VPH genómica y proteómica

1. VPH: Genómica, proteómica y diagnóstico Erwin Chiquete Biología Molecular en Medicina Biología Molecular en Medicina • O.P.D. Hospital Civil de Guadalajara • C.U.C.S.

3. Importancia En el mundo, hasta el 60 % de los adultos puede presentar alguna de las formas de infección por VPH . La infección por VPH es subclínica en la mayoría de los casos.

4. En E.U.A. el 75 % de las mujeres tiene infección genital por VPH. El VPH está asociado a más del 95% de los casos de CACU en el mundo. Importancia

5. El VPH pertenece a la familia de los papovarirus , del género papilomavirus . Los papilomavirus infectan a una gran variedad de especies de mamíferos incluyendo al hombre. El virus

6. El virus Origina distintas enfermedades en el humano, dependiendo del tipo de VPH, del tejido y del sistema inmune del hospedero.

7. El virus El VPH se clasifica en genotipos , o simplemente tipos, según la secuencia de su material genético. A la fecha se han descrito más de 100 genotipos , de los cuáles menos de la mitad son muy prevalentes.

8. El virus VPH Piel Mucosas Alto riesgo Bajo riesgo

9. El virus Alto riesgo : 16 , 18 , 31 , 33 , 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Bajo riesgo : 6, 11, 42, 43 y 44.

10. El virus 6, 11 Verrugas laríngeas 16, 18, 31, 33, 35 Carcinoma cervical 5, 8 Epidermodisplasia verruciforme 6, 11, 16, 18, 31 Verrugas genitales 1, 2 , 4, 10 Verrugas cutáneas Genotipos más relacionados Enfermedad

11. Genómica y Proteómica

13. El genoma del VPH Su genoma es DNA de doble cadena y circular con casi 8 000 nucleótidos . Codifica para 8 proteínas. Este DNA se hace lineal y se puede integrar al genoma humano.

14. El proteoma del VHC E6 E7 E1 L2 L1 E5 E2 E4 ORF 3 2 1 2 000 4 000 6 000 nt

15. El genoma del VPH Replicación Proteínas transformantes Replicación y transcripción Proteína secundaria de la cápside Proteína principal de la cápside Región reguladora

16. El ciclo de vida del VPH El VPH es epiteliotrópico por naturaleza y su ciclo de vida está íntimamente relacionado a la diferenciación de las células escamosas. Su receptor en la célula hospedera es la proteína de adhesión llamada  -Integrina 6 .

17. Erwin El ciclo de vida del VPH 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ NH 2 COOH

18. El ciclo de vida del VPH El VPH infecta a las capas celulares basales del epitelio escamoso, no a las superficiales. Una vez que infecta a la célula hospedera, el VPH permanece con muy poca actividad, hasta llegar a las capas superficiales del epitelio (por proliferación celular), donde comienza su replicación activa.

20. Una segunda forma de infección (llamada no-permisiva ) se refiere a aquella en la que la replicación viral no ocurre. El DNA viral persiste así en forma latente como un elemento extracromosómico (episomal) o bien se integra al azar en el genoma humano (los cromosomas). El ciclo de vida del VPH

21. Es esta forma de infección la que origina el fenómeno de iniciación en la transformación neoplásica, debido a que el genoma del VPH se “rompe” en los sitios que corresponden al gen E2 y a veces E1. El ciclo de vida del VPH

22. Cuando se rompe el gen E2 se pierde su función . Por desgracia, una función de la proteína E2 es la de reprimir a E6 y E7 , que son las proteínas que originan la transformación neoplásica. El ciclo de vida del VPH

23. VPH y neoplasia

24. VPH y neoplasia En 1976, Harald zur Hausen propuso que ciertos papilomavirus podrían estar implicados en el origen del cáncer cérvico-uterino.

25. VPH y neoplasia Actualmente se sabe que el VPH está implicado en más del 95% de los casos de CaCU. Su implicación es menor en los casos menos graves (NIC I a III).

29. VPH y neoplasia Ciclo celular normal

30. VPH y neoplasia Ciclo celular normal INICIO G 1 G 2 S M S G 1 G 2 M Cinasa (Cdk) Ciclina G 1 Ciclinas G 1 Cinasa (Cdk) Ciclina M Ciclinas mitóticas

31. VPH y neoplasia Ciclo celular normal

32. VPH y neoplasia Ciclo celular normal Existen puntos de verificación o “ check points ” que son momentos en los que la célula tiene la oportunidad de detener su avance continuo, si es que no se llenan ciertas condiciones.

33. VPH y neoplasia Ciclo celular normal Si la célula no puede reparar el daño al DNA entonces “se suicida”, es decir, se desencadena la maquinaria enzimática que la lleva a apoptosis .

34. VPH y neoplasia Ciclo celular normal El VPH expresa las oncoproteínas llamadas E6 y E7 que estimulan la progresión en el ciclo celular e inhiben su detención, de esta manera inmortalizan a las células huéspedes, estableciendo una alta probabilidad de generar una neoplasia.

35. VPH y neoplasia degradación Erwin 5’ 3’ 5’ 3’ E6 E7 p53 E6 pRB E7

37. VPH y neoplasia Infección por VPH Persistencia del DNA viral Integración al genoma humano y alteración de la proliferación celular Mutaciones en genes celulares Nuevas mutaciones Infección subclínica NIC I NIC II NIC III Ca invasor

38. VPH y neoplasia Sólo el 10% de los casos de infección genital por VPH progresan hasta el CaCU. Toma 10 a 20 años para que la lesión NIC I progrese hasta CaCU con fenotipo invasor. Lo anterior sugiere que el VPH no es el único factor en el desarrollo del cáncer.

39. VPH y neoplasia El VPH parece ser un factor necesario, mas no suficiente para que se desarrolle el CaCU. Otros factores ambientales y propios del hospedero son también necesarios.

42. Diagnóstico

45. Diagnóstico 3. Detección del ADN del VPH (técnica directa).

46. Diagnóstico No existe un método de cultivo del VPH eficiente, debido al alto tropismo específico del virus por células escamosas. Por lo tanto, el cultivo del VPH no es una herramienta útil para diagnóstico (aunque sí para investigación).

52. Diagnóstico Captura de híbridos El método de captura de híbridos detecta la presencia de VPH de bajo o alto riesgo, sin hacer distinción de genotipos. Su sensibilidad ha sido cuestionada, pero en algunos países goza de gran auge.

53. Diagnóstico PCR El método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es el más sensible y específico y permite cuantificar el ADN VPH (carga viral). No obstante exige cuidados técnicos especiales.

54. Diagnóstico 50 µl 50 µl Toma de muestra Extracción de DNA DNA molde PCR Taq pol 1U dNTPs 75  M Amortiguador 1x C12Mg 1.5 mM Indicadores DS7 y DS8 PCR “Nested” DNA molde Taq pol 1U dNTPs 75  M Amortiguador 1x C12Mg 1.5 mM Indicadores M1 y M2 Electroforesis 1 Hold 3 Tmp 40 Ciclos 2 Holds 94.0 96.0 60.0 72.0 72.0 0.30 0.30 0.30 5.00 7.00 4.0 C Minutos PCR

55. Diagnóstico Hibridación in situ El método de hibridación in situ detecta al ADN VPH incluido en las células, por lo que da una apreciación “más real” de los eventos patológicos. Es cara y técnicamente demandante.

56. Diagnóstico Hibridación in situ Positiva Negativa

57. Diagnóstico Hibridación in situ Positiva Negativa

59. Diagnóstico La determinación del ADN del VPH tiene sensibilidad que supera en un 10% a 20% a la colpocitología (pero con menos especificidad). Debido al alto valor predictivo negativo de combinar colpocitología y ADN VPH, si una mujer es negativa a ambos puede requerir de una nueva revisión cada 2 – 3 años .

62. Gracias