmídico y en ARN, el cual deberá ser eliminado mediante una ribonucleasa.La miniprep es la técnica inicial de purificación y concentración de ADN plasmídico para cualquiera de sus posibles fines, entre los que destaca la clonación Existen muchos protocolos de la extracción del ADN, ¿De que depende la selección de un protocolo en particular? La aplicación de las diferentes técnicas empleadas en biología molecular para el análisis del genoma, depende en gran medida de la habilidad para extraer el ADN. Para lo cual se utilizan diversos métodos de extracción, dependiendo del tipo de tejido a emplear. ¿Qué aplicaciones tiene la extracción de ADN?
  14. 14. LABORATORIO DE GENETICA 14 Para aislar el ADN hay que hacer que precite en alcohol. El ADN es soluble en agua pero cuando se encuentra en alcohol se desarrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua.ademas de pemitirnos ver el ADN,el alcohol separa del ADN e otros componentes celulares, los cuales son dejaos en la solucion acuosa. esto es la continuacion si hoy no dormimos. ¿Cómo se almacena el ADN e células procariotas y eucariotas? CÉLULA PROCARIOTA: -Su núcleo es primitivo, pues carece de membrana nuclear. La información genética se almacena en moléculas de ADN que tienen forma circular (no en doble hélice como en las eucariotas). Dichas moléculas se ubican, en algunas bacterias, en la llamada zona nuclear.En lugar de tener organelos, como cloroplastos y mitocondrias, encargados de las funciones energéticas, presentan los llamados cuerpos membranosos, que se forman de invaginaciones de la membrana plasmática; y cumplen funciones de respiración y fotosíntesis.-La transmisión del material genético no se cumple por mitosis, sino mediante división directa. No se forma entonces el aparato miótico.-La pared celular tiene estructura y composición química particulares. En ellas predominan un glucopíptedo llamado mureína.-El volumen de las células procariotas es menor pues oscila entre 1 y 2 micrómetros. Las células eucariotas presentan tamaño mayor: de 10 a 100 micrómetros.-La división celular en procariotas es por fisión binaria gemación, no hay mitosis. En eucariotas sí hay diversas formas asociadas con mitosis.-Sistema sexual, cuando está presente en procariotas, hay transferencia unidireccional de genes desde el dador al receptor. En las eucariotas hay fusión nuclear completa de genomas gaméticos equivalentes, asociados con la meiosis.Organelos de movimiento: en procariotas son flagelos simples; en eucariotas cilias o flagelos complejos, cuando están presentes. CELULAS EUCARIOTAS: Tienen su núcleo definido, en éste, la célula guarda su información genética. Una célula eucariota tiene citoplasma y organelos celulares. Realizan un metabolismo aerobio (Con ayuda de oxigeno).- Algunos eucariontes realizan la fotosíntesis, gracias a la presencia en su citoplasma de orgánulos llamados plastos, los cuales derivan por endosimbiosis de bacterias del grupo denominado cianobacterias (algas azules).- Se puede distinguir tres partes fundamentales: membrana celular, citoplasma y núcleo- El material genético está incluido en un núcleo verdadero el cual se encuentra rodeado por una envoltura membranosa compleja: la envoltura nuclear - Su citoplasma contiene una variedad de organelo membranosos y no membranosos especializados para realizar distintas funcionesLas células eucariotas constituyen todos los organismos eucariotas que incluyen : hongos, protozoarios plantas y animales.
  15. 15. LABORATORIO DE GENETICA 15 DISCUSIÓN Para extraer ADN de un tejido vegetal nuestro primer paso será pesar aproximadamente 600 mg del tejido foliar y depositarlo en un microtubo seguidamente trituramos el tejido con la ayuda de un micropistilo. Macerar el tejido con 1 ml de CTAB para la liberación de acidos nucleicos mediante la ruptura de la membrana celular y nuclear, e incubamos a 64 °C durante 40 minutos. Agregamos 500 µl de cloroformo que este purifica el ADN liberandolo de restos proteínas y otros contaminantes presente y lo mezclamos suavemente hasta obtener un color blanco, colocamos el microtubo con el tejido foliar en la microcentrifuga por 15 minutos a 10,000 rpm, al retirarlo de microcentrifuga observaremos una fase acuosa y otra mas densa, extraemos la fase acuosa y la transferimos a un tubo nuevo, le agregamos de 600 a 800 µl de alcohol absoluto o isopropanol frio para precepitar el ADN y purificarlo, lo mezclamos suavemente hasta observar la precipitación del acido nucleico. Nuevamente colocamos el microtubo por 10 minutos en la microcentrifuga a 14,000 rpm, al retirarlo de la microcentrifuga descartamos el sobrenadente con el cuidado de no descartar el pellet formado, agregamos 400 µl de etanol al 70% para lavar el pellet, descartamos el etanol y dejamos secar el pellet a una temperatura de 60 °C, agregamos de 60 a 120 µl de agua destilada y resuspender. Finalmente almacenamos a -20°C. CONCLUSIONES 1. Al final de la practica describimos el fundamento de la técnica de extracción de acido nucleico. 2. Identificamos un método de extracción de ácidos nucleicos eucariotas. 3. Conocimos la función de cada uno de los reactivos utilizados.
  16. 16. LABORATORIO DE GENETICA BIBLIOGRAFIA  Recovery and characterization of residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modifiedingredients. European Food Research Technology 209, 192-196 Hotzel, H., Müller, W. y Sachse, K. (1999). Zimmermann, A., Lüthy, J. y Pauli, U. (1998).  MARCADORES MOLECULARES Y LA EXTRACCIÓN DE ADN Universidad Nacional de Colombia Grupo de Investigación ASUBAGROIN FCA Unicauca. Reinaldo Velasco Mosquera http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol3/Art32.pdf 16
  17. 17. LABORATORIO DE GENETICA 17  Protocolos para Marcadores Moleculares . Unidad de Biotecnología Agrícola CIAT. Publicación CIAT Delkin Orlando Gonzáles. Natialia Placios, Gerardo Gallego, Joe Tohme. 1995http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/formatos/Protocolo%20de%20extracci%C3% B3n%20de%20ADN%20de%20plantas%20%20Dellaporta%20modificado.pdf  http://es.scribd.com/doc/44809466/Caracteristicas-de-las-celulas-procariota-yeucariota  Boom, R., C J Sol, M M Salimans, C L Jansen, P M Wertheim-van Dillen y J van der Noordaa, 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journalof Clinical Microbiology 28(3): 495-503.  Chomczynski, P. y N Sacchi, 1987. RNA isolation from cultured cells. Analytical Bio chemistry 162: 156-159.  Doyle, JJ y JL Doyle, 1987.A rapid DNA isolation procedure for small quantities offresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin 19: 11-15.

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