Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SPP.
PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN
TRUYỀN THỐNG ĐỂ KÉO DÀI
THỜI GIAN BẢO QUẢN BÁNH MÌ
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: ThS. Huỳnh Phương Quyên
TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thái Thiên Dung
MSSV: 1311100223 Lớp: 13DSH01
TP.Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc.
TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017
Học viên thực hiện luận văn
Nguyễn Thái Thiên Dung

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy, Cô trường
Đại học Công Nghệ TP. HCM đã nhiệt tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cũng như
niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho sinh viên trong suốt thời gian học tập.
Để hoàn thành được đồ án “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập
từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì”
trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải không ít
lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của ThS.
Huỳnh Phương Quyên và TS. Nguyễn Hoài Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ
Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những
kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của
ngày hôm nay. Em xin chân thành cảm ơn các Cô.
Em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc
và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe.
Cám ơn các bạn đại học khóa 2013 – 2017 và các em khóa 2015 – 2019 trường
Đại học Công nghệ TP. HCM, luôn bên cạnh và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm
đồ án tại truờng. Cuối cùng, từ tận đáy lòng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia
đình đã luôn dành tình yêu thương vô vàn cho con, đã luôn ủng hộ, động viên và tạo
niềm tin để con luôn vững bước trên con đường mình đã chọn.
TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017
Sinh viên thực hiện đồ án
Nguyễn Thái Thiên Dung

Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT.......................................................................................v
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................vi
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ..........................vii
MỞ ĐẦU................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài..........................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu..............................................................................2
3. Mục tiêu...................................................................................................2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu ..............................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu........................................................................3
6. Kết quả đạt được của đề tài....................................................................3
7. Kết cấu đồ án...........................................................................................3
Chương 1: TỔNG QUAN......................................................................................5
1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic..................................................................5
1.1.1 Giới thiệu chung ...............................................................................5
1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus .........................................7
1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic.........................................9
1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn lactic .................................................................10
1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic...............12
1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất.................................................................12
1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic .......................................................13
1.1.3. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic ......................................14
1.2 Tổng quan về nấm mốc.........................................................................15
1.2.1. Đặc điểm .........................................................................................16
1.2.2 Độc tố do nấm tiết ra.......................................................................16
1.2.3 Tác hại của nấm..............................................................................17

ii
1.2.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm ....................................17
1.3 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì..........................................18
1.3.1 Giới thiệu chung .............................................................................18
1.3.2 Quy trình làm bánh mì....................................................................19
1.3.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì..................23
1.3.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì .................................24
1.4 Tổng quan về bột chua..........................................................................25
1.4.1. Đặc tính của bột chua.....................................................................25
1.4.2. Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua .................................26
1.4.3. Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với
hương vị của bánh mì ...................................................................................27
1.4.4. Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua...........28
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................31
2.1. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................31
2.2. Thời gian thực hiện ...............................................................................31
2.3. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................31
2.3.1. Giống vi sinh vật .............................................................................31
2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng ....................................................31
2.3.2.1. Hoá chất.......................................................................................31
2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy.....................................................................31
2.4. Thiết bị và dụng cụ................................................................................32
2.4.1. Thiết bị ............................................................................................32
2.4.2. Dụng cụ...........................................................................................32
2.5. Phương pháp luận.................................................................................32
2.6. Phương pháp nghiên cứu......................................................................33
2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................33
2.6.2. Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. .............................................34
2.6.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa ...............34
2.6.2.2 Khả năng sinh acid..........................................................................37

iii
2.6.2.4 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro
...................................................................................................................38
2.6.3. Xây dựng đường chuẩn...................................................................41
2.6.3.1. Lactobacillus spp..........................................................................41
2.6.3.2. Nấm mốc Aspergillus niger...........................................................44
2.6.4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh
mì của vi khuẩn LAB với nấm men...............................................................47
2.6.5 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì..................50
2.6.5.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn
Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau...........50
2.6.5.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có
bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản..52
2.6.5.3 Độ nở bánh mì..............................................................................54
2.6.5.4 Độ ẩm bánh mì.............................................................................54
3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. ...................................................55
3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa ................55
3.1.2 Khả năng sinh acid.............................................................................56
3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro
.......................................................................................................................57
3.2 Xây dựng đường chuẩn.........................................................................59
3.2.1. Lactobacillus spp. ...........................................................................59
3.2.2. Nấm mốc Aspergillus niger ............................................................59
3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng
lên men bánh mì với nấm men ........................................................................60
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì .......................63
3.4.1. Đánh giá cảm quan ...........................................................................63
3.4.1.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn
Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau...........63

iv
3.4.1.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có
bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản..66
3.4.2 Đánh giá độ nở...................................................................................68
3.4.3 Đánh giá độ ẩm ..................................................................................71
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................74
1. Kết luận .................................................................................................74
2. Kiến nghị ...............................................................................................75
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................76
Tài liệu tiếng Việt ............................................................................................76
Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................77
PHỤ LỤC THÀNH PHẨN MÔI TRƯỜNG ........................................................1
PHỤ LỤC BẢNG MÃ HÓA MẪU THỬ CẢM QUAN.......................................3
PHỤ LỤC KẾT QUẢ............................................................................................9
PHỤ LỤC HÌNH .................................................................................................11
PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU...............................................................................18

v
DANH MỤC VIẾT TẮT
- VSV: Vi sinh vật
- LAB: Lactic acid bacteria/Lactobacillales
- MRS agar: de Man, Rogosa, Sharpe Agar
- MRS broth: de Man, Rogosa, Sharpe Broth
- PDA: Potato Dextrose Agar
- PDB: Potato Dextrose Broth
- SAS: Statistical Analysis Systems

vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998)....................................................................................15
Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì....48
Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Lactobacillus spp. 55
Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus spp. ......................................57
Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus spp. với nấm mốc theo phương
pháp cấy 2 đường vi khuẩn....................................................................................57
Bảng 3.4: Kết quả mật độ Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1..................60
Bảng 3.5: Bảng tính mật độ nấm mốc để cảm nhiễm.............................................61
Bảng 3.6: Bảng mật độ / khối lượng cần bổ sung ..................................................61
Bảng 3.7: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu....................................................62
Bảng 3.8: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5............64
Bảng 3.9: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.C1............64
Bảng 3.10: Kết quả đánh giá cảm quan mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ
xốp, mùi, vị của các mẫu bánh mì..........................................................................66
Bảng 3.11: Đánh giá chung về mức độ ưa thích của các mẫu bánh mì...................67
Bảng 3.12: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BML5 ...69
Bảng 3.13: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BMC1...69
Bảng 3.14: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của các mẫu bánh mì ........70
Bảng 3.15: Đánh giá độ ẩm của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 và
Lactobacillus sp.C1 ...............................................................................................72
Bảng 3.16: Đánh giá độ ẩm của các mẫu bánh mì khi vừa nướng xong và sau 7 ngày
bảo quản................................................................................................................72

vii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus.................................................................7
Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger................................................................16
Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm .............................................................................18
Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì ..........................................................................20
Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid
lactic (được chuyển thể từ Liu và những người khác năm 2008)............................30
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đề tài..........................................................33
Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus spp........34
Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus spp. .............37
Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm
mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn........................................................39
Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi
khuẩn.....................................................................................................................41
Hình 2.7: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn chủng Lactobacillus spp.................42
Hình 2.8: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn nấm mốc A.niger............................44
Hình 2.9: Vùng đếm hồng cầu ..............................................................................45
Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.
..............................................................................................................................47
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar .......................................................56
Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram............................................................................56
Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus sp.L5 và
Lactobacillus sp.C1...............................................................................................58
Hình 3.4: Đối kháng nấm Aspergillus niger..........................................................58
Hình 3.5: Đường chuẩn củng vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1
..............................................................................................................................59
Hình 3.6: Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus niger..............................................59

viii
Hình 3.7: Khảo sát đối kháng in vivo ....................................................................63
Hình 3.8: Mẫu bánh mì bổ sung 2 chủng lactic chuẩn bị đánh giá cảm quan .........65
Hình 3.9: Tiến hành thí nghiệm cảm quan mẫu bổ sung 2 chủng lactic. ................66
Hình 3.10: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan...........................................68
Hình 3.11: Tiến hành thí nghiệm cảm quan...........................................................68
Hình 3.12: Độ nở của bánh mì ..............................................................................71

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, chất lượng cuộc sống và nhu cầu của
con người ngày càng cao, nhất là nhu cầu về lương thực thực phẩm. Con người đòi
hỏi thực phẩm đa dạng, tiện dụng, an toàn và hiệu quả.
Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, để
lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Khoảng một nửa số dân trên thế giới
dùng bánh mì làm món ăn vào buổi sáng bởi tính tiện dụng. Trên khắp thế giới, bánh
mì rất đa dạng về cả hình dạng và công thức chế biến cũng như cách bảo quản. Sự hư
hỏng của sản phẩm bánh mì chủ yếu là do sự tăng trưởng của nấm; các loài chủ yếu
liên quan đến là Aspergillus, Fusarium, và Penicillium. Ngoài những thiệt hại kinh tế
lớn bắt nguồn từ sự hiện diện của nấm mốc, mối quan tâm khác là việc nấm mốc sản
xuất độc tố tiềm năng có thể gây ra vấn đề sức khỏe cộng đồng (Legan, 1993). Trong
những năm gần đây, bảo quản sinh học (dùng vi khuẩn và / hoặc các chất chuyển hóa
của vi khuẩn để ngăn chặn sự hư hỏng và để kéo dài thời hạn sử dụng của thực phẩm)
(Stiles, 1996) đã đạt được sự quan tâm ngày càng tăng do nhu cầu của người tiêu
dùng. LAB có lịch sử lâu dài trong việc bảo quản thực phẩm khỏi các vi sinh vật gây
hư hỏng - chúng thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, có thể sản
sinh ra một số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và do đó thường được
coi là an toàn (GRAS) (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011),
chẳng hạn như axit hữu cơ, axit béo, hydrogen peroxide và bacteriocins. Hoạt tính
kháng nấm của LAB (Hassan & Bullerman, 2008; Magnusson, Strom, Roos, Sjogren,
& Schnürer, 2003; Sjogren, MAG nusson, Broberg, Schnürer, & Kenne, 2003) có thể
sử dụng để chống nấm mốc kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì.
Chính vì thế, tôi thực hiện đề tài về: “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp.
phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì”.

2
2. Tình hình nghiên cứu
Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm trong
nông nghiệp cả trong nước và trên thế giới.
Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại
nấm bệnh theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi, 2004) như: “Nghiên cứu
sử dụng vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum trong chế biến sữa chua” (Đoàn
Anh Dũng, Nguyễn Công Hà, Lý Nguyễn Bình và Lê Nguyễn Đoan Duy - Khoa
Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, 2015), đồ án tốt nghiệp
“Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus niger và Mucor sp. của
vi khuẩn Lactobacillus sp.L5” (Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015).
Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic
được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong- 75, Hàn Quốc
theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và Schnurer, 2001). Ngăn ngừa sự
hư hỏng nấm mốc bằng cách sử dụng vi khuẩn axit lactic có đặc tính chống nấm
(Carla Luciana Gerez, Maria Ines Torino, Graciela Rollán, Graciela Font de Valdez,
2009). Vi khuẩn acid lactic trong bảo quản nâng cao chất lượng bánh mì (Belal J.
Muhialdin, Zaiton Hassan và Nazamid Saari, 2015).
3. Mục tiêu
Sử dụng Lactobacillus spp. kết hợp nấm men trong lên men bánh mì nhằm kéo
dài thời gian bảo quản bánh mì và cải thiện cảm quan sản phẩm.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus sp.C1.
- Xây dựng đường chuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus
sp.C1, nấm Aspergillus niger để xác định mật độ tế bào, bào tử từng chủng.
- Khảo sát khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn LAB in vitro.

3
- Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men
bánh mì với nấm men.
- Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì.
5. Phương pháp nghiên cứu
a) Phương pháp luận
Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua, cơm mẻ nên bản thân chủng
vi khuẩn đã có tính an toàn thực phẩm. Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của
vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng thực phẩm, người thực hiện đề tài tiếp
tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm. Từ đó ứng
dụng chủng vi khuẩn lactic để ức chế nấm mốc trên thực phẩm và cụ thể là bánh mì.
b) Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.
- Sử dụng phần mềm SAS9.4 để xử lí số liệu.
6. Kết quả đạt được của đề tài
- Khẳng định được hoạt tính sinh học của chủng Lactobacillus spp..
- Xác định được mật độ tế bào của Lactobacillus spp., A.niger.
- Đánh giá tỉ lệ ức chế nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương pháp kháng
nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual Culture Two Line
Culture Method).
- Xác định và kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì.
7. Kết cấu đồ án
- Mở đầu
- Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.

4
- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
- Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà
đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biến chứng cho kết quả thu được.
- Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm tắt lại những kết quả mà đề tài
đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

5
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.1.1 Giới thiệu chung
Lịch sử phát hiện ra vi khuẩn lactic:
- Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hoá học người Thuỵ Điển Scheele đã tách được
acid lactic từ sữa bò lên men chua.
- Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả
hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic.
- Vào năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là
Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic).
- Đến năm 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình
thành.
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng
tạo bào tử. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ nghi, không chứa cytochrom
và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng
phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển. Chính do sự sinh acid lactic, một
acid yếu nên vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm lên men, dùng
để ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây hư hỏng. LAB có thể lên men các loại
đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải bất cứ chủng vi khuẩn
lactic nào cũng có thể lên men đường disaccharide: một số chủng không thể lên men
saccharose, một số lại không thể sử dụng được lactose, các vi khuẩn latic không lên
men được tinh bột (ngoại trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các loại
polysaccharide khác.
Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình
thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác
nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu
được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và
các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại

6
cũng được sử dụng trong phân loại. Theo khóa phân loại của Bergey, họ
Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae.
- Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc.
- Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus.
Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ
khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột. Một số loài trong họ vi khuẩn
lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng
gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình que...Phân
biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng hợp nhiều hợp
chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp
thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic
từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.
Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn
etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn,
một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%). Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển
ở nhiệt độ tương đối thấp (5o
C hoặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng
tối thích là 25 - 35 o
C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 o
C. Khi gia
nhiệt tới 60 – 80 o
C hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nó cần
có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amin. Chúng có yêu cầu đặc biệt về
chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra
tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men
bị dừng lại. Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân huỷ protein của sữa thành các
peptid và acid amin. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao
hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit. Một số loài có khả năng tạo thành
màng nhầy. Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật
gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic,
các loài này còn có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta
gọi các hợp chất này là bacteriocin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y

7
học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn
lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin,
acid bay hơi...) như Streptococcus diacetylactic.
1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus
Tuỳ theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình
cầu và hình que. Kích thước của chúng cũng thay đổi tuỳ theo từng loài.
Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus
Phân loại khoa học:
- Giới: Vi khuẩn
- Ngành: Firmicutes
- Lớp: Bacilli
- Bộ: Lactobacillales
- Họ: Lactobacillacea
- Giống: Lactobacillus
Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L.acidophilus, L.brevis,
L.casei, L.fermentum, L.plantarum, L.bulgaricus,...

8
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase
âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu
bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes. Các loài
Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt
là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục
người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có
chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như:
Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus,
Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic
dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài
Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm.
- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium, có
fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase). Chúng lên men được hexose để
tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 45℃.
- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có
FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình
và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic. 
- Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có
phosphoketolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. 
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò hữu ích
trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột
kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do
nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp Lactose, bệnh về da như:
bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường
hô hấp.

9
1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi
khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình
thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như nguồn
carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúng còn
có nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng.
 Nhu cầu dinh dưỡng carbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các
monosaccharide (glucose, fructose, manose) và các disaccaride (saccharose, lactose,
maltose) cho đến các polysaccaride (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon
này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình
lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,..
 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi
khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì
vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ
có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt,
cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,.. Hiện nay, cao nấm men
là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công
nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
 Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào,
nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không
có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại
vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà
rốt hay dịch tự phân nấm men.
 Nhu cầu các chất hữu cơ khác
 Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ
khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có

10
ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid
oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm
thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng
đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng
các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
 Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các
muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho,
lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo
chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu
trúc tế bào.
 Nhu cầu dinh dưỡng oxy
Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên
bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí (B.J.B
Wood and Holzapfel W.H, 1995). Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong
môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong
điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện
kị khí.
1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn lactic
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát
triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu
suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh
dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình
nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm
sinh khối sau này.

11
 Thành phần môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết
cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất
với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic
có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình
nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển
hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng
làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin),
vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh
dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng
cao hiệu suất lên men.
 Yếu tố môi trường
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất
lớn đối với vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây
ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến
quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men
càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40℃. Một
số có thể sinh trưởng dưới 15℃ và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới
5℃ (B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995).
- Ảnh hưởng của pH
Vi khuẩn lactic nói chung có thể phát triển được trong môi trường acid, khoảng
pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5. Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid
lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó
cũng ức chế sự phát triển của chính nó, do đó cần phải theo dõi suốt quá trình lên
men, dùng bazơ để điều chỉnh pH về thích hợp.

12
- Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men
Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở
những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá
trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men.
1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic
1.1.2.1Quá trình trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc
lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn
lactic làm hai nhóm:
 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình
Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic
tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol,
di-acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:
𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶𝐻3CHOHCOOH + 21,8.104
J .
Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chu
trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho
quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đến
pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase
cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic.
 Lên men lactic dị hình
 Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài các sản phẩm phụ
như acid acetic, ethanol, acid succinic, C𝑂2. Phương trình chung biễu diễn quá trình
lên men:

13
𝐶6𝐻12𝑂6 → 𝐶𝐻3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐶2𝐻5𝑂𝐻 + 𝐶𝑂2
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu
etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó
là sự tích lũy một lượng lớn acid formic. Như vậy, trong quá trình lên men lactic dị
hình có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trình
này phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm
tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là
hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình.
1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính
kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều
trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược
và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản
thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý
nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản
vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp
ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn
liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như
giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn
sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài
ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như
reuretin, acid lactic,...

14
1.1.3. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic
LAB được biết đến bởi khả năng kháng nấm của chúng, điều đó liên quan đến
việc sản xuất 1 loạt các loại hợp chất bao đồm acid, alcohol, CO2, diacetyl, H2O2,
phenyllactic acid, bacteriocin và cycle peptide. Đặc tính nổi bật của hợp chất bề mặt
của LAB là tính ổn định nhiệt của các hợp chất kháng nấm có trong nó. Điều này thúc
đẩy việc sử dụng các hợp chất bề mặt của LAB hoặc các hợp chất chống nấm trong
các thực phẩm được xử lý nhiệt. Các hợp chất bề mặt của LAB hoạt động trong phổ
pH rộng, kéo dài từ 3 đến 9 tùy thuộc vào từng chủng khác nhau. Đây có thể coi là
một yếu tố chính khi LAB được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm khi so
sánh với chất bảo quản hóa học (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid
Saari, 2011). Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi
đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động
kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt
độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và cộng sự, 2001). Nghiên cứu về tiềm năng
kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại
nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.2).;
Lavermicocca và cộng sự, 2000; Niku- Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003;
Sjogren và cộng sự, 2003; Sjogren, 2005). Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được
2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng
nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus
subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus
NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp.. Nấm Aspergillus IARI được
xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)

15
Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998)
Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất
4-hydroxy-phenyllacticacid 3-
phenyllacticacid
Lactobacillusplantar 21B
3 -hydroxydecanoicacid 3 -
hydroxydodecanoicacid 3 -
hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis
– dodecenoicacid
Lactobacillusplantarum MILAB14
cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin
mevalonolactone
Lactobacillusplantarum VTTE-
78076
Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-,
formic- and n- valeric acid.
Lactibacillus sanfranciscensis CB1
1.2 Tổng quan về nấm mốc
Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng
có thành tế bào bằng kitin (chitin). Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi
đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh
sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô
tính hay hữu tính. Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm
lớn (nấm quả thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường.
Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh
trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ
sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình
chuyển hóa và trao đổi vật chất.

16
1.2.1. Đặc điểm
Phân loại khoa học
Ngành: Ascomycota
Lớp: Eurotiomycetes
Bộ: Eurotiales
Họ: Trichocomaceae
Chi: Aspergillus
Tên Khoa Học: Aspergillus niger
Nấm mốc Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh có vách ngăn (cấu tạo đa
bào). Khi mới phát triển sợi nấm màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng không hoàn toàn
đen. Bào tử của chúng là có màu đen tuyền. Từ một sợi đầu tiên chúng phân nhánh
tạo ra 2 - 4 nhánh sợi nhỏ. Nấm mốc Aspergillus có hai hình thức sinh sản: hữu tính
và vô tính.
Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger
1.2.2 Độc tố do nấm tiết ra
Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối
lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc

17
đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người. Hiện nay có khoảng 300 loài độc
tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong
thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Các độc tố
của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin A, stermatocystin,
axit cyclopianxoic. Aspergillus niger chứa nhiều độc tố, một số vô hại. Các độc tố nó
chứa malformin C, và ochratoxin A. A. niger có thể là có lợi mặc dù nó là độc
hại. Thông qua quá trình lên men, nó có thể sản xuất các enzym hữu ích mà có thể
được sử dụng trong việc sản xuất xi-rô ngô, Beano, rượu vang và rượu táo (Rajkumar,
2010).
1.2.3 Tác hại của nấm
Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất của
các chi Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen trên một số
loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, và đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm
phổ biến của thực phẩm. Aspergillus niger là một trong những nguyên nhân phổ biến
nhất của nhiễm trùng tai nấm, mà có thể gây đau, thính lực tạm thời mất mát, và trong
trường hợp nghiêm trọng, thiệt hại cho ống tai và màng tympanic.
1.2.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm
Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm
mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và
Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào thời gian trước, trong và
sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ,... Có 4 tác động gây độc của độc tố vi
nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp
tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với
trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê
liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều công trình

18
thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc biệt là ở gan. Qua thử
nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn
tới sự sao chép ADN và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai.
1.3 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì
1.3.1 Giới thiệu chung
Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, để
lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Bột mì và nấm men là hai nguyên
liệu chính ảnh hưởng nhiều nhất đến quy trình sản xuất và chất lượng sản phẩm.
Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm
 Hệ enzyme trong bột mì:
Enzyme trong bột có đầy đủ các hệ trong hạt mì, tuy nhiên trong sản xuất
cần đặc biệt lưu ý protease và amilase. Protease phân giải protein cấu trúc bậc ba,
do đó gluten bị vụn nát làm giảm chất lượng bột nhào. Protease bột mì có hoạt độ
mạnh ở 45 - 47°C và pH = 4,5 - 5,6. Khi bổ sung chất khử thì hoạt độ của protease
tăng nhưng với chất oxy hoá và muối ăn thi bị kìm hãm. Amylase thuỷ phân tinh
bột giúp cho bột nhào lên men nhanh và tăng chất lượng bánh vì lượng đường

19
trong bột không đủ cho quá trình lên men. Tác dụng tích cực này chỉ đối với
amylase vì nó thuỷ phân tinh bột thành maltose, còn α - amylase thuỷ phân tinh
bột thành dextrin mà dextrin thì liên kết với nước kém làm cho ruột bánh bị ướt,
do đó làm giảm chất lượng bánh.
1.3.2 Quy trình làm bánh mì
 Nguyên liệu:
Bột mì số 11 200 gram
Men 2.5 gram
Đường 30 gram
Sữa tươi không đường 135 ml
Bơ Zelachi 15 gram
Trứng gà 1 2
⁄ trứng
Muối 2 gram
Vani 1 ống

20
 Quy trình làm bánh mì:
Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì
Nguyên liệu
Nhào bột
Chia bột
Vê bột
Lên men ổn định sơ bộ
Tạo hình
Lên men kết thúc
Nướng
Làm nguội
Sản phẩm

21
 Thuyết minh quy trình:
1. Nguyên liệu:
Các thành phần khô gồm bột mì, men, đường, muối được trộn trước để đảm
bảo sự phân bố đều các hạt khô trong bột mì. Cho men khô vào bột trước khi cho sữa
vào sẽ giúp cho khả năng hoạt động của men tốt hơn.
Sau đó trộn bơ, sữa, trứng và vani. Lưu ý: Bơ lúc này đã được làm tan chảy và
sữa đã được gia nhiệt đến 80℃. Sau khi trộn, dùng dụng cụ đậy kín để bột nghỉ 10
phút tạo điều kiện cho độ ẩm có thể phân tán hết khối bột.
2. Nhào bột:
 Mục đích: Phân bố đều các nguyên liệu tạo thành khối bột nhào đồng nhất.
Tạo thành mạng gluten có tính đàn hồi và nhớt dẻo, cố khả năng giữ khí.
 Cách làm: Khoảng 30 – 45 phút, đến khi nào không còn ảm giác bột dính tay
và trở nên trơn mịn, dẻo dai có thể cảm nhận được. Đây là khâu quan trọng nhất
trong việc làm bánh nở bông và mềm. Bột nhào chưa đủ hoặc nhào quá kỹ đều làm
giảm khả năng nở của bột.
3. Lên men ổn định sơ bộ:
 Mục đích: tạo khí CO2 làm nở bột, tạo độ xốp cho bánh. Tạo mùi vị thơm ngon
cho bánh mì. Tăng độ tiêu hóa của bánh mì đối với cơ thể người.
 Cách làm: khối bột nhào sau khi đã đạt mức độ thích hợp được để yên trong
30 phút.
4. Chia bột:
 Mục đích: sau khi lên men, khí CO2 được sinh ra cần được ép hết đi, phân tán
men và nhiệt độ nhiều hơn trong toàn khối bột.
 Cách làm: Tuỳ theo độ lớn nhỏ của bánh mì mà chia khối bội thành từng khối
bột nhỏ hơn có khối lượng bằng nhau. Việc chia bánh nhỏ có khối lượng bằng nhau
sẽ kích thích việc nở tối đa và nở đồng đều cho từng khối bột.

22
5. Vê bột, tạo hình:
 Mục đích: sau khi chia cấu trúc của bột nhào bị phá vỡ, phải qua quá trình vê
để ổn định lại cấu trúc.
 Cách làm: Sau khi chia bột thành những khối đồng đều nhau, từng khối được
vê thành các khối cầu tròn có bề mặt nhẵn mịn để tránh tình trạng bánh bị nứt sau lên
men. Hình dáng cầu cũng là hình dáng giúp cho khối bột nở tốt nhất trong quá trình
lên men.
6. Lên men kết thúc:
 Mục đích: lên men ổn định là bước kỹ thuật quan trọng có ảnh hưởng quyết
định tới chất lượng bánh. Trong quá trình chia và tạo hình thì hầu hết lượng CO2
trong cục bột thoát ra ngoài. Muốn cho bánh nở và có thể tích, hình dáng cần thiết
thì phải để cục bột lên men kết thúc rồi mới đưa vào lò nướng.
 Cách làm: Vệ sinh, đặt vào lò 1 cốc chứa nước để cấp ẩm và bật lò nướng ở
nhiệt độ 150℃ trong vòng 10 phút để làm nóng môi trường ủ, mở cửa lò cho nhiệt
độ giữ ở mức vừa phải không quá nóng để bánh lên men tốt hơn. Cho bánh đã tạo
hình vào ủ trong 35-400
C/40 – 45 phút.
7. Nướng:
 Mục đích: tiêu diệt hệ vi sinh vật và ức chế hệ enzyme trong khối bột nhào.
Làm chín bánh, tạo hương vị, màu sắc cho sản phẩm.
 Cách làm: Nhiệt độ sử dụng là 150 - 170℃ trong vòng 10 – 15 phút. Nhiệt độ
và thời gian nướng phụ thuộc và khối lượng mỗi bánh. Bánh nhỏ thì nhiệt độ buồng
nướng cao, thời gian nướng ngắn. Bánh to thì phải hạ nhiệt độ xuống đồng thời kéo
dài thời gian nướng vì nếu nhiệt độ cao, vỏ bánh sẽ cháy nhưng ruột bánh lại không
kịp chín.
8. Làm nguội:
 Mục đích: chuẩn bị cho quá trình bao gói bánh sau khi nướng.

23
1.3.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì
Trong điều kiện độ ẩm không khí dưới 79% và nhiệt độ dưới 20℃, ẩm độ của
hạt dưới 15% vi sinh vật trong bột sẽ không tăng lên mà dần dần chết đi khi bảo quản
bột trong thời gian dài. Nếu ẩm độ của bột chỉ cần tăng lên 1 – 2% thì vi khuẩn và
nấm mốc trong bột sẽ phát triển mạnh. Để bảo quản bột tốt cần bảo quản bột ở độ ẩm
không khí dưới 79%, ẩm độ của bột không quá 14 – 15% trong điều kiện nhiệt độ ổn
định. Ở điều kiện này, giữ bột được 3 – 5 tháng, ở điều kiện ẩm độ bột từ 12 – 13%
giữ được 1 năm.
1.3.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì
Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, man bánh mì và tạp nhiễm. Khi
làm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tạo ra rượu và khí carbonic làm nở bột
nhào. Khi nắn bánh và đem nướng hầu hết vi sinh vật đều bị tiêu diệt trừ một số bào
tử chịu nhiệt còn tồn tại. Khi nướng bánh nhiệt độ bên ngoài tới 180 – 200℃, các vi
sinh vật ngoài vỏ bánh chết hết và trong ruột bánh nóng dần lên nhưng bào tử của
chúng vẫn còn sống. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các bào tử của trực khuẩn khoai tây
và trực khuẩn cỏ khô phát triển làm hỏng bánh mì. Trong quá trình vận chuyển và
bảo quản còn bị tạp nhiễm các vi sinh vật trong đó có cả trực khuẩn đường ruột rất
nguy hiểm. Vì vậy khi vận chuyển và bảo quản cần đảm bảo vệ sinh an toàn.
1.3.3.2 Hư hỏng bánh do vi sinh vật
Do bánh mì thành phẩm còn một số bào tử của các trực khuẩn không bị tiêu
diệt khi nướng bánh hay các tế bào sinh dưỡng của một số vi sinh vật tạp nhiễm trong
quá trình vận chuyển và bảo quản. Đó chính là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì.
- Bệnh nhớt ruột bánh mì do vi khuẩn Bacillus: bệnh này do trực khuẩn khoai
tây và trực khuẩn cỏ khô gây ra. Khi chúng phát triển sẽ tiết ra enzyme protease
thuỷ phân protein l àm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu và có mùi khó chịu.
Để hạn chế bệnh này cần tăng độ axit của bột nhào, làm pH giảm xuống khoảng
4,5 - 5 sẽ kiềm hãm trực khuẩn Bacillus mesentericus và Bacillus subtilis phát
triển.

24
- Ruột bánh mì bị đỏ: có một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trong
ruột bánh mì và làm ruột bánh mì có màu đỏ. Bệnh này không nguy hiểm đối với
người, thường gặp vi khuẩn Bacillus prodigiosum.
- Mốc bánh mì: bánh mì thường bị mốc bên ngoài do tạp nhiễm các bào tử nấm
mốc và bảo quản trong điều kiện nóng ẩm cũng như ẩm độ của bánh mì cao và
xếp quá chặt.
- Bệnh say bánh mì: bệnh này do nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn trong
bột mì từ những hạt lúa mì ở những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng. Nấm
này chiụ nhiệt cao và không bị chết khi nướng bánh. Khi chúng phát triển trên
bánh mì không thấy dấu hiệu hư rõ rệt nhưng chúng tiết ra độc tố khi ăn phải
người bị ngộ độc thấy ngây ngất như say rượu.
1.3.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì
Chức năng chính của nấm men là sinh khí CO2 làm tăng thể tích khối bột nhào.
Ngoài ra, các sản phẩm của quá trình lên men được tích lũy trong khối bột sẽ tạo nên
các hương vị đặc trưng cho bánh mì thành phẩm. Vì vậy, nấm men có vai trò rất quan
trọng trong lên men bánh mì. Nấm men sử dụng đường có trong bột mì làm cơ chất
chủ yếu để tạo ra sản phẩm là cồn và CO2 theo phương trình:
𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶2𝐻5 + 2𝐶𝑂2
Lượng CO2 tích tụ trong khối bột nhào tạo nên những túi khí, do đó khối
bột trở nên xốp và thể tích tăng lên rõ rệt. Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, CO2 có
trong mạng lưới gluten tăng thể tích làm cho mạng gluten cũng căng lên và trở thành
túi chứa CO2. Nhiệt độ càng tăng, CO2 bắt đầu thoát khỏi mạng gluten sẽ tạo nên
những lỗ xốp trong bột bánh làm cho bánh có độ xốp.
Trong suốt quá trình lên men bột nhào và lên men kết thúc, luôn xảy ra những
phản ứng sinh hóa sinh ra các sản phẩm như: rượu, acid, este, andehyde, ceton,
furfurol... nhằm tích tụ hương thơm và mùi vị đặc trưng cho bánh mì. Đặc biệt khi
nướng bánh, gần 70 chất gây hương vị được tạo thành và có xảy ra phản ứng Maillard
sinh ra melanoidin (là các polymer không no hòa tan được trong nước, sau đó là các

25
polymer không no và không hòa tan trong nước, nhưng đều có màu đậm và gọi chung
là melanoidin). Nấm men cũng giúp chuyển hóa những chất có cấu trúc phức tạp
trong bột mì thành những chất đơn giản giúp cho hệ tiêu hóa của người sử dụng.
1.4 Tổng quan về bột chua
Lên men bột và nước dựa trên một quá trình tức thời để tạo ra bột nhào chua
là một phương pháp quan trọng hiện nay (Vogel và cộng sự, 1999). Khối bột lỏng sẽ
được bổ sung chủng khởi động, sử dụng các công thức và điều kiện lưu giữ để làm
mới men cái theo chu kỳ (Hammes & Ganzle, 1995; Onno & Rouseel, 1994;
Ottogalli, Galli, & Foschino, 1996). Trong các vi khuẩn lên men chính, ngoại trừ nấm
men còn có vi khuẩn sinh acid lactic (LAB). Trong quá trình tạo bột chua truyền
thống, một phần bột được trộn lẫn với men và bổ sung đủ nước để tạo độ xốp, sau đó
để lên men trong vài giờ, thường là để qua đêm và cho tiếp xúc với không khí. Khối
bột xốp sau đó sẽ được trộn chung với phần bột còn lại, ngoài ra còn có nước, muối
và chất béo đến một độ dẻo nhất định và được cho lên men trong một thời gian ngắn
trước khi kiểm tra lại và đem đi nướng. Kết quả, bánh mì có hương vị tuyệt vời hơn
nhờ vi khuẩn lên men xâm nhập từ không khí hoặc do việc bổ sung vào 2-5% phần
sản phẩm lên men của mẻ trước (Bruemmer & Lorenz, 1991). Trong quá trình chuẩn
bị nướng bánh mì, một khối bột nhào xốp nên có mật độ vi khuẩn lactic vào khoảng
108
– 109
cfu/g còn nấm men thì 106
– 107
cfu/g, để có thể làm acid hóa giúp lên men
khối bột và làm nở bột. Tuy nhiên, LAB có thể nhiễm vào bột 1 cách tự nhiên, từ 1
sản phẩm sữa lên men hoặc từ các chủng khởi động thương mại có chứa các dòng
LAB đặc trưng được sản xuất trong quá trình lên men công nghiệp (Vuyst & Neysens,
2005).
1.4.1. Đặc tính của bột chua
Đặc trưng điển hình bột chua (bột bánh mì) chủ yếu là do VSV của nó, về cơ
bản đại diện bởi LAB và nấm men. Do sự có mặt của VSV, bột được chuyển hóa.
Những VSV này đảm bảo sản xuất acid khi đun sôi hỗn hợp bột và nước. Cơ chế

26
chua rất phức tạp (Hammes và Gänzle, 1998). Trong quá trình lên men, các thay đổi
sinh hóa xảy ra trong các thành phần carbohydrate và protein của bột nhờ hoạt động
của vi khuẩn và các enzyme (Spicher, 1983). Nhiều tính chất vốn có của bột chua dựa
vào các hoạt động trao đổi chất của LAB: lên men lactic, thủy phân protein, và tổng
hợp các hợp chất dễ bay hơi, chất chống mốc là một trong những hoạt động quan
trọng nhất trong quá trình lên men chua (Hammes và Gänzle, 1998; Gobbetti và cộng
sự, 1999). Sự lên men bột, cụ thể là bột chua, bị chi phối bởi LAB đặc biệt với nồng
độ thích hợp 108
cfu/g, có thể cùng tồn tại hoặc có thể cộng sinh với các loại nấm
men thông thường có nồng độ thấp hơn (Gobbetti và cộng sự, 1999; Vogel và cộng
sự, 2002). Nấm men thường kết hợp với LAB trong bột chua với tỷ lệ nấm men/LAB
thường là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996).
1.4.2. Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua
Quá trình lên men bột chua là yếu tố quan trọng trong việc tạo ra mùi vị cho
bánh mì (Lund và cộng sự, 1989; Rothe & Ruttloff, 1983). Các hoạt động trao đổi
chất kết hợp của các vi sinh vật, tạo ra sự acid hóa hoặc tạo chua có ảnh hưởng đến
đặc tính của bánh mì, đặc biệt là kết cấu, tăng thời hạn sử dụng bằng cách giảm sự
tăng trưởng của mốc trong quá trình bảo quản (Corsetti và cộng sự, 2000; Oura,
Soumalainen & Wiskari, 1982; Rochenck và Voysey, 1995) và tạo ra các thành phần
hương vị điển hình mang lại đặc điểm cảm quan chua đặc trưng (Gobbetti, 1998;
Katina và cộng sự, 2005). Trong quá trình lên men có hai loại hợp chất hương vị được
sản xuất. Hợp chất không bay hơi bao gồm acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn
đồng hình (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995a) và dị hình (Gobbetti, Corsetti,
& De Vincenzi, 1995b) làm acid hóa, giảm độ pH và đóng góp hương vị cho bột bánh
mì (Barber, Benedito de Barber, Martinez-Anaya, Martinez, và Alberola, 1985;
Galal, Johnson, và Varriano-Marston, 1978). Loại thứ hai các hợp chất dễ bay hơi
của bánh mì từ bột chua chứa rượu, aldehyde, ketones, este và lưu huỳnh. Tất cả các

27
hợp chất này được sản xuất bằng phương pháp sinh học và các hoạt động sinh hóa
trong quá trình lên men và đóng góp vào hương vị (Spicher, 1983).
 Hợp chất không bay hơi
Phản ứng giữa vi khuẩn lactic với các enzyme ngoại bào ảnh hưởng đến hoạt
tính của vi sinh vật trong quá trình acid hóa, sản sinh acid acetic và các đặc tính kết
cấu bánh mì. Nó thể hiện sự tăng cường các hoạt động enzyme nội sinh trong bột đã
thu được khi kết hợp LAB với glucose oxidase VSV, lipase, endo xylanase, amylase
và protease.
 Hợp chất bay hơi
Sự chuyển hóa ở vi khuẩn chứng minh việc sản xuất các hợp chất dễ bay hơi
khác nhau cho sự lên men của nhóm vi khuẩn lactic. Các sản phẩm được tạo ra của
quá trình lên men là 2-metyl-1-propanol; 2,3 methyl-1-butanol và các iso-alkoho
khác. Các dòng LAB có sự khác biệt trong sự trao đổi chất và các hợp chất thơm. Sản
xuất các hợp chất thơm dễ bay hơi trong quá trình lên men với sự kết hợp của các
chủng đơn lẻ S. cerevisiae và C. guilliermondii, Lb. Plantarum đã được thử nghiệm,
được sử dụng trong cả bột lúa mì và các chất nền đơn giản như maltose và glucose
(Stolz và cộng sự, 1993). Chỉ sử dụng men trong bánh mì, bảy chất dễ bay hơi đã
được tìm thấy nhiều: acetaldehyde, aceton, ethyl acetat, ethanol, hexanal, rượu
isobutyl, và propanol.
1.4.3. Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với
hương vị của bánh mì
Các phản ứng Maillard và Caramel hóa ảnh hưởng chính đối với sự hình thành
hương vị trong các sản phẩm từ hạt khi có sự đun nóng thì phản ứng liên quan đến
các tiền chất đơn giản như acid amin và aldose đơn giản hoặc ketose đường (Rothe
& Ruttloff, 1983). Số lượng acid amin tự do cao nhất đã được tạo ra trong quá trình
lên men bột chua với sự kết hợp giữa LAB và S. exigus M14 (Gobbetti, Corsetti và

28
cộng sự, 1994; Gobbetti, Simonetti và cộng sự, 1994; Kratochivil & Holas, 1983,
Rothe, 1974). Các acid amin này là đơn chất của iso-alcohols (Gobbetti, Corsetti, &
De Vincenzi, 1995b; Hansen & Schieberle, 2005) góp phần trực tiếp cho hương vị
bánh mì trong quá trình lên men và nướng bánh mì (Bredie, Mottram & Guy, 2002;
Damiani và cộng sự, 1996). Các sản phẩm phản ứng Maillard từ quá trình xử lý nhiệt
độ cao bao gồm pyrazines, pyrrole, furan và các hợp chất chứa sunfur và các sản
phẩm khác như alkanals, alkenals 2 và 2,4-alkadienal (Parker, Hassell, Mottram, &
Guy, 2000). Hơn nữa, ở nhiệt độ cao hơn thì pyrrole, thiophenes, thiophenones,
thiapyrans và thiazolines tăng lên và furan và aldehyde giảm (Bredie và cộng sự,
2002). Pyrazin là các hợp chất có chứa nitơ có đặc tính mùi và hương vị rất mạnh (Ji
và Berhard, 1992). Do đó, việc sản xuất các hợp chất này có ảnh hưởng đáng kể đến
hương vị của bánh mì.
1.4.4. Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua
Các carbohydrate có trong bột mì gồm maltose tiếp theo sucrose, glucose,
fructose và, cùng với một số trisaccharides như maltotriose và raffinose. Lượng
glucose tăng quá trình lên men, trong khi giảm sucrose trong sự hiện diện của nấm
men do tác động của VSV. Các nấm men có mặt trong bột chua không thể lên men
maltose, một loại đường phổ biến trong bột. Tuy nhiên, tế bào nấm men vẫn có thể
phát triển vì glucose cung cấp vào môi trường bởi một số loài LAB, đáng chú ý
L. sanfranciscensis. Bắt đầu từ glucose, LAB lên men đồng hình sản xuất acid lactic
qua đường phân (lên men đồng hình), trong khi LAB lên men dị hình cũng sản xuất,
ngoài acid lactic, CO2, acid aCetic, và/hoặc ethanol thông qua con đường 6-
phosphogluconate/phosphoketolase(6-PG/PK) (lên men dị hình). Hexoses khác với
glucose đi vào những con đường chính ở mức glucose-6-phosphate hoặc fructose-6-
phosphate sau khi đồng phân hóa và/hoặc phosphoryl (Axelsson,
1999). Disaccharides được chia bởi hydrolases và/hoặc phosphohydrolases cụ thể đối
với monosacarit rằng sau đó nhập vào con đường chính. Pentoses là phosphoryl hóa
và chuyển đổi sang ribulose-5-phosphate hoặc xylulose-5-phosphate bởi epimerases

29
hoặc isomerase và sau đó chuyển hóa phần sau của con đường 6-PG/PK (Axelsson,
1999). Sử dụng pentoses không chỉ giới hạn đối với các loài LAB có chứa
phosphoketolase cấu thành, các enzyme quan trọng của con đường 6-PG/PK (lên men
dị hình bắt buộc); LAB lên men dị hình tùy nghi, tạo ra hexose lên men thông qua
glycolysis vì chúng có chứa một aldolase fructose-1,6-diphosphate cấu thành
(enzyme chính của glycolysis), pentoses lên men giống như loài lên men dị hình bắt
buộc. Trong những trường hợp như vậy, phosphoketolase của LAB lên men dị hình
tùy nghi được gây ra bởi các đường pentose sẵn có (Hammes và Vogel, 1995). Quá
trình lên men của pentoses tạo ra một lượng cân bằng của acid lactic và acid
axetic; không có CO2 được hình thành, và vì không có bước khử là cần thiết để đạt
được các trung gian xylulose-5-phosphate, acetyl phosphate được sử dụng bởi kinase
acetate trong một bước phosphoryl mức bề mặt năng suất acetate và adenosine
triphosphate. Buộc LAB lên men đồng hình không lên men pentoses (Axelsson,
1999). Cho đến nay, một số nghiên cứu đã được nhắm vào các trình tự của bộ gen
hoàn chỉnh của lactobacilli, bao gồm L. brevis (Makarova và cộng sự, 2006), L.
plantarum (Kleerebezem và cộng sự, 2004), và Lb . reuteri cũng được tìm thấy trong
bột chua, hoàn chỉnh.

30
Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid
lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008)
Các con đường trao đổi chất của LAB ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì được
kết hợp với nguồn cacbon trung tâm sẵn có của các đồng yếu tố ảnh hưởng đến thế
oxi hóa khử tế bào và môi trường. Chuyển hóa đồng hình và dị hình khác nhau về
yêu cầu tái tạo đồng phân giảm, giảm nicotinamide adenine dinucleotide hoặc
nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. Việc sử dụng các chất đồng nhất, như
oxy hoặc fructose, như chất nhận electron bởi LAB lên men dị hình bắt buộc phải kết
hợp với việc gia tăng sản xuất acetat trong bột nhão. Dựa trên các yêu cầu trao đổi
chất khác nhau cho sự tái tạo cofactor, LAB lên men đồng hình và dị hình có ảnh
hưởng đến các phản ứng oxi hóa khử trong bột chua có ảnh hưởng đến chất lượng
bánh mì ngoài sự hình thành của acetate.

31
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh và phòng thí nghiệm
thực phẩm khoa Công Nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại Học
Công Nghệ TP.HCM.
2.2. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ 24/04/2017 đến 16/07/2017.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Giống vi sinh vật
Giống vi khuẩn lên men Lactobacillus sp.L5, Lactobacillus sp.C1, nấm mốc
Aspergillus niger do phòng thí nghiệm vi sinh, nấm men Saccharomyces cerevisiae
của Saf-Instant.
2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng
2.3.2.1. Hoá chất
- Các hoá chất dùng để pha môi trường MRS, môi trường PDA.
- Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal violet),
Fushin, Malachite green.
- Chất bảo quản Natri benzoate và Canxi propionate.
2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường MRS – broth, MRS cải tiến, MRS agar.
- Môi trường PDA, PDB.

32
2.4. Thiết bị và dụng cụ
2.4.1. Thiết bị
- Tủ cấy vi sinh (Brlad France)
- Tủ ủ (Memmert Germany)
- Tủ lạnh Toshiba
- Tủ sấy (Memmert Germany)
- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
- Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 henesis (USA)
- Autoclave (Memmert Germany)
- Bếp từ (Billy – England)
- Máy nước cất (Branstead USA)
- Bể điều nhiệt
2.4.2. Dụng cụ
- Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ
tinh.
- Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, pipetman 100 – 1000μl
- Que cấy, que trang, cây đục thạch, đèn cồn, eppendorf 1ml, ống ly tâm lớn.
- Bông thấm nước, bông không thấn nước, giấy lọc, lam, lamell, buồng đếm
hồng cầu, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa.
2.5. Phương pháp luận
 Mục tiêu: Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger khi đồng lên men
bánh mì của vi khuẩn Lactobacullus spp. với nấm men.
 Nội dung:
 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1.
 Xây dựng đường chuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và
Lactobacullus sp.C1, nấm Aspergillus niger để xác định mật độ tế bào, bào tử.

33
 Khảo sát khả năng đối kháng Aspergillus niger của vi khuẩn LAB.
 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng
lên men bánh mì với nấm men.
 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì.
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đề tài
- Hình thái khuẩn lạc, tế bào
và đặc điểm sinh lý, sinh hóa.
- Khả năng sinh acid.
- Khả năng đối kháng
Aspergillus niger in vitro.
Khảo sát vi khuẩn
Lactobacillus sp. L5
C1
Xây dựng đường chuẩn
tế bào LAB
Xây dựng đường chuẩn
bào tử Aspergillus niger
Khảo sát khả năng kháng nấm
A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng
lên men bánh mì với nấm men
Khảo sát ảnh hưởng của LAB
lên chất lượng bánh mì
Mật độ nấm
105
(bt/ml)
Mật độ nấm
104
(bt/ml)
Mật độ LAB
- 1010
(cfu/ml)
- 109
(cfu/ml)
- 108
(cfu/ml)
- Đánh giá cảm quan
- Độ nở bánh mì.
- Độ ẩm bánh mì.

34
2.6.2. Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp.
2.6.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa
 Quy trình thí nghiệm:
Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus spp.
Mục đích: Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi
sinh vật khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí
nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng.
Ủ 24-48h
Chủng vi
khuẩn LAB
Tăng sinh trong môi
trường MRS-broth
Cấy truyền sang môi
trường MRS agar
Quan sát hình thái
khuẩn lạc
Khảo sát đặc điểm
sinh lý, sinh hóa
- Nhuộm Gram
- Nhuộm bào tử
- Catalase
Cấy giữ
giống
Khẳng định chủng
LAB thuần khiết

35
Tiến hành:
 Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc:
Chủng vi khuẩn lactic L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường
MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút và ủ ờ 37℃ trong 24 giờ.
Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển sang môi trường MRS agar để ủ ở 37℃
trong 48 giờ, sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc lactic.
Tiếp theo, tiến hành khảo sát lại các đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn
lactic bao gồm các phương pháp: nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase.
 Môi trường giữ giống:
Sau khi đã khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng,
tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường MRS agar trong ống thạch nghiêng,
ủ ở 37℃ trong 24 đến 48 giờ và bảo quản trong tủ lạnh phòng thí nghiệm.
 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá
 Nhuộm Gram
- Tiến hành:
Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến
 Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau
khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không
khí.
 Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
 Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
 Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
 Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô.
 Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô
trong không khí.
 Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
- Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.

36
 Nhuộm bào tử
- Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton
 Nuôi cấy vi khuẩn ở 37o
C, 5 – 7 ngày.
 Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram.
 Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước.
 Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
 Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
- Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ.
Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục.
 Thử nghiệm catalase
- Tiến hành:
 Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính.
 Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào
giọt H2O2 trên phiến kính.
- Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.
Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết
quả tương tự.

37
2.6.2.2 Khả năng sinh acid
Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus spp.
- Mục đích: Xác định khả năng sinh acid của chủng Lactobacillus spp..
- Tiến hành:
+ Chủng vi khuẩn lactic L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi
trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút và ủ ờ 37℃
trong 24 giờ.
+ Hút 10ml dịch tăng sinh vào ống Falcon (lặp lại 3 lần). Ly tâm 4000 vòng/15
phút, phần dịch sau ly tâm cho vào erlen.
Ủ 370
C 24h
Chủng vi
khuẩn LAB
Ly tâm
Dịch sau ly tâm
Khả năng
sinh acid
Sinh
khối
Chuẩn độ
NaOH
0.1N
Phenolphthalein

38
+ Bổ sung 3 giọt phenolphthalein, chuẩn độ bằng NaOH 0.1N đến khi dung
dịch có màu hồng nhạt và pH = 8 – 8.3
- Kết quả:
%𝑇𝐴 =
𝑠ố 𝑚𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻 × 0.1𝑁 × 90 × 100
𝑡ℎể 𝑡í𝑐ℎ 𝑚ẫ𝑢
1000
Trong đó
%TA: độ acid
Số ml NaOH: thể tích NaOH 0.1N đã sử dụng đổ chuẩn độ.
Thể tích mẫu (ml): dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus spp..
Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4
2.6.2.4 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro
 Quy trình thực hiện:

39
Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với
nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn.
- Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của chủng vi khuẩn
theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn.
Lặp lại
3 lần
Đặt thạch nấm Đặt thạch nấm
Hoạt hóa chủng vi khuẩn
LAB trên môi trường
MRS-broth
Tăng sinh chủng vi khuẩn
LAB trên môi trường
MRS-broth
Tăng sinh A.Niger
trên môi trường PDB
Cấy vào đĩa petri
chứa môi trường PDA
Đo đường kính ức chế nấm
Tỷ lệ ức chế
nấm bệnh
Ủ 72h ở nhiệt độ phòng
Hoạt hóa A.Niger trên
môi trường PDB
ĐC âm
(Không
ria vi
khuẩn)
Ria 2
đường
LAB

40
- Tiến hành:
 Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:
Hoạt hóa 2 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi
trường MRS broth ở 370
C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi
trường MRS broth ở 370
C trong 24h.
 Chuẩn bị chủng nấm để đối kháng:
 Hoạt hóa chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong
môi trường PDB ở 370
C trong. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi
trường PDB ở 370
C trong 24h.
 Cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ 72h ở nhiệt độ
phòng.
 Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng:
 Môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 1210
C trong 30 phút.
Sau đó, phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa 15ml.
 Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục thạch ở đĩa nấm mốc đặt vào tâm
các đĩa. Mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng.
 Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép đĩa 1,5cm (2
vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường
kính) cần thử đối kháng vào. Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm đĩa, không
cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng.
 Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3
ngày.

41
 Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm:
Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường
vi khuẩn
Trong đó:
Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng
Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm
Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4
2.6.3. Xây dựng đường chuẩn
2.6.3.1. Lactobacillus spp.
Đường chuẩn = vẽ đồ thị tương quan giữa OD600nm và log(tb/ml).
Dđc Dtn
1.5
cm
1.5
cm
Đường cấy
vi khuẩn

42
Hình 2.7: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn chủng Lactobacillus spp.
- Mục đích: Xác định mật độ vi khuẩn lactic bổ sung vào bánh mì.
- Tiến hành: Chủng Lactobacillus spp. được tăng sinh trong môi trường MRS-
broth ở 37℃ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, ta tiến hành đo 𝑂𝐷600𝑛𝑚 và cấy trang ở
cùng thời điểm.
 Đo 𝑶𝑫𝟔𝟎𝟎𝒏𝒎: Ta thực hiện pha loãng theo hệ số 2𝑛
bằng cách:
+ Hút 5ml môi trường MRS broth đã được khử trùng ở 121℃ trong 30 phút vào
10 ống nghiệm, trong đó gồm 9 ống dùng để pha loãng và 1 ống làm mẫu trắng.
+ Đối với 9 ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng):
Hút 5ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng
2 lần. Sau đó từ ống thứ nhất hút 5ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch
pha loãng 4 lần.
Ủ 370
C 24h Ủ 370
C 24h
LAB
Đo OD600nm Cấy trang
Đường
chuẩn
Đếm khuẩn lạc

43
+ Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo
hệ số 2𝑛
: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, …
+ Đo 𝑂𝐷600𝑛𝑚 9 ống chứa dịch đã pha loãng.
 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:
- Pha loãng mẫu:
 Chuẩn bị 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý đã được
hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút. Đánh số thứ tự từ 1 đến 9 tương ứng với
9 mật độ pha loãng từ 10−1
đế𝑛 10−9
.
 Hút 1ml dịch tăng sinh vào ống thứ nhất, lắc đều. Sau đó, hút 1ml từ
ống thứ nhất sang ống thứ 2, tương tự thao tác cho đến hết 9 ống.
- Cấy trang:
 Hút 0.1ml dịch pha loãng ở ống 10−5
vào đĩa petri chứa môi trường
MRS agar. Chọn nồng độ từ 10−5
đế𝑛 10−9
để cấy trang, mỗi nồng độ lặp lại
trên 3 đĩa.
 Sau khi trang khô, ta ủ ở nhiệt độ 37℃ trong 24 – 48 giờ cho khuẩn lạc
có thể phát triển thuận lợi để đếm.
 Sau khi đếm khuẩn lạc, ta định lượng vi sinh vật bằng công thức
𝑁 =
ΣC
(𝑛1 + 0.1𝑛2)𝑑
Trong đó:
N – số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu.
C – số khuẩn lạc đếm được trên các đãi petri đã chọn (chọn các đĩa có số khuẩn
lạc dao động từ 25 – 250 khuẩn lạc).
𝑛1, 𝑛2 – số đĩa petri ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp đã chọn.
d – hệ số pha loãng mẫu.

44
2.6.3.2. Nấm mốc Aspergillus niger
Đường chuẩn = vẽ đồ thị tương quan giữa OD620nm và log(tb/ml).
 Quy trình thực hiện:
Hình 2.8: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn nấm mốc A.niger
- Mục đích: Xác định mật độ tế bào nấm mốc để cảm nhiễm bánh mì.
- Tiến hành:
 Chuẩn bị mẫu:
Giống được cấy truyền sang môi trường PDA agar và được ủ ở nhiệt độ phòng
trong vòng 3 đến 4 ngày để nấm có thể mọc kín đĩa môi trường. Sau khi ta thu được
đĩa nấm nuôi cấy, hút 5ml nước muối sinh lý 0.9% có bổ sung Tween 80 vô trùng
vào đĩa nấm, dùng muỗng inox đã được hấp khử trùng cạo bề mặt đĩa nấm sau đó đổ
Ủ 370
C 72h
Aspergillus niger
trường PDA
Cạo bào tử trên đĩa
petri
Định mức 100ml
Đo OD620nm
Buồng đếm hồng
cầu
Đường
chuẩn

45
vào bình định mức 100ml. Lặp lại thao tác cạo khoảng 5 lần đến khi bề mặt đĩa nấm
được cạo sạch. Cuối cùng định mức dịch nấm bằng nước muối sinh lý có Tween đến
100ml, ta được mẫu dung dịch nấm cần.
 Đo 𝑶𝑫𝟔𝟐𝟎𝒏𝒎: Ta thực hiện pha loãng theo hệ số 2𝑛
bằng cách:
+ Hút 5ml môi trường MRS broth đã được khử trùng ở 121℃ trong 30 phút vào
10 ống nghiệm, trong đó gồm 9 ống dùng để pha loãng và 1 ống làm mẫu trắng.
+ Đối với 9 ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng):
Hút 5ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng
2 lần. Sau đó từ ống thứ nhất hút 5ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch
pha loãng 4 lần.
+ Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo
hệ số 2𝑛
: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, …
+ Đo 𝑂𝐷620𝑛𝑚 9 ống chứa dịch đã pha loãng.
 Định lượng:
 Hút 1ml mẫu + 4ml dung dịch nước muối sinh lý có pha Tween 80, ta thu được
dịch pha loãng 5 lần. Dùng ống nhỏ giọt hút 1 giọt dung dịch pha loãng lên buồng
đếm và đậy lamer, tiến hành soi và đếm ở vật kính x40. Đếm số tế bào ở những ô
màu trắng (Hình 2.9).
Hình 2.9: Vùng đếm hồng cầu

46
 Sau đó, số liệu sau khi đếm được tính toán theo công thức:
𝐵𝑇𝐵1 =
𝐵1 + 𝐵2 + 𝐵3 + 𝐵4
4
Với: 𝐵1, 𝐵2, 𝐵3, 𝐵4 lần lượt là số tế bào đếm được của 4 ô ở 4 góc buồng đếm
𝐵𝑇𝐵1 là số tế bào trung bình của buồng đếm ở lần 1.
 Lặp lại thao tác đếm 3 lần, ta được:
𝐵𝑇𝐵 =
𝐵𝑇𝐵1 + 𝐵𝑇𝐵2 + 𝐵𝑇𝐵3
3
 Khi đó:
𝑆ố 𝑇𝐵 (𝑇𝐵/𝑚𝑙) =
𝐵𝑇𝐵 𝑥 1000
1𝑚𝑚2 𝑥 0.1𝑚𝑚
𝑥 𝐹
Với: 𝐵𝑇𝐵 – số tế bào trung bình ở cả 3 lần đếm
1𝑚𝑚2
𝑥 0.1 𝑚 – thể tích 1 ô (trong 4 ô) của buồng đếm
F – hệ số pha loãng

47
2.6.4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh
mì của vi khuẩn LAB với nấm men
 Quy trình thí nghiệm
`
Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.
Ủ 370
C 72h
TH3: không cảm nhiễm
TH1: 104
TH2: 105
Sau 24 giờ
Bỏ
dịch
Lactobacillus spp.
TS trong môi trường
MRS – Broth
Ủ + lắc
Ly tâm
Rửa nước cất
Ly tâm
x2
Sinh khối
Theo dõi ngày đầu tiên xuất hiện tơ nấm sau nướng
Đo OD600nm
Pha loãng đến các mật độ
1010
, 109
, 108
(cfu/ml)
Aspergillus niger
trường PDA
Cạo bào tử trên đĩa petri
Định mức 100ml
Đo OD620nm
Pha loãng đến các mật độ
105
, 104
(tb/ml)
Bánh mì

48
Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì.
Mật độ nấm
(tb/ml)
Chất bổ sung
TH1: Cảm
nhiễm A.niger
mật độ 104
TH2: Cảm
nhiễm A.niger
mật độ 105
TH3:
không cảm nhiễm
L5 mật độ 1010
(cfu/ml) BML5-10/4 BML5-10/5 BML5-10
L5 mật độ 109
(cfu/ml) BML5-9/4 BML5-9/5 BML5-9
L5 mật độ 108
(cfu/ml) BML5-8/4 BML5-8/5 BML5-8
C1 mật độ 1010
(cfu/ml) BMC1-10/4 BMC1-10/5 BMC1-10
C1 mật độ 109
(cfu/ml) BMC1-9/4 BMC1-9/5 BMC1-9
C1 mật độ 108
(cfu/ml) BMC1-8/4 BMC1-8/5 BMC1-8
Natri benzoate BMNa/4 BMNa/5 BMNa
Canxi propionate BMCa/4 BMCa/5 BMCa
Không bổ sung BMTL/4 BMTL/5 BMTL
 Mục đích: Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. trên
bánh mì.
 Tiến hành:
 Chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 cấy truyền 5% sang
môi trường MRS để tăng sinh với 200ml, sau đó được đem đi ủ và lắc đồng
thời ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 tiếng.
 Sau đó đo OD600nm, pha loãng huyền phù gốc bằng nước muối sinh lý
0.9% vô trùng để đạt được các mật độ 1010
, 109
, 108
(cfu/ml) với lượng dịch
là 67.5ml.
 Lấy 67.5ml dịch pha loãng, ly tâm 4000 vòng trong 15 phút trong ống
Falcon, sau đó bỏ dịch.

Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

Empfohlen

Empfohlen

Weitere ähnliche Inhalte

Was ist angesagt?

Was ist angesagt? (20)

Ähnlich wie Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

Ähnlich wie Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì (20)

Mehr von TÀI LIỆU NGÀNH MAY

Mehr von TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Kürzlich hochgeladen

Kürzlich hochgeladen (20)

Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì