Ancient DNA studies

1. Genetica di popolazioni 11: DNA antico

2. DNA antico
1.Breve storia degli studi di DNA antico (1985-2014)
2.Tecniche per lo studio del DNA antico
3.Un esempio: le mummie di Linzi
4.Modelli di storia demografica umana
5.Cosa ci dice il DNA di Neandertal?

3. Studying ancient
DNA is tricky

4. 1984. In Allan Wilson’s laboratory, the mtDNA sequence is
determined of an extinct Mammal, the quagga, and its systematic
position

5. 1985. Svante Pääbo obtains the first ancient human sequence,
from an Egyptian mummy
1989. A replication of the experiments shows that the 1985 sequence
contained two errors

6. 1994. Svante Pääbo and Bryan Sykes extract and type the mtDNA
of the Similaun iceman (Ötzi)
Further DNA analyses lead to identification of his parasites and to
reconstruction of the main component of his diet.

7. 1994. Scott Woodward announces to have sequenced DNA from
an 80-million-years-old Dinosaur bone
1995. S. Blair Hedges, Svante
Pääbo and Marc Allard
demonstrate that Woodward
really amplified human DNA

8. 1997. In Svante Pääbo’s lab the first Neandertal mtDNA sequence
is typed, very different from modern human sequences

9. Location of the main Neandertal samples from which amplifiable
DNA was obtained

10. Briggs et al. (2009)
mtDNA trees place Neandertals out of the range of modern
human variation

11. 2005. The evolutionary relationships of the sabretooth tiger
(Smilodon) are identified in Alan Cooper’s lab

12. 2006. Hendrik Poinar’s mtDNA analysis shows a closer
relationship between Mammoth and Asian elephant than
between the two elephant species

14. 2006. Edward Rubin’s and Svante Pääbo’s labs publish,
respectively, 60,000 and 1 million base nuclear sequences of a
Neandertal individual

15. 2007. Wall and Kim demonstrate errors in the 1 million base
Neandertal nuclear sequence
Estimates of the divergence
time for Neandertals and
Europeans

16. 2003, 2008. The mtDNA of the anatomically modern Cro-Magnon
people is shown to differ from the mtDNA of the almost
contemporary Neandertal people

17. Green et al. (2007)
2007. First draft of Neandertal genomic DNA

18. 2010. A new human species, Denisovans, identified from DNA
evidence

19. Tecniche per lo studio del DNA antico
1. Estrazione
2. Prima amplificazione
3. Clonaggio
4. Seconda amplificazione e sequenziamento

20. Materiale di partenza
costole
ossa lunghe
denti
• OSSA
• DENTI
• TESSUTI MUMMIFICATI
• COPROLITI

21. TAGLIO del FRAMMENTO
PULIZIA
POLVERIZZAZIONE
Preparazione dei campioni

22. Mettere 1 gr di polvere d’osso in un tubo da centrifuga di
polipropilene da 15 ml e aggiungere:
3.5 ml di SSC 1X con Pipetus
SDS 10% pari allo 0.5% del volume finale (175 µl) con una
P1000
Chiudere bene i tubi e mescolare su rotore per 5 minuti a
temperatura ambiente
Aggiungere un volume equivalente di fenolo saturo in Tris-HCl
pH 8
Mescolare su rotore per 45 minuti a temperatura ambiente
Mettere in centrifuga per 15 minuti a 5500 rotazioni per minuto
(rpm) e a 4°C
Recuperare il surnatante (fase acquosa) e metterlo in un nuovo
tubo da 15 ml pulito
Aggiungere un volume equivalente di fenolo-cloroformio-alcool
isoamilico saturo in Tris-HCl pH 8
Mescolare su rotore per 5 minuti a temperatura ambiente
Centrifugare per 10 minuti a 4000 rpm e a 4°C
Recuperare il surnatante e metterlo in un nuovo tubo da 15 ml
pulito
Aggiungere un volume equivalente di cloroformio-alcool
isoamilico
Mescolare su rotore per 5 minuti a temperatura ambiente
Centrifugare per 10 minuti a 4000 rpm e a 4°C
Recuperare il surnatante (circa 2 ml) in cui è contenuto il DNA, e
Estrazione con il metodo del fenolo-cloroformio

23. ACIDI UMICI
TANNINI
Possibili inibitori della Taq
polimerasi presenti nel suolo
Purificazione dell’estratto

24. La PCR aumenta esponenzialmente il numero di
molecole di DNA
Occorre conoscere almeno in parte la sequenza nucleotidica del
frammento di DNA che vogliamo amplificare, e in particolare le
sue estremità:

25. 1) Denaturazione a
94°C
2) Appaiamento dei
primers a 50-60°C
3) Estensione a 72°C
Il meccanismo della PCR

26. Il meccanismo della PCR

27. Per una PCR di 35 cicli: 34 miliardi di copie
Il risultato della PCR

28. Evoluzione della PCR

29. Con la clonazione si creano copie identiche (cloni) di un
frammento di DNA
DIFFERENZE con la PCR:
• è una reazione in vivo
→ sfrutta l’apparato di replicazione del DNA delle cellule batteriche
non necessita nessuna conoscenza a priori della sequenza del frammento di DNA da
clonare
→ non si usano primers
• è un processo più accurato
→ le copie di DNA ottenute sono esattamente identiche l’una all’altra
→ sistemi di ‘correzione degli errori’ cellulari

30. Come funziona il clonaggio del DNA?
1. Il DNA da clonare viene tagliato con
un enzima di restrizione
4. Il PLASMIDE RICOMBINANTE viene
inserito in una cellula batterica e al suo
interno si duplica
2. inserito in un plasmide tagliato
con lo stesso enzima
3. ad opera della LIGASI o della
TOPOISOMERASI
ENZIMA di RESTRIZIONE
PLASMIDE
LIGASI -
TOPOISOMERASI
PLASMIDE RICOMBINANTE
CELLULA BATTERICA

31. Clonaggio negli studi di DNA antico
Negli estratti di DNA sono presenti più copie di ogni regione del genoma →
dipende dal numero di cellule del tessuto di partenza
In un estratto ottenuto da un reperto antico alcune copie di una determinata
regione sono integre, altre sono degradate:
ATTGC ATTCGC
TAACGTTAAGCG
ATTGC ATTCGC
TAACGTTAAGCG
ATTGC ATTCGC
TAACGTTAAGCG
ATTGCAATTCGC
TAACGTTAAGCG
ATTGCAATTCGC
TAACGTTAAGCG

32. RISULTATO
file visualizzato al computer

33. Mol. Biol. Evol. 17(9):1396–1400. 2000

35. Distribuzione geografica dei 6 gruppi nel continente asiatico centro-orientale.
I 3 blocchi di Linzi, che rappresentano 3 periodi storici distinti, sono molto diversi tra di loro
Distribuzione geografica degli alleli mitocondriali

36. Neighbor-joining delle popolazioni

37. Popolazioni:
1 Linzi (2500 anni); 2 Linzi (2000 anni); 3 Linzi (attuali); 4 Giapponesi (mainland); 5 Coreani;
6 Ainu; 7 Giapponesi (Okinawa); 8 Mongoli; 9 Altai; 10 Kazaki; 11 Kirgizi (Talas);
12 Kirgizi (Sary-Tash); 13 Uighurs; 14 Turchi; 15 Portoghesi; 16 Islandesi;
17 Tedeschi; 18 Finlandesi; 19 Gallesi
Popolazioni
moderne
europee
Popolazioni moderne
centro-asiatiche
Popolazioni moderne
asiatico-orientaliLinzi (2500
anni)
Linzi (2000
anni)
Linzi
(moderni)
Multi-dimensional scaling

38. CAMPIONI ANALIZZATI MINOR DISTANZA GENETICA
Linzi: campioni di sangue
prelevato da 50 abitanti moderni
Mongoli, Giapponesi, Coreani…
Linzi (sito di Yixi):
reperti umani di 2000 anni fa
Kirghizi, Kazaki, Uighuri…
Linzi (sito di Liangchun):
63 reperti umani di 2500 anni fa
Turchi, Islandesi, Finlandesi…
 C’è una buona affinità genetica negli attuali abitanti di Linzi con le moderne
popolazioni orientali (Mongoli, Giapponesi, Coreani…)
 Diversa è la situazione mostrata dai reperti di 2000 anni fa, i quali indicano una
somiglianza con le popolazioni centro asiatiche (Kirgizi, Kazaki, Uighurs…)
 Ancor più singolare è la situazione indicata dai reperti di 2500 anni fa, con la minor
distanza genetica verso popolazioni europee (Turchi, Islandesi, Finlandesi…)

39.  Il background genetico dei 3 blocchi di reperti studiati è sostanzialmente diverso e si
presenta ben distinto sui vari blocchi
 Andando indietro nel tempo si ha una variazione nella struttura genetica, che diventa
più simile a quella delle popolazioni oggi dislocate nell’Asia centrale e in Europa
 I periodi storici considerati furono epoche molto travagliate: durante l’epoca dei
“Regni combattenti” Linzi, capitale del regno feudale di Quin, conquistò altri regni,
formando il primo nucleo di quello che sarà, in Cina, il futuro Celeste impero. E’ lecito
supporre che vi fu un notevole rimescolamento nella popolazione, dovuto alle inevitabili
deportazioni e migrazioni di un gran numero di persone
 Una popolazione simil-europea doveva vivere nella zona di Linzi, 2500 anni fa, ma, 500
anni dopo, la situazione era già parecchio cambiata, con una struttura genetica più simile
a quella delle attuali popolazioni centro-asiatiche
In conclusione

40. Coon: 5 sottospecie nella nostra specie
“A subspecies meets
two tests: (1) it
occupies a distinct
geographical territory;
(2) it differs from other
subspecies in
measurable
characteristics to a
considerable degree”.

41. L’ipotesi del candelabro
(Coon)
• Le razze umane si sono
separate molto tempo fa
(>500 mila anni fa) e si
sono evolute in sostanziale
isolamento
Differenze attese fra continenti: molto grandi
Neandertal diretti antenati degli europei
Neandertal

42. L’ipotesi multiregionale
(Wolpoff)
• I gruppi umani si sono
separati molto tempo fa (1
milione di anni fa) e si sono
evoluti come una sola specie
attraverso continui scambi
migratori
Differenze attese fra continenti: grandi
Neandertal diretti antenati degli europei, almeno in buona parte
Neandertal

43. L’ipotesi out-of-Africa
(Stringer)
• I gruppi umani che si sono
separati molto tempo fa (>1
milione di anni fa) sono stati
rimpiazzati di recente da un
gruppo uscito dall’Africa
Neandertal
Differenze attese fra continenti: piccole
Nessuna relazione genealogica fra Neandertal ed europei

44. Quattro modelli

45. Contributo genetico delle popolazioni africane ai pool
genici non africani secondo i quattro modelli

46. Fagundes et al. (2007)
Models with an African population replacing previous human
continental groups explain genetic data better than any
alternative models

48. Neandertals, the closest evolutionary relatives of present-day humans, lived
in large parts of Europe and western Asia before disappearing 30,000 years
ago.
We present a draft sequence of the Neandertal genome composed of more
than 4 billion nucleotides from three individuals.
Comparisons of the Neandertal genome to the genomes of five present-day
humans from different parts of the world identify a number of genomic
regions that may have been affected by positive selection in ancestral
modern humans, including genes involved in metabolism and in cognitive
and skeletal development.
We show that Neandertals shared more genetic variants with present-day
humans in Eurasia than with present-day humans in sub-Saharan Africa,
suggesting that gene flow from Neandertals into the ancestors of non-
Africans occurred before the divergence of Eurasian groups from each
other.
Riassunto

49. 1. In tutti i campioni, test per la presenza di mtDNA neandertaliano
2. mtDNA di Vi33-26 e Vi33-16 indistinguibili, ma diff(entro) < diff(tra)
3. Piattaforma 454, selezionate sequenze con un match migliore con i primati che
con qualunque altro organismo (contaminazione batterica)
4. Fra il 95% e il 99% di sequenze provengono da non primati
5. Arricchimento delle libraries con enzimi che tagliano preferenzialmente i genomi
batterici
6. Prevalente selezione di regioni ricche di GC
Analisi preliminari

50. Sequenziamento e allineamento del genoma
1. Circa 4 miliardi di bp sequenziate
2. Sequenze allineate con le sequenze di riferimento umane o di scimpanzè
3. Ogni frammento sequenziato su entrambe le eliche, e in genere più di una volta
4. Contaminazione inferiore allo 0.5%
5. Sequenze aggiuntive (in quantità molto minore) da 3 altri campioni neandertaliani
6. Cinque sequenze moderne ex-novo: San, Yoruba, Papua NG, Han, Francese

51. Divergenza da umani moderni
Divergence human-Neandertal = 12.7% (11.9 to
12.4% for the X-chromosome). Assuming a DNA
divergence of 6.5 Myears between human and
chimpanzee genomes, point estimate for the
average divergence of Neandertal and modern
human autosomal DNA sequences of 825,000
years.
At the genomic, but not mtDNA, level,
Neandertals fall inside the variation of present-
day humans.

52. Mutations in several genes in Table 3 have been associated
with diseases affecting cognitive capacities. It may thus be
that multiple genes involved in cognitive development
were positively selected during the early history of modern
humans.

53. Mescolanza fra Neandertal e moderni
1. Identified SNPs by comparing one randomly chosen sequence from each of two
present-day humans and asking if the Neandertals match the alleles of the two individuals
equally often (H0, expected if gene flow between Neandertals and modern humans
ceased before differentiation between present-day human populations began
2. H0 insensitive to demographic history. When single chromosomes are analyzed in two
present populations, differences in demographic histories in the two populations will not
affect the results even if they may profoundly influence allele frequencies.
3. Under the alternative model (H1) of later gene flow between Neandertals and modern
humans, we expect Neandertals to match alleles in individuals from some parts of the
world more often than the others.
4. Analysis restricted to biallelic SNP where two humans carry different alleles and
Neandertals carry the derived (non-chimp) allele.
5. Comparison with 2 Eur. Americans, 2 East Asians, 4 Yoruba from HapMap ??

54. Il test D di introgressione a quattro taxa (ABBA – BABA)
Pop 1 Pop2 Neand Outgr Pop1 Pop2 Neand Outgr
Se i livelli di somiglianza genetica con Neandertal sono uguali per Pop1 e Pop2, E(D) = 0.
D>0 suggerisce introgressione con Pop 2, D<0 suggerisce introgressione con Pop1

55. Han
Papuan
French
Yoruba
San
Segmenti di genoma neandertaliano in genomi non africani

56. Segmenti di genoma neandertaliano in genomi non africani
1. Statistic: D= Difference in shared alleles shared with Neandertals between two
humans.
2. D(Asia-Europe) = -0.53, P=0.25
3. D(Europe-Africa) = 4.57, D(Asia-Africa) = 4.81, both P<10-12
4. The greater genetic proximity of Neandertals to Europeans and Asians than to
Africans is seen no matter how we subdivide the data: (i) by individual pairs of
humans, (ii) by chromosome, (iii) by transitions or transversions, (iv) by
hypermutable CpG versus all other sites, (v) by Neandertal sequences shorter or
longer than 50 bp.
5. Contamination of the Neandertal sequences with non-African DNA? However,
the magnitude of contamination necessary to explain the Europe-Africa and Asia-
Africa comparisons are both over 10% and thus inconsistent with estimates of
contamination in the Neandertal data, all below 1%

57. Quattro processi che potrebbero spiegare i dati
Between 1 and 4% of the genomes of
people in Eurasia are derived from
Neandertals
1. Da erectus a Neandertal
2. Da tardi Neandertal ai primi
europei o asiatici
3. Da Neandertal agli antenati di tutti
i non africani
4. Antica struttura di popolazione,
conservata da prima dell’origine
dei Neandertal

58. Forse nel nostro genoma ci sono le tracce di
un’ibridazione con forme umane scomparse?

59. Forse nel nostro genoma ci sono le tracce di
un’ibridazione con forme umane scomparse?
Stoneking and Krause (2011) Nature Rev Genet 12: 603-614

60. Abi-Rached et al. (2011) Science 334: 89-94
Population Freq.
Papua Wosera 20.5 %
Australia Kimberley 8.3 %
China Yunnan 9.0 %
Israeli Jews 3.0 %
Albanians 2.5 %
Finnish 1.1 %
Ibridazioni a più non posso

61. Una possibile distribuzione delle forme umane, 70
mila anni fa
floresiensis
sapiens
erectus
neandertalensis
denisova

62. Campioni neandertaliani studiati a livello genetico
Testing for genetic continuity between Neandertals and
modern Europeans by coalescent simulation and ABC

63. Confronto fra sequenze mitocondriali neandertaliane e la CRS

64. Confronto fra sequenze mitocondriali neandertaliane ,
cro-magnoidi , e contemporanee

65. Confronto fra modelli

66. Confronto fra modelli

67. Model 2 Prior distributiona
Ne Modern {U: 1,000,000 - 10,000,000}
Ne Neandertal (before extinction) {U: 5,000 - 100,000}
Separation Time {U: 40,575 - 900,000}
Mutation Rate {U: 0.0002 - 0.008}
Ancestral NeCro-Magnoid {U: 5 - 5,000}
Ancestral Ne Neandertal {U: 5 - 5,000}
Model 3 Prior distributiona
Ne Modern {U: 1,000,000 - 10,000,000}
Ne Cro-Magnoid (before extinction) {U: 5,000 - 100,000}
Separation time {U: 40,575 - 900,000}
Mutation Rate {U: 0.0002 - 0.008}
Ancestral NeModern {U: 5 - 5,000}
Ancestral NeNeandertal {U: 5 - 5,000}
Model 4 Prior distributiona
Ne Modern {U: 1,000,000 - 10,000,000}
Ne Neandertal (before extinction) {U: 5,000 - 100,000}
Time Out of Africa {U: 50,000 - 80,000}
Separation Time {U: 80,025 - 900,000}
Mutation Rate {U: 0.0002 - 0.008}
Ancestral Ne Cro-Magnoid {U: 5 - 5,000}
Ancestral Ne Neandertal {U: 5 - 5,000}
Ne before Out Of Africa {U: 5,000 - 100,000}
Distribuzioni delle probabilità a priori dei parametri

68. Distribuzioni delle probabilità a posteriori dei parametri

69. % of model attribution
MOD1 MOD2 MOD3 MOD4
Type I
error
SIMULATED
MODEL
MOD1 0.992 0.005 0.003 0 0.008
MOD2 0.031 0.947 0.009 0.012 0.052
MOD3 0.015 0.022 0.962 0.001 0.038
MOD4 0.002 0.031 0.002 0.963 0.035
Table 3.
Power of the AR procedure to recover the true model, estimated as the
proportion of cases in which data generated by the models listed on the Y-axis
were attributed to the models listed on the X-axis . Type I error , in the last
column, is the fraction of cases in which the true model was not identified.

70. Una possibile interpretazione

71. Le cose si complicano:
la Southern route

72. Henn et al. (2012) Proc Natl
Acad Sci USA 109: 17758-17764
Scally and Durbin (2012)
Nature Rev Genet 13: 745-753

75. Se gli antenati dei papuani sono arrivati prevalentemente attraverso la
Southern route, sono passati a 1500 km dal Neandertal più vicino con cui
ibridarsi
Qualche ipotesi migliore?
I modelli di ibridazione hanno un piccolo problema

76. E se contasse la struttura della popolazione antica?
Neandertals
Ancestors of Eurasians
Ancestors of Africans