1. Universidade Federal do Pará
Mestrado em Genética e Biologia Molecular
Karina Melo
Talita Fernanda
Belém-PA
2012
2. RNA seq
Uma abordagem desenvolvida para
transcriptoma usando tecnologias de
sequenciamento “next generation”
Permite
Determinar a
Medição dos níveis
estrutura funcional
de transcritos
dos genes
3. RNA seq
O termo RNA-seq tem sido usado para representar
o transciptoma revelado por sequenciamento de
cDNA por NGS (sequenciadorres de segunda
geração);
Permite a quantificação dos níveis de expressão
gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis
mais baixos de expressão devido a sua alta
sensibilidade;
Útil para descobrir novas transcrições, identificação
de mutaçoes, indels, splicing alternativos;
4. RNA seq
Metodologia
Fonte: Snyder et al, 2009.
5. RNA seq
Sequenciamento:
Ilumina IG.
Applied Biosystems SOLiD.
Roche 454 Life Science systems
Biosystems HeliScope™ Single Molecule
Sequencer.
Pacific Biosystems PACBIO RS.
6. Tabela 1: Principais características técnicas das plataformas
454 GS-FLX, ILLUMINA E SOLID
Fonte: Adaptado de: Metzker 2010; Carvalho & Silva 2010.
7. RNA seq
Após o sequenciamento os resultados
são alinhados num genoma de referência
ou montados de novo.
Genoma de referência
“Ab initio”
Montados de novo
8. Preferencialmente o método “Ab initio”;
Quando não se possui genoma de referência pode ser
utilizado na montagem o genoma de um organismo
filogenéticamente próximo;
Combinando as duas estratégias: mesmo que se possua o
genoma de referência, é recomendado alinhar novamente
usando o alinhamento gerado “de novo”;
Método “de novo” é mais efetivo quando utilizado em
genomas de procariontes; pois esta abordagem está mais
suscetível a erros de sequenciamento, gera transcritos mais
fragmentados, além de um volume de dados computacionais
muito maior.
9. Análise dos dados após
o Sequenciamento:
Quantificação do nível de
expressão gênica
Fonte: Marthin & Whang 2011
11. RNA seq
Vantagens.
- Permite detectar transcritos mesmo sem a presença de um
genoma de referência;
- Pode detectar variações nas sequencias genômicas;
- Possuem pouco ruído de fundo, podendo ser mapeado sem
ambiguidade em regiões distintas do genoma;
- Requer uma quantidade muito menor de amostras de RNA;
- Já revelou várias regiões de transcrição e isoformas de
splicing novas de genes conhecidos;
- Capaz de rastrear com acurácia as mudanças na expressão
gênica durante diferentes estágios da diferenciação de
células e do desenvolvimento de alguns organismos.
13. RNA seq
Desvantagens.
- Moléculas de RNA necessitam ser fragmentadas para que possam se
adequar às tecnologias de sequenciamento de nova geração,
podendo em cada processo de fragmentação influenciar no resultado
produzido;
- Por usar sequenciamento de larga escala, enfrenta desafios durante o
armazenamento, recuperação e processamento das grandes
quantidades de dados gerados;
- Permite maior cobertura e por isso requer mais sequenciamento que,
por sua vez, aumenta o custo;
- Para sua validação é exigido o uso de triplicatas para cada
experimento;
- Sujeito a erros de sequenciamento devido ao grande volume de
dados gerados, sendo necessário dedicar maior tempo na análise
pós-montagem para resolvê-los
14. Perspectivas RNA seq
Embora o RNA-seq ainda seja um método pouco utilizado
devido a seu recente desenvolvimento, ele possui muitas
vantagens em relação a outros métodos, como o
microarray podendo vir a substitui-lo;
Os próximos desafios a esta metodologia é ser
amplamente utilizada em genomas mais complexos para
identificar níveis de expressão de transcritos raros;
O uso de novas tecnologias (sequenciamento pair-end e
strand specif) podem vir a facilitar esta meta permitindo
uma maior cobertura genômica com o uso de sequencias
longas (reads);
15. RNA seq
Ampla utilização em mais organismos, como plantas
poliplóides, comunidades de microorganismos
(metatranscriptômica);
Avanços nos sistemas computacionais e nos próprios
computadores, permitindo um maior rapidez na análise
dos dados;
Futuro da “montagem” transcriptômica: “Não será
necessário montar” (Martin & Wang 2009).
16. RNA seq
Aplicações no estudo de doenças genéticas.
17. RNA seq
Aplicações no estudo de doenças genéticas.
- Detecta alterações na molécula de RNA em células
cancerosas;
- Permite identificar níveis de expressão e de novos
transcritos;
- Identifica mecanismos de splicing alternativo e
fusões gênicas;
- Detecta mutações, entre elas rearranjos
cromossômicos, que levam a transcritos quiméricos;