Adriana de la torre diapos ficha urea y expresión génica

Absorción de urea aumenta la función barrera y defensa
antimicrobiana en humanos por regulación de la
expresión génica epidérmica

Dra. Adriana De La Torre

Grether-Beck S et al. Urea uptake enhances barrier function and antimicrobial defense in humans by
regulating epidermal gene expression. J Invest Dermatol 2012; 132: 1561-72

Barrera cutánea contra:
1. Pérdida de agua transcutánea
2. Penetración de patógenos
3. Ingreso de agentes xenobióticos
potencialmente tóxicos

Estructura de un corneocito
Envoltura cornificada: loricrinas, involucrinas y
filagrinas
Filamentos de queratina

Matriz proteica: filagrinas

Capa lipídica: esfingolípidos y ceramidas

Diferenciación epidérmica:

• Queratinocitos progresan
verticalmente a partir de células
basales
• Estrategia osmótica
• Regeneración epidérmica
Se sugiere: Urea

• Mejora la función barrera al utilizarse
tópicamente
• Beneficiosa para las enfermedades
cutáneas infecciosas, con defensa
antimicrobiana alterada
• Hidratante y queratolítico: psoriasis,
ictiosis, y dermatofitosis

Urea:
• Metabolito no tóxico, soluble en agua y transporta del nitrógeno
excretado

• Transportadores de urea:

1. UTA: UT-A1 a UT-A6, expresados principalmente en
túbulos colectores y medula renal

2. UT-B en eritrocitos, células endoteliales de riñón y cerebro

3. En queratinocitos normales, pueden estar expresados
algunos de los transportadores

4. Urea estimula expresión de 2 transportadores UT-A1 y UT-
A2, y aquaporinas 3, 7, 9.


Péptidos antimicrobianos, inmunidad innata de la piel

• os ptidos nicos, menos de 100
residuos de aa, inhiben el crecimiento de
microorganismos

• Piel y mucosas

• Respuesta inmunitaria innata, línea de defensa

• Con una n xica directa sobre
bacterias, hongos y virus.

• Modifican la respuesta inflamatoria local y
activan mecanismos de n inmunitaria
adaptativa

• Defensinas y las catelicidinas

Péptidos antimicrobianos, inmunidad innata de la piel

• Receptores toll-like (TLRs) sensores de microorganismos en
células epiteliales, queratinocitos, células dendríticas circulantes y
macrófagos

• Reconocen Patrones moleculares vinculados con la patogenicidad
(PAMP), como lipopolisacárido bacteriano (LPS), lipoproteínas
bacterianas dsRNA y flagelina

• Con este reconocimiento, activación intracelular, expresión de
péptidos antimicrobianos


 Determinar los efectos de la urea tópica sobre la
barrera epidérmica y su base bioquímica

 Determinar los transportadores de urea expresados
en queratinocitos


 Identificar los genes implicados en la formación de la
barrera cutánea, regulados por la urea exógena

Transglutaminasa-1, involucrina, loricrina, filagrinas,
producción de lípidos epidérmicos y péptidos
antimicrobianos: LL-37, y β-defensina-2


1. Voluntarios: Estudio doble ciego controlado

21 humanos, sanos:
Urea al 10, 20 % y placebo, tópica,
diaria, en 3 áreas:
Antebrazo izquierdo placebo
14 7 Antebrazo derecho urea 10%
Brazo derecho urea 20%
Igual 3 áreas tratadas, en glúteos
Biopsias punch de 4 mm e
Consentimiento informado inmunofluorescencia

Edad: 21-59 años, media: 40 años

No fumadores y sin enfermedad cutánea previa

 TEWL: antes y después del tratamiento, con evaporímetro
(Tewameter)

 Células y cultivos celulares: Queratinocitos humanos epidérmicos a
partir de prepucio neonatal. Se cultivan, siembran, y se induce la
diferenciación. Piel no tratada (control)

 ARN se extrae de cultivo de células o biopsias congeladas, medidos
por RT-PCR. Se comparan biopsias de piel tratada con piel no
tratada (prepucio neonatal)

 Expresión de ARNm de UTs, AQPs y cotransportadores por PCR en
tiempo real


Medición del transporte de urea:

 Expresión de transportadores de urea se indujo agregando
10 mM urea. Para radiomarcaje se añade a las células 14C
urea y se incuban por 4 minutos.

 Inhibidores del transporte de urea phloretina (50 mM) y
thiourea (100 mM), se añadieron junto con urea 14C

 Inhibidores de aquaporinas: mercurio(HgCl2) , níquel (NiCl2)
y cobre (CuSO4) se incubaron por 24 horas

 Medición de concentración de proteínas por técnica BCA


• Western Blot, presencia de involucrinas y filagrinas con Ac
antiinvolucrina y antifilagrinas en queratinocitos cultivados por 24-72
horas con urea e inhibidores de urea

• Inmunofluorescencia en biopsias congeladas de 3 donantes sanos, y
medir involucrinas, loricrinas, filagrinas, LL-37, β-defensina-2.

• t de student: método estadístico


Modelo de Dermatitis Atópica en ratones
 Ratones hembras, alopécicos (hora / hora) de 6-8 semanas de
edad

 Aplicación tópica de 1% Oxazolona en flanco y luego 0,1% en
ambos flancos induciendo dermatitis atópica.
 Se dividen en 4 grupos: placebo 0%, 5, 10, y 20% de urea,
BID por 6 horas durante 21 días
 TEWL, Corneómetro, antes y después del tratamiento

 Biopsias y Ac dirigidos contra péptido antimicrobiano y β-
defensina-3

 Análisis estadístico: t de Student o la prueba de Wilcoxon P <0.05
fue considerado significativo

Efectos in vivo de la urea en la función barrera
de voluntarios humanos normales

Urea 10% no hubo diferencias estadísticamente
significativas en TEWL
Urea 10% y 20%, aumento de expresión de involucrinas,
filagrinas, loricrinas, TG-1, AMP

Expresión y funcionalidad de los transportadores de
urea y aquaporinas en queratinocitos humanos

34 %

Aumento de expresión de UT-A1 y UT-A2 a concentraciones
Phloretina y thiourea (34%), inhiben el transporte de urea, y
su absorción, parcialmente (UT-A1 y UT-A2)
de 10 mM urea

Expresión y funcionalidad de los transportadores de
urea y aquaporinas en queratinocitos humanos

66 %

Otros transportadorescopias: queratinocitos: Na-glucosa
Mayor número de en los UT-A2, AQP-3, y UT-A1
Inhibición de aquaporinas y por tanto absorción de urea,
Poca relevancia de cotransportador, Na-
otros cotransportadores en el transporte
yodo viene dada por J menos expresados4, NiCl2
HgCl2 (66%), CuSO
regulating epidermal genede urea, Invest Dermatol 2012; 132: 1561-72
cotransportador y Na-Cl GABA cotransportador
expression.

Regulación del mRNA de proteínas de diferenciación

Aumento de la expresión génica de transglutaminasa-1,
involucrinas, loricrinas, y filagrinas a las 48-72 horas de
regulating epidermal gene expression. con caída a las 72 horas
incubación, J Invest Dermatol 2012; 132: 1561-72

Regulación del mRNA de enzimas de síntesis lipídica y
AMP

Estimulación de la expresión de mRNA péptidos
Aumento de la expresión génica de enzimas de síntesis
antimicrobianos: 48 horas Invest exposiciónantimicrobial defense in humans by
Grether-Beck S et al. Ureaβ-defensina-2 (72-96 horas) > catelicidinas
uptake enhances barrier function and
lipídica a las expression. J de Dermatol 2012; 132: 1561-72 exógena
regulating epidermal gene a urea

Inmunofluorescencia

Aumento de expresión de proteínas involucradas en la
diferenciación epidérmica, contenido lipídico, y péptidos
antimicrobianos, luego de aplicación urea 10%

Proteínas encargadas de diferenciación epidérmica son
inhibidas totalmente por phloretina y thiourea, y
parcialmente por HgCl2 y CuSO4

Western Blot, transporte de urea por Phloretina o HgCl2

Involucrinas eran significativamente inhibidas por HgCl2, en
comparación con phloretina (no significativo)
regulatingFilagrinas expression. J Invest Dermatol 2012; 132:2 y phloretina
epidermal gene eran inhibidas por HgCl 1561-72

Modelo murino

Urea al 10 y 20% mejora la función barrera y expresión de
AMP en modelo DA

 Queratinocitos humanos obtienen urea a través de:
UT-A1, UT-A2, y AQPs

 Absorción de urea es seguida por eventos genéticos regulando
función barrera y defensa antimicrobiana
Genes de diferenciación de queratinocitos, síntesis de
lípidos, y producción de AMP

 Sobreregulación de algunos genes es observada a las 48-72
horas de exposición urea, lo cual podría deberse a acidificación
de dominios extracelulares del estrato córneo

 Acidificación activa enzimas pH sensibles, y facilita descamación
en capas exteriores del estrato córneo


 Urea previene el desarrollo anormal de función barrera y revierte la
baja expresión de AMP en modelo murino de Dermatitis atópica

 Al producir estimulación de expresión de AMP, efectos beneficiosos en
enfermedades infecciosas (onicomicosis) o con alteración de la
permeabilidad cutánea (dermatitis atópica)

 En lesiones agudas y crónicas de Dermatitis Atópica con disminución
de PAM, mayor susceptibilidad a infecciones por S. Aureus y
patógenos virales


 UVB recientemente se ha demostrado induce expresión de β-
defensina-2 y el precursor de LL-37, hCAP18 en humanos in vivo.

 Este estudio demuestra, urea es inductor o estimulador potente de
barrera antimicrobiana

 Urea causa aumento expresión mRNA de involucrinas, loricrinas, así
como síntesis de lípidos (ceramidas), disminuidas en piel afectada y
no afectada en dermatitis atópica

 Filagrinas son proteínas más expresadas luego de exposición a urea


 Urea exógena estimula la expresión de
transportadores de urea y AQPs

 Transcripción de genes involucrados en la
diferenciación queratinocítica, síntesis de lípidos
epidérmicos y producción de AMP

 Mejora la función barrera y la defensa
antimicrobiana

 Aplicaciones terapéuticas potenciales


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