1. INMUNOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
INMUNOFLUORESCENCIA
MONTES HIJAR EFRAIN

2. Microscopía de fluorescencia
La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve
a través de un filtro excitador que sólo permite que pase la
radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta
radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada
por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas
fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por
fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor.
Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a
través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de
barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia
de la radiación de excitación.
Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que no llegue al
ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.
Filtros:Excitador: Transparente a λ cortas bloqueando λ más largas. Barrera: Transparente a
λ largas bloqueando λ cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.

3. Inmunofluorescencia
Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este
conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de
microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva
y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de
inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que
cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia
Clínica (Diagnósticos)
Utilidades
Investigación (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia)
Conjugación: Tendremos Ac marcado con fluoróforo y fluoróforo libre.
¿Cómo separamos?
Mediante tamiz molecular o diálisis

4. Imunofluorescência
• Baseia-se na capacidade das moléculas de
anticorpo se ligarem covalentemente a
fluocromos, mantendo a especificidade
contra o antígeno.
• Reagentes Utilizados:
– Anticorpos Marcados (Fluocromos –
Isotiocianato de Fluoresceína* )
– Glicerina Alcalina
– Corantes (Azul de Evans)

5. Imunofluoresência direta
• A reação Ag-Ac é detectada pela emissão
de fluorescência
• Pesquisa de antígeno
• • amostra (Ag??) + Ac específico conjugado
a substância fluorescente (conjugado)*
• microscópio de fluorescência

7. IFI – Imunofluorescência
A- pesquisa de antígeno INDIRETA
• • amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac *
• • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• • microscópio de fluorescência
• • * lavagens
B- pesquisa de anticorpos
• • Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac *
• • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• • microscópio
• • determinação do título e classe do Ac

10. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

16. 1. INTRODUCCION
LOS RESULTADOS DE ALGUNOS EXAMENES UTILIZADOS EN EL
ESTUDIO DE LAS ENFEMEDADES REUMATOLOGICAS:
 PUEDEN CONFIRMAR O NEGAR LA IMPRESION DIAGNOSTICA.
 PUEDEN SER DE UTILIDAD EN EL SEGUIMIENTO DE LOS PACIENTES.
 PUEDEN DETERMINAR EL PRONOSTICO DE LA ENFERMEDAD.

17. 1. INTRODUCCION
EXAMENES IMPORTANTES EN REUMATOLOGIA:
 REACTANTES DE FASE AGUDA
 AUTOANTICUERPOS
 COMPLEMENTO
 LIQUIDO SINOVIAL
 ANTIESTREPTOLISINAS
 ACIDO URICO.

18. 1. INTRODUCCION
AUTOANTICUERPOS
• LAS ENFERMEDADES REUMATOLOGICAS AUTOINMUNES SE
CARACTERIZAN POR PRODUCCION ABUNDANTE DE Ab´s
• LOS PRINCIPALES SON:
– LOS FACTORES REUMATOIDES (FR)
– EL ANTIPEPTIDO CITRULIANO CICLICO (anti-CCP)
– LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA)
– LOS ANTICUERPOS ANTICITOPLASMA DEL NEUTROFILO (ANCA)
– LOS ANTICUERPOS ANTIFOSFOLIPIDOS.

19. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
( ANA )

20. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )
• CELULAS LE: HARGRAVES, RICHMON Y MORTON (1948)
• ESTE HALLASGO DE AYUDA VALIOSA EN EL Dx DE LES, SIRVIO
DE ESTIMULO EN LA INVESTIGACION DE LOS AUTO Ab`s
CONTRA ANTIGENOS NUCLEARES Y CITOPLASMATICOS.
• POR CARENCIA DE SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR
PREDICTIVO, Y POR LAS DIFICULTADES TECNICAS, ESTE
PROCEDIMIENTO FUE REEMPLAZADO POR LA DETERMINACION
DE LOS Ab´s ANTINUCLEARES.

21. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )
• SI BIEN, A LA FAMILIA DE LOS AUTO Ab´s SE LA CONOCE COMO
LA DE LOS Ab´s ANTINUCLEARES, SE SABE QUE ALGUNOS
ANTIGENOS LOCALIZADOS POR FUERA DEL NUCLEO TAMBIÉN
SON IMPORTANTES EN LA AUTOINMUNIDAD…
• … REALMENTE SON Ab´s DIRIGIDOS CONTRA Ag´s INTRA CEL´s.
• PARA DETECTARLOS:
 IFI
 UNA GRAN VARIEDAD DE SUSTRATOS:
• INICIALMENTE TEJIDOS DE RATON (RIÑON, HIGADO).
• ACTUALMENTE LAS CELULAS Hep-2.

22. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )
CELULAS Hep-2
• SON CELULAS DE LINEAS EPITELIALES HUMANAS DEIVADAS DE
UN CARCINOMA LARINGEO.
• CONTINEN EL NUCLEO Y LOS NUCLEOLOS DE GRAN TAMAÑO LO
QUE PERMITE IDENTIFICAR UN AMPLIO RANGO DE ANTIGENOS
NUCLEARES Y CITOPLASMATICOS.
• CON EL EMPLEO DE LAS CEL´s Hep-2-2000, SE PUEDE DETECTAR
FACILMENTE EL anti-Ro, ADEMAS DE OTROS Ag´s CLASICOS.

23. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )
• LA LECTURA SE INICIA CON DILUCIONES DE 1:40.
• UN TITULO > 1:640 + MANIFESTACIONES CLINICAS, SUGIERE
ENFERMEDAD AUTOINMUNE, PRINCIPALMENTE LES, Y SE DEBE
COMPLETAR EL ESTUDIO CON LA IDENTIFICACION DE LOS Ab´s
ESPECIFICOS.
• NO OBSTANTE, SU SOLA PRESENCIA NO ES Dx DE ENFERMEDAD.
SIGNIFICA QUE EXISTE UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA QUE
AMERITA EL SEGUIMIENTO ADECUADO DEL PACIENTE.
• UN TITULO < 1:80 + POCOS SINTOMAS ES POCO SUGESTIVO.

24. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )
• LOS ANA SON MUY UTILES PARA:
– EL Dx
– SEGUIMIENTO Y PRONOSTICO (ALGUNOS)
• SE ENCUENTRAN PRINCIPALMENTE EN:
– LES
– ESCLEROSIS SISTEMICA
– ENFERM MIXTA DEL TEJ CONECTICO
– SIND DE SJÖGREN.

25. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )
• UN PACIENTE CON ANA (-) Y SOSPECHA CLINICA DE ENFER
AUTOINMUNE, REQUIERE LA DETERMINACION DE AUTO Ab´s
ESPECIFICOS, ESPECIALMENTE anti- Ro.
• SIN EMBARGO, UN RESULTADO DE ANA PERSISTENTEMENTE
(-) ES UN ARGUMENTO EN CONTRA DE LES.

26. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )
Too SON (+) LOS ANA
EN EL LUPUS INDUCIDO POR DROGAS.
(HIDRALAZINA, PROCAINAMIDA, INH Y CLORPROMAZINA)
EN ALGUNOS PACIENTES CON ENFERMEDADES CRONICAS.
EN LA ENFERMEDAD HEPATICA CRONICA.
OTRAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES REUMATOLOGICAS.
EDAD AVANZADA.

27. 2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )
 APROX EL 3% DE LOS INDIVIDUOS SANOS PUEDEN TENER
ANA (+) 1:320, Y HASTA EL 32% CON ANA(+) 1:40.
 LOS Ab´s CONTRA Ag´s CITOPLASMATICOS OCURREN EN
ENFERMEDADES MUSCULARES CITOPLASMATICAS Y EN
ALGUNAS ENTIDADES HEPATICAS.

28. SENSIBILIDAD DE LOS ANA EN LAS ENFERMEDADES REUMATICAS Y NO REUMATICAS
07/09/12 28

29. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

30. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
 LOS PATRONES QUE SE OBSERVAN A LA INMUNOFLUORESCE
SON LA CLAVE DE LA ESPECIFICIDAD DEL Ab´, PERO NO
DETERMINAN CON CERTEZA SU TIPO.
 LOS ANA PRODUCEN GRAN VARIEDAD DE PATRONES.
 LOS PATRONES PUEDEN VARIAR EN EL MISMO INDIVIDUO Y
SEGÚN LAS CIRCUNSTANCIAS.
 CON FREC SE ENCUENTRAN PATRONES MIXTOS EN UN
PACIENTE DADO.

31. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
 POR IFI (CELULAS Hep-2), SE IDENTIFICAN 6 PATRONES:
1. PATRON HOMOGENEO O DIFUSO
2. PATRON PERIFERICO O EN ANILLO
3. PATRON MOTEADO FINO
4. PATRON NUCLEOLAR
5. PATRON CENTROMERICO
6. PATRON CITOPLAMATICO.

32. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
1. PATRON HOMOGENEO O DIFUSO
 TODO EL NUCLEO SE COLOREA
 SE DEBE A Ab´s QUE REACCIONAN:
 CON EL COMPLEJO ADN-HISTONA (RIBONUCLEOPROTEINA O NUCLEOSOMA)
 ANTI-dsADN
 ANTI-ssADN

33. 07/09/12 33

34. 07/09/12 34

35. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
1. PATRON HOMOGENEO O DIFUSO
 UN TITULO ALTO (>1:640) ES SUGESTIVO DE LES O LUPUS
INDUCIDO POR DROGAS.
 CON LAS CELULAS HEp-2 SE DEBEN COLOREAR LAS FIGURAS
EN MITOSIS.

36. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
2. PATRON PERIFERICO O EN ANILLO
 EL NUCLEO SE COLOREA PRINCIPALMENTE EN LA PERIFERIE.
 SE PRODUCEN Ab´s CONTRA EL DNA NATIVO

37. 07/09/12 37

38. 07/09/12 38

39. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
2. PATRON PERIFERICO O EN ANILLO
 EN TITULOS ALTOS, ES CASI EXCLUSIVO DE LES.
 ESTE PATRON SE ASOCIA CON Ab´s CONTRA EL ds ADN O EL
ss ADN.
 DESAFORTUNADAMENTE, Ab´s CONTRA LA MEMBRANA
NUCLEAR PRODUCEN UN PATRON SIMILAR NO ESPECIFICO DE
LUPUS
 PERO LA AUSENCIA DE LAS CELULAS EN MITOSIS AYUDA A
ESTABLECER LA DIFERENCIA.

40. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
3. PATRON MOTEADO FINO
 LA COLORACION DEL NUCLEO ES RETICULAR O MOTEADA.
 LO OCACIONAN ANTICUERPOS QUE REACCIONAN CON UNA
GRAN VARIEDAD DE Ag´s NUCLEARES EXTRACTABLES (ENA)

41. 07/09/12 41

42. 07/09/12 42

43. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
3. PATRON MOTEADO FINO
 ESTOS Ab´s REACCIONAN PRINCIPALMENTE CON PROTEINAS
NUCLEARES NO HISTONA (PROTEINAS ACIDAS).
LAS MAS FREC:
 Sm
 U1 RNP
 LA SS-B
 Ro (SS-A)
 Scl-70
 ARN POLIMERASAS.

44. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
3. PATRON MOTEADO FINO
 ESTE PATRON SE ENCUENTRA EN
 LES
 ENFERMEDAD MIXTA DEL TEJIDO CONECTIVO
 ESCLEROSIS SITEMICA
 ARTRITIS REUMATOIDE
 SINDROME DE SJÖGREN
MENOS FREC EN OTRAS ENTIDADES.

45. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
4. PATRON NUCLEOLAR
 UNICAMENTE SE COLOREAN LOS NUCLEOLOS.
 POSIBLEMENTE LO OCACIONAN Ab´S QUE REACCIONAN CON
EL ARN NUCLEOLAR.
 EN TITULOS ALTOS ESTE PATRON ES MAS COMUN EN
ESCLEROSIS SISTEMICA.

46. 07/09/12 46

47. 07/09/12 47

48. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
5. PATRON CENTROMERICO
 SE DEBE A Ab´s CONTRA LOS CENTROMEROS.
 ES SIMILAR AL PATRON MOTEADO PERO CON
CARACTERISTICAS ESPECIALES:
 LOS PUNTOS DE FLUORESCENCIA NUCLEAR SON UNIFORMES
 MAS GRANDES Y FACILES DE CONTAR (GENERALMENTE 40 A 60 POR
NUCLEO)
 LAS CELULAS EN MITOSIS TIENEN EL MISMO PATRON DE
FLUORESCENCIA EN LOS CROMOSOMAS.

49. 07/09/12 49

50. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
5. PATRON CENTROMERICO
 ESTE PATRON SE ENCUENTRA PRINCIPAMENTE EN EL SIND DE
CREST
 CON MENOR FREC EN LA ENFER DE RAYNOUD,
ESCLERODERMIA, CIRROSIS BILIAR PRIMARIA, LES Y AR.

51. 3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
6. PATRON CITOPLASMATICO
 LO OCACIONAN ANTICUERPOS CONTRA COMPONENTES DEL
CITOPLASMA (RIBOSOMAS, MITOCONDRIAS, AMINOACIL tARN
SINTETASAS Y PROTEINAS DEL COTOESQUELETO).
 SE ENCUENTRAN PRINCIPALMENTE EN ENFERMEDADES
INFLAMATORIAS DEL MUSCULO, ENFERMEDADES HEPATICAS Y
LES (anti-P ribiosomasl)

52. 07/09/12 52

53. 07/09/12 53

54. 07/09/12 54

55. 4 . ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES

56. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
 LOS ANA SON LA CARACTERISTICA INMUNE DEL LES.
 SE ENCUENTRAN EN CASI TODOS LOS PACIENTES.
 LA MAYORIA DE LOS ANTIGENOS, BLANCO DE LOS Ab´s, SON DE
ORIGEN NUCLEAR.
 LOS Ag´s SE PUEDEN CATEGORIZA EN: ASOCIADOS A
CROMATINA O RIBONUCLEOPROTEINAS.

57. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
 EN LES PODEMOS ENCONTRAR LOS SIGUIENTES Ab´s:
 Anti-DNA
 Anti- Sm y anti-RNP
 Anti-Ro/SS-A y anti-LA/SS-B
 Antihistona
 Antirribosoma (anti-P ribosomal)
 Anticromatina
 Anti-Ku
 Ant-PCNA

58. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
1. ANTI-ADN
 ES UN ANTICUERPO DIRIGIDO CONTRA EPITOPES DEL ADN
 EXISTEN DOS TIPOS:
1. EL DE CADENA DOBLE O NATIVA: MUY ESPECIFICO DE LES.
OCACIONALMENTE POSITIVO EN TITULO BAJO EN LA AR SEVERA
O EN EL SIN DE SJÖGREN
2. EL CADENA SENSILLA O DESNATURALIZADO: SE ENCUENTRA EN
LES Y EN OTRAS ENTIDADES. TIENE POCA UTILIDAD Dx.

59. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
1. ANTI-ADN
 SE ENCUENTRA EN EL 60 – 70% DE PACIENTES CON LES
ACTIVO
 PRINCIPALMENTE CUANDO EXISTE COMPROMISO RENAL,
USUALMENTE ASOCIADO CON HIPOCOMPLEMENTARINEMIA,
LO CUAL SE DEBE A SU PODER NEFRITOGENICO (ALTA AFINIDAD,
CARGA CATIONICA, IgG Y CAPACIDAD DE FIJAR EL COMPLEMENTO)
 FLUCTUA CON LA ACTIVIDAD DE LA ENFERMEDAD Y POR LO
GENERAL DESAPARECE CON LA TERAPIA.

60. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
1. ANTI-ADN
 OCASIONALMENTE SE ENCUENTRA EN PACIENTES EN
REMISION O INACTIVOS.
 ESTE Ab SE SOSPECHA CUANDO ELPATRON DE LA IFI, CON
CEL´s Hep-2, ES HOMOGENEO O PERIFERICO.

61. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
2. ANTI-Sm Y ANTI-RNP
 CONSTITUYEN UNA FAMILIA DE AUTOANTICUERPOS QUE
REACCIONAN CON PROTEINAS NUCLEARES NO HISTONAS.
 EL ANTIGENO SMITH (Sm) ABARCA UNA SERIE DE PROTEINAS
(B, B´, D, E, F, y G) QUE FORMAN COMPLEJOS CON LOS
FRAGMENTOS ARN (U1, U2, U4-6, U5); RECIBEN EL NOMBRE DE
snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) Y SON NECESARIOS
PARA FRAGMENTACION DEL PRECURSOR DEL mARN.

62. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
2. ANTI-Sm Y ANTI-RNP
 EL Ab CONTRA EL ANTIGENO Sm ES ESPECIFICO DE LES.
PERO SOLO SE ENCUENTRA EN 10 – 30% DE CASOS.
 TIENE GRAN SIGNIFICADO Dx PRINCIPALMENTE CUANDO EL
anti-ADN ES (-).
 ASOCIADO CON EL anti-RNP PARECE SER PROTECTOR DE
NEFROPATIA.
 NO SE RELACIONA CON LA ACTIVIDAD DE LA ENFERMEDAD NI
CON LAS MANIFESTACIONES ESPECIFICAS.

63. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
2. ANTI-RNP
 El ANTICUERPO anti-RNP SOLO SE UNE A UNA PROTEINAQUE
CONTIENE ARN U1.
 EN TITULO ALTO ES SUGESTIVO DE ENFERMEDAD MIXTA DEL
TEJIDO CONECTIVO Y CON FREC SE ASOCIA CON FENOMENO
DE RAYNAUD.
 TAMBIEN SE ENCUENTRA EN EL LES (30 – 60% DE LOS CASOS)
PERO NO SE CORRELACIONA CON LA ACTIVIDAD Y, EN TITULO
MAS BAJO, CON ESCLEROSIS SISTEMICA, EL SIND DE
SJÖGREN Y LA AR

64. 4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES
2. ANTI-Sm Y ANTI-RNP
 ESTOS DOS Ab´S SE SOSPECHAN CUANDO EN LA IFI EL
PATRON ES MOTEADO PERO USUALMENTE SE REQUIEREN
EXAMENES CONFIRMATORIOS POR ELISA

65. GRACI AS