Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỪ THỰC PHẨM LÊN
MEN TRUYỀN THỐNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM
MỐC SINH AFLATOXIN Aspergillus spp.
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện : LƯU ĐẠI KIM PHƯỢNG
MSSV: 1211100167 Lớp: 12DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2016

Đồ án tốt nghiệp
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Sinh viên thực hiện luận văn
Lƣu Đại Kim Phƣợng

ii
LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn đến bố mẹ. Cám ơn bố mẹ đã không quản khó
khăn nuôi dưỡng con từng ngày, dạy cho con những điều hay lẽ phải. Bố mẹ luôn là
chỗ dựa vững chắc nhất của con, là nguồn động viên to lớn cho con mỗi khi con vấp
ngã và cũng là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong công việc cũng như trong cuộc
sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn toàn thể quý Thầy Cô bộ
môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, cùng
toàn thể quý Thầy Cô trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giảng dạy và
truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
nhất cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương – Trường bộ môn
Công Nghệ Sinh Học, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường Trường
Đại học Công Nghệ TP.HCM, người cô đáng kính, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ,
cung cấp thông tin cũng kiến thức thật hữu ích cho em trong suốt quá trình thực hiện
đồ án.
Em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô phụ trách phòng thí nghiệm Trường Đại học
Công Nghệ TP.HCM đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn tất phần thực nghiệm
của đồ án.
Xin chân thành cảm ơn các bạn học cùng lớp 12DSH đã gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ
và đóng góp ý kiến cho em trong suốt bốn năm đại học.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã
dành thời gian đọc, nhận xét đồ án tốt nghiệp này.
TP.HCM, tháng 8 năm 2016.
SVTH: Lƣu Đại Kim Phƣợng

iii
MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG................................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH...................................x
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.........................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................2
2.1. Ngoài nước .........................................................................................................2
2.2. Trong nước .........................................................................................................3
3. Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................3
4. Mục đích nghiên cứu ..............................................................................................3
5. Nhiệm vụ nghiên cứu..............................................................................................3
6. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................4
6.1. Phương pháp luận ..............................................................................................4
6.2. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................4
7. Kết quả đạt đƣợc của đề tài...................................................................................4
8. Kết cấu đồ án...........................................................................................................5
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..........................................................................................6
1.1. Tổng quan về nấm ...............................................................................................6
1.1.1. Giới thiệu chung..............................................................................................6
1.1.2. Độc tố nấm ......................................................................................................6
1.1.3. Tác hại của nấm ..............................................................................................7
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật ...................................................7
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật ......................................................................8
1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm............................................................8
1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic..............................................................................9
1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic ................................................................................9

iv
1.2.1.1. Giới thiệu chung............................................................................................................9
1.2.1.2. Khái niệm..................................................................................................................... 10
1.2.1.3. Đặc tính chung ........................................................................................................... 12
1.2.1.4. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu.............................................. 14
1.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa ..........................................................................24
1.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic............................................................. 24
1.2.2.2. Qúa trình trao đổi chất............................................................................................. 26
1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn lactic ................................................................................................ 31
1.2.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập...................32
1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R. Fennema et al.
2004)............................................................................................................................................. 32
1.2.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R. Fennema et al. 2004)............... 33
1.2.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại............................................ 37
1.2.4. Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic.............................38
1.2.4.1. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic ....................................................... 38
1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic................................................................................. 40
1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic ..........................................40
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................46
2.1. Địa điểm nghiên cứu..........................................................................................46
2.2. Thời gian thực hiện............................................................................................46
2.3. Vật liệu................................................................................................................46
2.3.1. Thiết bị và dụng cụ........................................................................................46
2.3.2. Hóa chất ........................................................................................................46
2.3.3. Giống nấm .....................................................................................................50
2.4. Phƣơng pháp luận..............................................................................................50
2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm...................................................................................53

v
2.5.1. Thu thập mẫu.................................................................................................53
2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic .........................................................53
2.5.2.1. Tăng sinh...................................................................................................................... 53
2.5.2.2. Phân lập ....................................................................................................................... 53
2.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic.......................................55
2.5.3.1. Nhuộm Gram............................................................................................................... 55
Kết quả:........................................................................................................................................ 55
2.5.3.2. Nhuộm bào tử.............................................................................................................. 55
2.5.3.3. Thử nghiệm Catalase................................................................................................ 56
2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid............................................................................. 56
2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động................................................................................ 57
2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí.......................... 57
2.6. Xác định hàm lƣợng acid tổng..........................................................................58
2.7. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp đặt
thạch khuếch tán của chủng Lactobacillus sp. với nấm bệnh...............................59
2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt.63
2.8.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: ......................................63
2.8.2. Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm......................................................................65
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN................................................................66
3.1. Kết quả phân lập................................................................................................66
3.2. Định danh các chủng phân lập .........................................................................68
3.2.1. Thử nghiệm Catalase.....................................................................................68
3.2.2. Nhuộm Gram .................................................................................................69
3.2.3. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm.....................76
3.2.4. Nhuộm bào tử ................................................................................................77
3.2.5. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí...........79
3.3. Xác định Hàm lƣợng acid tổng.........................................................................83

vi
3.4. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phƣơng
pháp khuếch tán........................................................................................................86
3.5. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn phân lập đƣợc trong bảo
quản hạt .....................................................................................................................92
3.5.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng ..................................................92
3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng của sản phẩm: ...................................................97
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................102
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................104

vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
FDA Fructose-bisphosphate aldolase
ATP Adenosin triphosphat
LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales
DNA Deoxyribonucleic acid
rRNA ribosomal Ribonucleic acid
MRS de Man, Rogosa and Sharpe
PDA Potato Detrose Agar
DMSO Dimethyl sulfoxide
Bacillus sb. Bacillus subtilis
E. coli Escherichia coli

viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại khoa học giống Lactobacillus...................................................... 14
Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986)................ 17
Bảng 1.3: Phân loại khoa học giống Streptococcus...................................................... 19
Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc........................................................ 22
Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus........................................................ 23
Bảng 1.6. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998) ........................................................................................... 42
Bảng 1.7. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm
mốc và nấm men ........................................................................................................... 43
Bảng 1.8. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh.
(Holzapfel và cộng sự, 1995)........................................................................................ 44
Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập.......................................................................... 53
Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập .................................................. 68
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x4 và hình thái vi khuẩn dưới kính
hiển vi x100................................................................................................................... 73
Bảng 3.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn ............................ 81
Bảng 3.4: %Acid lactic của 17 chủng vi khuẩn phân lập được................................... 83
Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập
từ Nem chua .................................................................................................................. 84
Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập
từ Cơm mẻ..................................................................................................................... 85
Bảng 3.7: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic.......................................................... 85
Bảng 3.8: Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .................................... 89
Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Nem
chua ............................................................................................................................... 90

ix
Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Cơm
mẻ.................................................................................................................................. 91
Bảng 3.11: Kí hiệu các thành phần của thí nghiệm...................................................... 92
Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm của Nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy và
Nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng trên đậu phộng... 93
Bảng 3.13: Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform............... 97

x
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004) ..... 12
Hình 1.2: Lactobacillus (L. acidophilus)...................................................................... 15
Hình 1.3: Lactobacillus salivarius ............................................................................... 15
Hình 1.4: Streptococcus ............................................................................................... 19
Hình 1.5: Leuconostoc.................................................................................................. 22
Hình 1.6: Pediococcus.................................................................................................. 24
Hình 1.7: Con đường lên men Glucose........................................................................ 30
Hình 2.1: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic................................ 54
Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu..................................................................................... 54
Hình 2.3 : Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
được với nấm bệnh theo phương pháp đục thạch khuếch tán....................................... 60
Hình 2.4: Hình mô tả phương pháp đặt thạch.............................................................. 62
Hình 2.5: Cách đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh theo
phương pháp đặt thạch khuếch tán................................................................................ 63
Hình 3.1: Hình thái của vi khuẩn lactic........................................................................ 67
Hình 3.2: Các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 ..................................................... 67
Hình 3.3: Chủng Bacillus sb. Có Catalase dương tính (Trái). Chủng phân lập có
Catalase âm tính (Phải) ................................................................................................. 69
Hình 3.4: Mẫu đối chứng với nước cất (Trái). Chủng phân lập có Catalase âm tính
(Phải)............................................................................................................................. 69
Hình 3.5: Vi khuẩn Bacillus sb. Gram dương bắt màu tím.......................................... 70
Hình 3.6: Vi khuẩn E.Coli Gram âm bắt màu hồng..................................................... 70
Hình 3.7: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn.............................................................. 77
Hình 3.8: Vi khuẩn Bacillus sb. sinh bào tử................................................................. 78
Hình 3.9: Vi khuẩn E.Coli không sinh bào tử.............................................................. 78
Hình 3.10: Mẫu Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử ................................................ 79

xi
Hình 3.11: Thử nghiệm khả năng lên men đường........................................................ 80
Hình 3.12: Vi khuẩn Lactobacillus L5 có khả năng lên men đường ........................... 81
Hình 3.13: Đồ thị biểu hiện % acid lactic của 17 chủng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy... 84
Hình 3.14: Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của LN4-2 sau 3 ngày ............................ 87
Hình 3.15: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LN4-2 sau 3 ngày .............................. 87
Hình 3.16: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88
Hình 3.17: Khả năng đối kháng nấm ĐN2 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88
Hình 3.18: Đồ thị biểu thị Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn.......... 89
Hình 3.19: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái
qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13)................................................ 95
Hình 3.20: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái
qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13)................................................ 96
Hình 3.21: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái
qua: Nồng độ pha loãng 10-2
, 10-3
, 10-4
) ....................................................................... 98
Hình 3.22: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN2-canh trường nuôi
cấy+Chitosan 0.4% (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2
, 10-3
, 10-4
).......................... 98
Hình 3.23: Kết quả Coliform trên môi trường VRB của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ
trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2
, 10-3
, 10-4
)................................................................. 99
Hình 3.24: Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1-Canh trường nuôi cấy (Từ trái qua:
Nồng độ pha loãng 10-2
, 10-3
, 10-4
) ............................................................................... 99
Hình 3.25: Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar100
Hình 3.26: Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và NT2 (Canh
trường nuôi cấy và Chitosan 0,4%).............................................................................101

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày xưa, con người chỉ quan tâm đến việc ăn sao cho no, mặc sao cho đủ. Thế
nhưng, ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu của con người cũng được
nâng cao. Con người bắt đầu đặc biệt quan tâm đến sức khỏe hơn, thay vì ăn cho no thì
họ bắt đầu lựa chọn những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe.
Vì vậy, vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng hàng đầu ở mỗi quốc
gia, nó liên quan đến đời sống hàng ngày cũng như sức khỏe của con người. Theo
thống kê gần đây của ngành Y tế, ngộ độc thực phẩm có nguy cơ tăng dần và ngày
càng phức tạp. Nguyên nhân chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm phần lớn có nguồn gốc
từ các vi sinh vật hoặc nấm gây bệnh hiện diện trong thực phẩm, nước uống…
Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển đó.
Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử dụng các
thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến sẵn mà không
biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân thực phẩm cũng có
thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch bệnh hiện nay. Mặc dù
áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm
(GMP, HACCP…), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế
biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Besselink, et al., 2008). Chính vì thế, các cơ sở sản
xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử
dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng
không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi
nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng
hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con
người dường như đang sống cùng hóa chất và sức khỏe con người đang đứng trước bờ
vực thẳm.

2
Trước tình trạng đó, con người luôn tìm kiếm những sản phẩm vừa đầy đủ các
chất dinh dưỡng vừa bảo vệ được sức khỏe. Từ xưa, ông bà ta đã sử dụng các phương
pháp lên men truyền thống để bảo quản thực phẩm. Các phương pháp này không
những giữ cho thực phẩm không bị hư hỏng mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của
thực phẩm. Khi lên men thực phẩm là tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát
triển. Các nghiên cứu trong những thập niên gần đây cho rằng nhóm vi khuẩn sinh acid
lactic (LAB) có tiềm năng bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng
vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển (Bernet-Camard, et al., 1997). Và
việc nghiên cứu sản xuất các chất bảo quản thực phẩm theo hướng sinh học phần lớn
đều tập trung vào các hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) cũng như kháng nấm mốc
thực phẩm của LAB trong đó những nghiên cứu kháng nấm vẫn còn mới mẻ. Vì các
LAB đặc biệt các chủng đóng vai trò lên men thực phẩm truyền thống đã được chứng
minh là an toàn.
Do ở Việt Nam có rất nhiều các thực phẩm lên men truyền thống, tuy nhiên vẫn
chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm mốc của các chủng vi sinh vật trong
đó.
Hiểu được những lợi ích mà các sản phẩm lên men truyền thống mang lại và để
đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng bằng cách sử dụng các lợi khuẩn từ vi khuẩn
lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm. Do đó, người
thực hiện đề tài xin trình bày đề tài về: “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên
men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.”
2. Tình hình nghiên cứu
2.1. Ngoài nước
Phân lập các chủng Lactobacillus fermentum từ bột ngô có khả năng phân giải
tinh bột (Agati et al.., 1998)
Phân lập và chọn lọc dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 21B có khả năng
kháng nấm. (Lavermicocca et al.., 2000)

3
Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic (Magnusson J., 2003)
Hoạt động kháng nấm của vi khuẩn Lactobacillus paracasei (Hassan et al.., 2008)
Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi
khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới.
2.2. Trong nước
Nguyễn Hoài Hương, Đoàn Kim Như (2013). Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic
từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua. Tạp chí Khoa học
và công nghệ (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 51: 200-204
Phân lập và khảo sát vài đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic, muối chua nấm
rơm (Hồng Thị Hiền, 1998)
Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm
tỏi trong sản xuất thịt lên men (nem chua- xúc xích lên men) (Nguyễn Thị Lan Phương,
2012)
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn (Ngô
Thị Phương Dung, 2011)
Phân lập vi khuẩn Lactobacillus thuần từ tự nhiên để sản xuất măng tre lên men
chua (Nguyễn Văn Chương, 2008)
3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả
năng kháng nấm nhiễm thực phẩm. Mục tiêu cuối cùng là tuyển chọn được chủng vi
khuẩn lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm tốt.
4. Mục đích nghiên cứu
Cung cấp chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng
nấm cao được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống cho phòng thí nghiệm bộ
môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường.
5. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống.

4
 Khảo sát khả năng lên men lactic và tăng sinh khối của các chủng vi khuẩn
lactic.
 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic.
 Khảo sát sơ bộ khả năng ứng dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản đậu
phộng.
6. Phƣơng pháp nghiên cứu
6.1. Phương pháp luận
 Chọn nguồn phân lập đại diện cho các thực phẩm lên men truyền thống từ Việt
Nam như nem chua, cơm mẻ…
 Phân lập chủng thuần khiết, áp dụng phương pháp phân lập và định danh sơ bộ
với vi khuẩn lên men lactic.
 Khảo sát khả năng lên men lactic qua theo dõi sinh khối và acid tổng tạo thành.
 Khảo sát khả năng kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương
pháp đặt thạch khuếch tán – Agar Plug Diffusion Method (Mounyr Balouiri,
2011)
 Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng.
6.2. Phương pháp xử lý số liệu
 Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị
 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lý số liệu
7. Kết quả đạt đƣợc của đề tài
 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng tăng sinh khối và có hoạt
tính kháng nấm tốt từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ 2 nguồn thực
phẩm lên men truyền thống là cơm mẻ và nem chua.
 Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của canh trường vi khuẩn
lactic.

5
 Đánh giá sơ bộ khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic khi ứng dụng trên đậu
phộng.
8. Kết cấu đồ án
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề
tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được.
Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài.

6
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm
1.1.1. Giới thiệu chung
Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có
thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được
gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh sản qua bào tử
hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính.
Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả
thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng
sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật,
thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân
hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật
chất.
1.1.2. Độc tố nấm
Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối
lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối
với động vật có vú, cá, gia cầm và con người.
Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ
có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến
an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm:
 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),
ochratoxin A, stermatocystin, acid cyclopianxoic.
 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và
axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.

7
 Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2
toxin. - Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl
ether alternarion.
 Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà
Các độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do
nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm trên một số
hạt (như lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu mức độ ô nhiễm
thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và về dài
lâu sẽ gây ung thư.
Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium và
Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết,
độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết.
1.1.3. Tác hại của nấm
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật
 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm.
Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là
nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium...,
chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula,có một số loài là nấm lớn
như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma...Bào tử nấm có thể gây ra những chứng
như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá
mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo giác, hoặc trầm trọng
có thể tử vong.
 Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp.
Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida,
Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở
người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,… cho đến những bệnh

8
nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm
phổi do nấm Pneumocystis carinii.
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật
Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông
nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae)gây bệnh cho
lúa.Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và
Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm
giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,...
1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm
Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm
mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và
Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm. Một trong những nguyên nhân
được nhắc đến là do con người đã ăn thực phẩm có nấm mốc chứa aflatoxin, một độc
tố vi nấm đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Vậy aflatoxin
là gì?
Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus. Các
chủng nấm này phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia
cầm như ngô, lạc, đậu… trong các điều kiện thuận lợi nóng và ẩm, nhất là điều kiện
thời tiết ở Việt Nam. Tác hại của độc tố vi nấm này đối với động vật đã được biết đến
từ lâu và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Người có thể
bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị ô nhiễm hoặc ăn thịt các động vật
được nuôi bằng ngũ cốc ô nhiễm aflatoxin. Các trường hợp bị ngộ độc do chất độc tự
nhiên có trong thực phẩm thường xảy ra trong tình trạng cấp tính rất nặng, tỷ lệ tử vong
khá cao hoặc nếu bị nhiễm lâu dài có thể ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người.
Trên thực tế nếu bị nhiễm độc tố aflatoxin của vi nấm có trong thực phẩm có thể
gây nên bệnh ung thư gan, giảm năng suất sinh sữa và trứng ở các động vật nuôi như

9
bò, cừu, gia cầm... Loại độc tố này khá bền vững ở nhiệt độ cao, đun nóng thường
không phá hủy được chúng.
Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính với các biểu hiện chính là suy chức năng gan
cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan. Nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư
gan ở người cũng còn rất nhiều tranh cãi. Tuy nhiên ở một số nghiên cứu, các nhà khoa
học đã tìm thấy có sự gắn kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan cũng như có sự
đột biến gen mà đặc biệt là gene p53 – một gene kiểm soát sự chết tế bào, ở những
bệnh nhân mắc ung thư gan.
Có 4 tác động chính gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột
biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan, rối loạn chức năng hoạt
động của thận và có thể gây tử vong đối với trường hợp nặng. Ngoài ra, các độc tố vi
nấm còn tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ
cao có thể gây tổn thương não và chết. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã
xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép DNA và gây hậu quả là
đột biến hoặc quái thai.
1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic
1.2.1.1. Giới thiệu chung
Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại
thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản
xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học
người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875,
L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một
nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân
lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus
lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình
thành.

10
Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả,
làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính quan trọng
khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn)
như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một
số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm
(Batt, 1999; Dubernet et al., 2002).
Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ sữa
bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as
safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi
sinh vật có ích của con người.
1.2.1.2. Khái niệm
Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả
năng lên men đường để tạo acid lactic, có một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm
sinh lí, sinh hóa và sự trao đổi chất. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ
Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng
khác nhau, chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) dài ở dạng đơn, đôi
hoặc xếp thành chuỗi và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng
thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic được tạo ra
như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men
carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, acid hóa ức chế sự
tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một số chủng LAB có thể sinh bacteriocins ức
chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987). Hơn nữa, acid lactic và các sản phẩm trao
đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm.
Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màu trắng
đục hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc
biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid.

11
Theo bảng phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống
thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que,
trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella. Trong khóa phân loại của Bergey 1957,
giống Bifidobacterum cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic, trong đó chúng được
xem như là Lb.bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung
của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae - một
nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men khác với vi khuẩn lactic. Việc
phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học,
chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình
sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc
kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần
của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng
trong phân loại.

12
Trong đó: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau.
- Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an
toàn với con người.
1.2.1.3. Đặc tính chung
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm
tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng
con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống
Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn lactic có thể lên men các loại đường
monosaccharide và disaccharide nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên
men được bất kỳ loại disaccharide nào, một số không lên men được saccharose, một số
Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004)

13
không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột (trừ
chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccaride khác.
Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn lactic,
thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được
xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng
được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung
của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một
nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic.
Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu
nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Đây là
những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không sinh bào tử. Tất cả vi khuẩn lactic đều không
chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi.
Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0.5 – 1.5μm. Các tế bào hình cầu
xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn
lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.
Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin,
hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn.
Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống
được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl,
có thể sống trong môi trường từ 7 – 10% NaCl.
Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong
môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các trực
khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 – 3%) liên cầu khuẩn
(khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3.8 – 4 (cầu khuẩn không thể
phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH
5.5 – 6.

14
Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 – 35o
C,
nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 45o
C, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ
tương đối thấp ( 5o
C). Khi gia nhiệt đến 60 – 80o
C thì hầu hết chúng bị chết sau 10 –
30 phút. Một số vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả
năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực
phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo ra acid lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất
có hoạt tính kháng sinh (Bacteriocin).
Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không
khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả,
sữa, thịt,…).
1.2.1.4. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu
Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình
cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài.
 Giống Lactobacillus
Bảng 1.1: Phân loại khoa học giống Lactobacillus
Giới : Vi khuẩn
Nghành : Firmicutes
Lớp : Bacilli Bacilli
Bộ : Lactobacillales
Họ : Lactobacillaceae
Giống : Lactobacillus

15
Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L.
casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus …
Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều
kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng
riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động,
không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi
trường có pH thấp.
Trên môi trường agar, khuẩn lạc lồi, mép trơn, đục có đường kính 2-5mm.
Hiếm khi tạo sắc tố nhưng khi tạo sắc tố thì thường là màu vàng, màu cam hay màu gỉ
sắt và màu đỏ gạch.
Hình 1.3: Lactobacillus salivarius
Hình 1.2: Lactobacillus (L. acidophilus)

16
Không có khả năng chuyển hóa nitrate, trừ loài L. plantarum khi ở điều kiện nhất
định. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được
nhiệt độ cao.
Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật
và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh
dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có
chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như:
Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus
casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum.
Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi
chất của chúng. Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau:
- Nhóm I – Lên men đồng hình bắt buộc: Chúng được gọi là Thermobacterium,
cófructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có
phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không
lên men được pentose, thường phát triển ở 45o
C.
- Nhóm II – Lên men dị hình tùy nghi: Chúng được gọi là Streptobacterium (có
FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men
đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid
acetic.
- Nhóm III - Lên men dị hình bắt buộc: Chúng được gọi là Betabacterium (có
phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả
hexose và pentose lên men dị hình.

17
Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986)
Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III
Lên men pentose - + +
Tạo CO2 từ glucose - - +
Tạo CO2 từ
gluconate
- +a
+a
Sự hiện diện FDP
aldolase
+ +
Sự hiện diện
phosphoketolase
+b
+
Một vài đại diện L.acidophilus
L.delbrueckii
L.halveticus
L.salivarius
L.casei
L.curvatus
L.plantarum
L.sake
L.brevis
L.buchneri
L.fermentum
L.reuteri
a: Khi lên men b: Cảm ứng khi có pentose
Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích trong
việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích
thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clotridium
difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: bang đỏ do sốt, chàm,
viêm loát da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp.
 Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic đồng hình:
 Lactobacillus acidophilus: trực khuẩn dài. Đây là loài ưa nhiệt, nhiệt độ tối
thiểu cho sinh trưởng là 20o
C và tối thích là 37 – 40o
C. Trực khuẩn này được
phân lập từ ruột trẻ em và bê mới đẻ.
 Lactobacillus bulgaricus: trực khuẩn tròn (đôi khi dạng hạt), thường kết
thành chuỗi rất dài được tìm ra do Metchnikoff ở sữa chua Bungari. Có khả
năng lên men được đường glucose, không lên men được đường saccharose.

18
Đây là loài ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển là 45 – 50o
C, nhiệt
độ tối thiểu là 15 – 20o
C, có khả năng tạo acid rất cao (từ 2.5 – 3.7% acid
lactic).
 Lactobacillus plantarum: trực khuẩn nhỏ, thường kết thành đôi hoặc chuỗi.
Là loài ưu ấm, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng là 30o
C, tích tụ được
khoảng 1.3% acid. Loại này tìm thấy chủ yếu trong rau muối chua và ủ chua
thức ăn xanh dùng cho chăn nuôi. Flening (1969) đa kết luận rằng sự đóng
góp quan trọng nhất của vi khuẩn này là việc tạo mùi vị cho sản phẩm lên
men và sinh ra hàm lượng acid để bảo quản, ngăn cản những vi sinh vật
không mong muốn có thể sinh ra mùi xấu cho sản phẩm.
 Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình:
 Lactobacillus brevis: tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải, dưa
chuột, nên nó còn được gọi là "trực khuẩn bắp cải". Trong lên men, ngoài tạo
thành acid lactic (1.2%) nó còn tạo thành acid acetic, rượu ethylic (2.4%) và
CO2. Đồng thời tạo hương làm sản phẩm có hương vị dễ chịu.
 Lactobacillus pentoaceticus: là trực khuẩn, không sinh bào tử. Nhiệt độ thích
hợp cho sự phát triển là 30 – 35o
C. Vi khuẩn này lên men một số đường như:
glucose, fructose, galactose, mannose...
 Lactobacterium lycopersici: Là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo
thành chuỗi hay đơn, có khi tạo thành từng đôi một. khi lên men tạo thành
rượu, acid latic, acid acetic và CO2, chúng có khả năng tạo bào tử. Tế bào
sinh dưỡng thường chết ở 77 – 80o
C.
 Lactobacterium – coli – aerogenes: là giống đại diện của lên men lactic dị
hình. Có dạng hình que, không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp cho phát
trển là 35 – 38o
C. Thường gặp loại này trong nước, trên bề mặt rau quả, trong
ruột người và động vật, trong sữa chua,… Sản phẩm của vi khuẩn này là acid
lactic, acid acetic, acid succinic, rượu ethylic, CO2, H2O và indole.

19
 Giống Streptococcus
Phân loại khoa học
Bảng 1.3 : Phân loại khoa học giống Streptococcus
Có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0.5 – 1µm Sau khi phân
chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn, là loại vi
khuẩn không nha bào, Gram dương, không di đông, và thường không tạo sắc tố, vỏ tế
bào của một số loài có thể nhận thấy trong điều kiện nhất định, có khả năng lên men
nhiều loại đường như: glucose, lactose, maltose,…
Trong môi trường lỏng, sinh khối có thể có dạng nhám có dạng hạt và nổi trên
mặt nước hoặc là dạng mịn gây đục môi trường. Trên môi trường agar, khuẩn lạc
Giới : Vi khuẩn
Họ : Streptococcaceae
Giống : Streptococcus
Hình 1.4: Streptococcus

20
thường nhỏ hơn 1mm, trong cùng 1 loài có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng min và
tạo chấy nhầy, bề mặt khuẩn lạc lồi
Sau khi lên men đường, sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một
lượng đáng kể ethanol, acid acetic, acid formic…khi lên men glucose trong môi trường
có tính kiềm (Gunsalus và Niven, 1942).
Không có khả năng chuyển nitrate thành nitrite, kị khí không bắt buộc, không
sống được trong môi trường với 10% muối mật, những chủng phân hủy protein chỉ có
trong nhóm enterococcus. Tất cả các chủng trong Streptococcus đều có nhu cầu dinh
dưỡng rất phức tạp, một số loài có nhu cầu về vitamin B và các aminoacid trong khi số
khác có nhu cầu về các acid béo không no và gia tăng lượng CO2 . Vì vậy nhu cầu về
dinh dưỡng cũng giúp ích trong việc xác định một loài. (Dubos, 1948).
Sự phân loại các loài thuộc Streptococcus (Sherman, 1937). Theo đó, chúng được
chia ra thành 4 nhóm:
 Nhóm sinh mủ (pyogenic)
 viridans
 Enterococcus
 Nhóm lactic.
Sự phân chia này dựa trên các đặc điểm sinh lý đặc trưng tương ứng với mỗi
nhóm, đặc biệt là khoảng nhiệt độ phát triển. Tuy nhiên với các loài mới được công
nhận làm cho đặc điểm mỗi nhóm trỏ nên ít khác biệt nhau vì chúng cùng lúc mang
nhiều đặc điểm của hơn 1 nhóm.
Ví dụ: Streptococcus tiberis Diernhofer thuộc nhóm viridans, nhưng nó lại mang
những đặc mà ta có thể đặt nó vào nhóm Enterococcus. Trong khi Streptococcus
acidominimus Ayers và Streptococcus Mudge cũng thuộc nhóm viridans, nhưng cũng
có thể xem như thuộc nhóm pyogenic
 Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình:
 Steptococcus cremoris: thường tạo thành một chuỗi dài. Tế bào có kích thước

21
0.6 – 0.7µm, thường phát triển ở nhiệt độ thấp hơn.
 Streptococcus lactis. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 25 – 35o
C, nhiệt độ tối đa là
35 – 38o
C. Lên men glucose và galactose.
 Steptococcus lactis: cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết
song đôi thành chuỗi ngắn. Đây là loại ưu ấm, nhiệt độ tối ưu 30 – 35o
C,
Nhiệt độ tối thiểu cho sự phát triển là 10o
C và tối đa là 40 – 50o
C. Trong môi
trường chúng có khả năng tích tụ được khoảng 0.8 – 1% acid. Một số chủng
tạo thành bacteriocin ở dạng nisin, là một hợp chất có tính kháng sinh được
dùng trong bảo quản thực phẩm.
 Streptococcus thermophillus: hình cầu kết thành chuỗi dài, phát triển tốt nhất
ở 40 – 45o
C, trong quá trình lên men chúng có khả năng tích tụ được khoảng
1% acid.
 Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình:
 Streptobacterium brassicae fermentati: thường thấy chúng có trong dịch lên
men chua rau cải. Thường tồn tại tế bào đơn hoặc ghép thành từng đôi hoặc
chuỗi ngắn và thường tạo thành chuỗi dài hình sợi. Đuôi tế bào thường uốn
cong lại. Khi lên men rau cải chua tạo thành acid lactic, acid acetic và rượu
(đến 2.4%) và CO2. Chúng lên men saccharose tốt hơn lactose.
 Giống Leuconostoc

22
Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc
Đặc điểm: ( Van Tieghem, 1878), (Orla-Jensen, 1919), (Hucker và Pederson,
1930).
Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan đơn lẻ, cặp đôi đường kính từ
0.5 – 0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm.Trong môi trường nhất định như nước trái cây
hoặc rau quả có tính acid, tế bào có thể kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que., chiều
dài khoảng 1 - 3µm. Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo
thành đám tập trung. Trong số đó, Leuconostoc mensenteroides cùng với một số vi
khuẩn lactic đồng hình khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến
rau muối chua. Một số loài tạo chất nhờn đặc trưng khi sống trong môi trường chứa
Giới : Vi khuẩn
Họ : Leuconostocaceae
Giống : Leuconostoc
Hình 1.5: Leuconostoc

23
sucrose. Đối với môi trường bình thường, sự tăng trưởng được kích thích nhờ việc bổ
sung cao nấm men, nước chiết cà chua hoặc rau củ.
Leuconostoc là một loài kỵ khí không bắt buộc. Khi lên men tạo ra một lượng
hạn chế acid lactic. Luôn tạo L- lactic acid nhưng đôi khi cũng tạo D-lactic acid. Acid
acetic và rượu cũng được tạo thành và khoảng lượng glucose lên men được chuyển
thành CO2. Không làm đông tụ sữa, chuyển hóa fructose thành mannitol, được tìm
thấy trong lên men sữa và rau quả, ví dụ như : Leuconostoc mesenteraides
(Cienkowski) Van Tieghem.
 Giống Pediococcus
Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus
Giới : Vi khuẩn
Họ : Lactobacillaceae
Giống : Pediococcus

24
Gồm các loài nhƣ: P. acidilactici, P. cellicola, P. claussenii, P. damnosus, P.
ethanolidurans, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. stilesii
Đặc điểm: ( Balcke, 1884)
Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn, có khi đơn lẻ hoặc dạng
chuỗi ngắn. Có hoạt tính thủy phân protein rất yếu, Gram dương, không di động, âm
tính với catalase.
Khoảng nhiệt độ tối ưu là 25 – 32o
C, chúng là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, có
thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí.
Quá trình trao đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình.Chúng là những vi
khuẩn yếm khí tùy nghi, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không
khí. Chúng không có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite, khả năng phân hủy
protein kém cũng không có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển
của cơ thể vì vậy chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường .
Các loài Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu acid và chịu NaCl.
Loài điển hình là Pediococcus cerevisiae (Balcke,1884)
1.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
1.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Hình 1.6: Pediococcus

25
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn
lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình thường
chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như
carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu
cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ, các chất sinh trưởng…
 Nhu cầu dinh dưỡng carbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrate carbon từ các monosaccaride
(glucose, fructose, manose), các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến
các polysaccharide (tinh bột, dextrin).
Chúng sử dụng nguồn carbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế
bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric,
lactic, pyruvic, fumaric, acetic,..
 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy
để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn
trong môi trường.
Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men,
trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ
được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không
thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
 Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào,
nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có
khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin.
Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay
dịch tự phân nấm men…
 Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

26
Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác
cho sự phát triển như các baz nitơ hay các acid hữu cơ.
Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn
lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn
xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng
vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng
đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các
muối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
 Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối
vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu
huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan tham gia và đảm bảo chức năng hoạt
động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.
 Nhu cầu dinh dưỡng oxi
Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề
mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí. (Wood B.J.B
and Holzapfel W.H. 1995). Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi
trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong điều
kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí
Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều
kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn
thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36
hoặc 38 ATP.
Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ
chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn.
1.2.2.2. Qúa trình trao đổi chất

27
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua
việc lên men lactic.
Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên
men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học
khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường). LAB có
khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose…),
disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp
chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy
nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao
đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau.
Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai
nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.7).
 Lên men lactic đồng hình
Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo
ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-
acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:
C6H12O6  2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J
Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas
pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III
Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ
FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và
glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị
trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy,
pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+
, do đó
NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối
cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng
hình.

28
 Lên men lactic dị hình
Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường
pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6-
phosphogluconate và được gọi chung là 6-phosphogluconate/phosphoketolase (6-
PG/PK). Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6-
phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục
chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được
tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic.
Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo
thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid
lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic,
acid succinic... thì nó được gọi là lên men lactic dị hình.
Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:
C6H12O6  CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic
và acid acetic 10% các loại khí 20%.... đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự
tích luỹ một lượng ít acid foocmic. Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo
thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn
so với lên men lactic đồng hình.
Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men
lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình.
Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường
glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy nhiên
nó không phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R. Fennema et al. 2004).
Chú thích hình 1.7
(A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB)
(B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase)

29
Các enzyme tham gia vào quá trình : 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-diphosphate
aldolase; 3. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5. Lactate
dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7. 6-phosphogluconate
dehydrogenase; 8. Phosphoketolase; 9. Acetaldehyde dehydrogenase; 10. Alcohol
dehydrogenase.

30
Hình 1.7: Con đường lên men Glucose

31
1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn lactic
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần
đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là
lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp
không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn
ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.
 Thành phần môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho
hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi
trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa
nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi
khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế
bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn
carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối
khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với
liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên
men.
 Yếu tố môi trường
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh
vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm
đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi
khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40o
C. Một số có thể sinh trưởng dưới
15o
C và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5o
C (Wood B.J.B and Holzapfel
W.H, 1995).

32
 Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm, và
khi nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đó,
cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi.
Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nầm giữa 5.5 và 6.0.
 Ảnh hưởng của nồng độ acid
Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi
khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích
lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát
triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta
cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid
sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3.
 Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men
Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những
mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao
đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men.
1.2.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập
1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R. Fennema et
al. 2004)
Ban đầu “vi khuẩn lactic” được dùng để chỉ các vi khuẩn làm sữa chua và sau
đó một dạng vi khuẩn thuần khiết cũng được cho là vi khuẩn lactic (có thể là
Lactococcus lactis) được đưa ra bởi J. Lister vào năm 1873. Một bước quan trọng trong
phân loại vi khuẩn lactic được hình thành khi có sự giống nhau giữa các vi khuẩn trong
sữa chua và các vi khuẩn tạo acid lactic khác có trong các nguồn khác nhau. Tuy nhiên
vẫn còn nhiều nhầm lẫn khi chuyên khảo của Orla-Jensen xuất hiện (Orla-Jensen,
1919) và nó có ảnh hưởng lớn đến hệ thống phân loại của LAB, mặc dù đã có sự sửa
đổi dáng kể nhưng cơ sở cho việc phân loại vẫn không thay đổi, Orla-Jensen vẫn phân

33
loại dựa trên phương pháp cổ điển như : so sánh hình thái vi khuẩn (cocci, rod hoặc
dạng tetrad), hình thức lên men glucose ( đồng hình, dị hình), khả năng phát triển ở các
nhiệt độ khác nhau (10o
C và 45o
C), khả năng lên men các nguồn đường khác nhau.
Năm 1985 có thêm nhiều giống LAB mới được mô tả, tuy nhiên việc phân tích theo
phương pháp cổ điển dựa vào hình thái vi khuẩn vẫn giữ vai trò quan trọng trong phân
loại LAB.
Các giống LAB cũng đã được mô tả lại trong Bergey’s manual 1986, đây được
xem như là phiên bản cuối cùng và chủ yếu tiếp tục phản ánh kết quả của Orla-Jensen
1919. Trong đó có sự phù hợp với các mô tả chung của các giống LAB điển hình:
Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Sự thay đổi
chính trong Bergey’s manual 1986 là giống Streptococcus lần đầu tiên được chia thành
3 nhóm : Enterococcus, Lactococcus và Streptococcus sensu stricto (Schleifer. 1987).
Một vài giống LAB giống với Lactococci được đề nghị xếp vào giống Vagococcus, các
giống Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus không có thay đổi nhiều, tuy nhiên một
vài loài trong Lactobacills được xếp vào giống Carnobacterium, và loài Pediococcus
halophilus được đưa lên cấp giống là Tetragenococcus, một số LAB lên men dị hình
trong Lactobacillus và Leuconostoc được xếp vào giống Weissella, ngoài ra một số
giống mới cũng được mô tả có liên quan nhiều đến LAB như Alloiococcus,
Dolosicoccus, Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus,
Ignavigranum và Lactosphaera…Bản sửa đổi được thực hiện vào năm 1986 cũng đã
hỗ trợ nhiều trong việc phân loại vi sinh vật dựa trên thành phần hóa học và di truyền.
1.2.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R. Fennema et al. 2004)
Như đã đề cập, cơ sở chung cho việc phân loại LAB vào các giống khác nhau
chủ bằng phương pháp định danh cổ điển và so sánh với khóa phân loại của Bergey’s
manual1986, tuy nhiên việc này ngày càng gặp khó khăn để đạt kết quả tin cậy khi
phân loại một số giống mới nhưng nó lại là bước quan trọng trước khi tiến hành các
phân tích sâu hơn.

34
LAB được phân chia theo hình thái như sau : dạng trực khuẩn (rod) gồm
Lactobacillus và Carnobacterium; dạng cầu khuẩn gồm tất cả các giống còn lại và một
ngoại lệ là đối với giống Weissella được mô tả gồm cả dạng trực khuẩn và cầu khuẩn;
thêm vào đó, sự phân chia tế bào theo hai hướng vuông góc trên cùng một mặt phẳng
dẫn đến sự hình thành dạng tứ cầu khuẩn (tetrad) và nó cũng được sử dụng để mô tả
một dạng khác của cầu khuẩn, bao gồm các giống Aerococcus, Pediococcus và
Tetragenococcus.
Phân chia theo hình thức lên men glucose, LAB được chia vào 2 nhóm: lên men
đồng hình chuyển hóa glucose chủ yếu thành acid lactic và lên men dị hình tạo acid
lactic, ethanol, acid acetic và CO2. trong thực nghiệm, kiểm tra sự sinh khí CO2 để
phân biệt giữa 2 nhóm (Sharpe. 1979). Leuconostoc, Oenococci, Weissella và phân
nhóm của Lactobacilli là lên men dị hình, tất cả các LAB khác là lên men đồng hình.
Sự phát triển ở các nhiệt độ khác nhau cũng gióp phần phân biệt một số giống
thuộc cầu khuẩn: Enterococci phát triển ở 10o
C và 45o
C, Lactococci và Vagococci phát
triển được ở 10o
C nhưng không thể sống ở 45o
C, Streptococci thường không phát triển
ở 10o
C trong khi lại có thể phát triển ở 45o
C tùy vào loài. Sự chịu muối (6,5% NaCl)
cũng được sử dụng để phân biệt giữa Enterococci và Lactococci; Vagococci và
Streptococci (Mundt. 1986). Đặc biệt khả năng chịu muối (18% NaCl) được giới hạn
trong Tetragenococcus. Khả năng chịu acid ơ kiềm cũng rất hữu ích trong việc phân
loại. Aerococci, Carnobacteria, Enterococci, Tetragenococci và Vagococcicos thể phát
triển ở pH cao những không phát triển ở pH=9.6.
Ngoài ra sự hình thành các dạng đồng phân của acid lactic trong quá trình len
men glucose cũng được sử dụng trong phân biệt giữa Leuconostocs (chỉ tạo D-lactic
acid) và Lactobacilli lên men dị hình (tạo acid lactic cả 2 dạng D và L). Tuy nhiên
Weissella có thể gây nhầm lẫn trong vấn đề này.
 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái:
 Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến).

35
 Kiểm tra khả năng di động: Nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi
trường thạch mềm.
 Nhuộm bào tử: Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) Nhuộm
Carbolic Fuchsin.
 Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ
Congo, Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
 Nhuộm thành tế bào
 Nhuộm hạt dị nhiễm
 Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid)
 Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis)
 Nhuộm vi khuẩn kháng acid
 Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý:
 Hình thái khuẩn lạc
 Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt, chịu acid, chịu muối mật…
 Nhu cầu oxygen.
 Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa:
Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định
danh cho phù hợp như: Khả năng đồng hóa các nguồn carbon, Khả năng đồng hóa các
nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn,
đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả
năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm
catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza,
glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng M.R. (Đỏ
Methyl - Methyl Red), phản ứng V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza. ...
Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như:
 API20E KIT

36
Nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi
vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều
nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh
hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào,
lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết
quả.
 Phân biệt bằng thực khuẩn thể:
Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể
xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt
trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng
lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự
khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối
tượng vi khuẩn nghiên cứu.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là
các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại
cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể
khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm
thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.
 Phân biệt theo Typ huyết thanh:
Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang
được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng
nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của
phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau,
trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định
nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng
huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các
phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại.

37
 Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin):
Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi
khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng
lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu
bacteriocin.
1.2.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại
Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu
hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương pháp
truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học
phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật.
Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu
là:
 Phân tích acid nucleic.
 Phân tích protein.
 Phân tích polysaccharid.
 Hóa phân loại học.
Việc phân loại LAB như đã mô tả trong mục 1.2.3 chủ yếu dựa trên hình thái và
đặc điểm sinh lý, sinh hóa . Tuy nhiên trong thực nghiệm, các đặc điểm này không đủ
để định danh chính xác một chủng đến cấp loài cụ thể. Ngày nay với công nghệ xác
định trình tự DNA một các tự động và nhanh chóng, người ta đã trực tiếp xác định
được trình tự của gen mã hóa cho 16S rRNA và tạo phương tiện dễ dàng cho phân loại
vi khuẩn. (Owen R. Fennema et al. 2004)
Việc xác định trình tự của gen 16S rRNA để phân tích sự phát sinh loài của LAB
đã được thự hiện vào những năm 1990, bắt đầu từ sự phát triển các đầu dò DNA để
định danh vi khuẩn. Việc phân loại LAB bằng các đầu dò 16S hoặc 23S RNA đã được
phát triển và sử dụng đối với Lactococci, Enterococci, Lactobacilli, Carnobacteria và
phân biệt Vagococci với các LAB khác…. Dữ liệu về trình tự các gen 16S rRNA của

38
LAB đã được tích lũy trong suốt nhiều năm qua và danh mục các đầu dò hiện có được
đưa ra bởi Pot et al.
1.2.4. Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic
1.2.4.1. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic
 Các enzyme tiêu hóa
Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một sốt lượng lớn các enzyme ngoại
bào kích thước hệ thống tiêu hóa như: tổng hợp enzyme amylase, protease, lipase,
glycolase và lactic dehydrogenase.
 Proteolysis (khả năng phân giải protein): Vi sinh vật tổng hợp protease
giúp phân hủy protein thành những hợp chất đơn giản có thể tiêu hóa
được.Hoạt tính này của Lactobacilli trong đường ruột giúp phân hủy
protein và vật chủ có thể tiêu thụ dễ dàng.
 Lipolysis: Vi sinh vật tổng hợp lipase giúp phân hủy các chất béo phức
tạp thành những hợp chất đơn giản. Điều này có thể hữu ích trong việc tạo
ra các khẩu phần ăn dinh dưỡng và hợp lý cho trẻ em, người già và người
đang dưỡng bệnh. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng Lactobacilli có thể
phân hủy cholesterol.
 Biến dưỡng lactose: Vi khuẩn sinh acid lactic có enzyme b-galactosidase,
glycolase và lactic dehydrogenase có thể sản sinh acid lactic từ lactose. Acid
lactic có những lợi ích như sau:
 Chữa trị bệnh không dung nạp lactose do thiếu các enzyme biến
dưỡng enzyme.
 Tăng cường khả năng tiêu hóa protein trong sữa bằng việc làm đông tụ sữa.
 Tăng cường việc sử dụng canxi, phospho, sắt.
 Kích thích sự bài tiết.
 Kích thích sự tiêu hóa trong dạ dày.
 Bảo tồn nguồn năng lượng trong quá trình hô hấp.

39
 Các vitamin và các chất trao đổi có lợi cho sự tăng trưởng
 Vitamin: Vi sinh vật dùng làm probiotics đóng vai trò nổi bật trong ruột bằng
việc tổng hợp vitamin: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H), vitamin K.
 Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn
Bacteriocin: Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh
tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ
gần với giống sản xuất. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn gram âm hoặc
gram dương. Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau:
Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome.
 Tế bào chủ miễn dịch với chúng.
 Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng
vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất.
 Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó LAB (lactic
acid bacteria) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ
kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng
làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm và vì tính an
toàn của chúng.
Bacteriocin được sản xuất bởi LAB được chia thành 4 lớp:
Lớp I: (Lantibiotic) là những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chứa những
amino acid hiếm và một số amino acid khử nước. Lantibiotic được tạo thành ở trạng
thái bất hoạt với trình tự leader peptide ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá
trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt hóa.
Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa), thường gồm những phân tử
peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa Lanthionine và bền nhiệt, phổ kháng
khuẩn hẹp.
Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt, lớp này gồm
những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của

40
bacteriocin. Bacteriocin lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus.
Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành
phần lipid và carbohydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng
như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này
được tinh sạch.
 Các chất khác có khả năng kháng bệnh
Vi khuẩn sinh acid lactic cũng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi
sinh vật gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác như:
hydrogen peroxide, carbon dioxide và diacetyl.
Quá trình biến dưỡng của vi khuẩn sinh acid lactic có ảnh hưởng đến khả
năng kháng lại các vi sinh vật có hại và các dạng hoạt động khác của chúng.
1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính
kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều
trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và
nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản thực
phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt,
có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ
được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu
cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực
phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính
acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn sản sinh
bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài ra, chúng
còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid
lactic,...
1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic

Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp.

Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp.

Empfohlen

Empfohlen

Weitere ähnliche Inhalte

Was ist angesagt?

Was ist angesagt? (20)

Ähnlich wie Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp.

Ähnlich wie Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp. (20)

Mehr von TÀI LIỆU NGÀNH MAY

Mehr von TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Kürzlich hochgeladen

Kürzlich hochgeladen (20)

Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp.