Gene expression and regulation

1. Експресія генів та
її регуляція
Старший науковий співробітник,
к.б.н. Древицька Т.І.

2. План теми:
Частина 1
1.Основні етапи експресії генів у еукаріот.
2.Фактори, необхідні для транскрипції:
- Полімераза та інші ферменти транскрипції
- Транскрипційні фактори, базальні та специфічні, їх класифікація та загальна
будова
- Кофактори транскрипції
- Фактори ремоделювання хроматину
- Фактори ініціації, елонгації та термінації транскрипції
- Регуляторні послідовності в геномі
- Промотор і його структура у еукаріот
2.Преініціація, ініціація, елонгація, термінація транскрипції. Механізми.
3.Процесинг РНК: кепування, сплайсинг, поліаденілювання. Механізми.
4.Експорт мРНК в цитоплазму.
Частина 2
5.Транспорт, зберігання і руйнування мРНК.
6. Регуляція експресії генів – етапи, загальні принципи.
7. Система мікроРНК, принципи їх роботи.
8. Система довгих некодующих РНК, принципи їх роботи.
9. Редагування РНК

3. Центральна догма молекулярної біології –
канонічний напрямок

4. Головні терміни
•transcription – the process of making RNA from a DNA template by RNA polymerase
•factor – a substance, such as a protein, that contributes to the cause of a specific
biochemical reaction or bodily process
•transcriptional regulation – controlling the rate of gene transcription for example by
helping or hindering RNA polymerase binding to DNA
•upregulation, transduction, activation, or promotion – increase the rate of
gene transcription
•downregulation, repression, or suppression – decrease the rate of gene
transcription
•coactivator – a protein that works with transcription factors to increase the rate of
gene transcription
•corepressor – a protein that works with transcription factors to decrease the rate of
gene transcription

5. Транскрипцію можна побачити! )))

6. Класификація генів, у відповідності до типу
їх експресії
Конститутивні ( house keeping) гени:
1 - Експресуються на фіксованому рівні, незалежно від стану клітин.
2 - Cтруктура гену проста, регуляторних послідовностей немає або мінімум.
(Гени рРНК 16S, 23S, 5S, 4.5S, гени рибосомальних белків (rpl, rps), гени тРНК
(trn) тощо.
Гени, які регулюються:
1- Експресуються тільки тоді, коли потрібно. Експресія може знижуватися
або підвищуватися, базальний рівнь може бути відсутній.
2- Структура гена складна, точок контролю та регуляції багато.

7. В разних тканинах один і то сами ген може по-разному
експресуватися?

8. Хто забеспечує експресію потрібного в даний
момент гена?
- транскрипційний фактор (точніше, комплекс)
- ферменти (РНК-полімераза)
- помічники (або кофактори транскрипції)
- послідовність ДНК (промотор та регуляторні
послідовності)

9. Схема типового транскрипціного фактору:
основні домени
DNA-binding domain (DBD), - домен, который
узнает и взаимодействует со специфической
последовательностью ДНК (енхансером или
промотором) Такую последовательность
называют элементом ответа (response elements).
Trans-activating domain (TAD), который содержит
сайты для связывания с другими белками
(кофакторами транскрипции). Такое связывание
приводит к активации фактора транскрипции.
An optional signal sensing domain (SSD) (например,
лиганд связывающий домен), который
воспринимает внутренние или внешние сигналы,
это может привести к усилению или ослаблению
уровня экспрессии)
NTD – nuclear tranclocaited domain

11. HIF

12. Классификация транскрипционных факторов в
Функционально:
- конститутивно активные во всех тканях и всегда: general transcription factors (TFIIA, TFIIB, TFIID,
TFIIE, TFIIF, TFIIH), Sp1, NF1, CCAAT.
- регулируемые :
A. developmental (cell specific) – expression is tightly controlled, but, once expressed, require no additional
activation – GATA, HNF, PIT-1, MyoD, Myf5, Hox, Winged Helix
B. signal-dependent – requires external signal for activation
- extracellular ligand (endocrine or paracrine)-dependent – nuclear receptors
- intracellular ligand (autocrine)-dependent - activated by small intracellular molecules – SREBP, p53,
orphan nuclear receptors
- cell membrane receptor-dependent – second messenger signaling cascades resulting in the
phosphorylation of the transcription factor
- resident nuclear factors – reside in the nucleus regardless of activation state – CREB, AP-1, Mef2
- latent cytoplasmic factors – inactive form reside in the cytoplasm, but, when activated, are translocated into
the nucleus – STAT, R-SMAD, NF-κB, Notch, TUBBY, NFAT
Структурно:
в зависимости от строения ДНК связывающего мотива.

13. Разные структурные организации транскрипционных факторов

15. Типи ДНК-залежних
РНК- полімераз
υ РНК-полімераза І працює на кластерах генів рибосомної РНК та здійснює
синтез рРНК 18S, 28S и 5,8S.
υ РНК-полімераза II транскрибує белкові гени, а також гени маленьких
ядерних РНК та інших РНК, які не транслюються.
υ РНК-полімераза ІІІ здійснює синтез тРНК, рибосомної РНК 5S та деяких
других низькомолекулярних РНК.
Кожна з них використовує свої специфічні промотори

16. РНК-полімераза ІІ зкладається з 12
субодиниць

17. РНК-полімераза ІІ в зібраному стані

18. Кофактори транскрипції
¬ позитивно регулють транскрипцію
¬ не мають ДНК-звязуючих доменів
- комплекси, які ремоделюють хроматин,
- гістонацетилази та деацетилази
- кінази
- метилази

20. Промотор Ділянка ДНК, розташована, як правило, до
зчитуваної послідовності (upstream).
Є кілька типів промоторів в людському геномі,
різних за структурою та послідовностями, які
упізнаються

21. Типові сайти для РНК-
полімерази ІІ

22. Види регуляторних послідовностей у геномі

23. Энханхансеры
Енхансери - це послідовності ДНК довжиною від 50 до 150 пар основ.
Підсилюють активність промоторів по збірці транскрипційного комплексу.
Розташовані дуже віддалено, наближаються тільки за рахунок
просторової орієнтації нитки ДНК (хромосомні території !!!)

24. І так, початок та його події…
• Отримання регуляторного сигналу (трансдукція);
• Активація транскрипційного фактора, його збірка і взаємодія з коактиваторами
і компаньйонами;
• Транспорт в ядро;
• Пошук регуляторної послідовності, її впізнавання і зв'язування з нею;
• Залучення (рекрутінг) транскрипційної машинерії в ядрі;
• Пре-і ініціація транскрипції

25. Активація транскрипційного фактору
(зовнішня та внутрішня трансдукція)

26. Транспорт у ядро
Nuclear pore complex 125
mega Dalton!!! 30 белков
υІмпортини
υКаріоферіни
υПереносники – білки Ran
(маленькі GTPase)

27. Ran-цикл
Імпортин зв'язується з мишенню у
цитоплазмі,
взаємодіє з білками пори та з Ran-
GTP,
конформаційні зміни імпортину та
від'єднання від мішені за допомогою
Rаn- зв'язуючого білку (RanBP)
¬активується GTPase домен
¬здійснюється гідроліз GTP до GDP
та від'єднання Run-GDP.

28. Пре-іниціація
Для инициации транскрипции необходимо сборка на промоторе
преинициаторного комплекса (PIC -Pre-Initiation Complex) с участием 12
субъединичной РНК-полимеразы II и шести базальных факторов транскрипции
TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH.
Последовательность сборки может быть любая.

30. Приклад збірки

32. Инициация

33. Базальный фактор транскрипции
TFIIH
Обладает хеликазной и киназной
активностью. Обычно рекрутируется
последним.
- расплетает двухцепочечную
молекулу ДНК (образует
транскрипционный пузырек размером
12-14 н.о)
- обеспечивает за переход фазы
инициации транскрипции в фазу
элонгации путем фосфорилирования С-
концевого домена РНК-полимеразы.

34. Транскрипционный пузырек

35. Протеїни задіяні у елонгації
P-TEFb
Positive transcription elongation factor b
Cyclin-dependent kinase
Phosphorylates CTD of large subunit, Pol II
eukaryotic TFIIS
may overcome pausing by the polymerase
induce cleavage of the new transcript, followed by release of the 3’ terminal RNA
fragment.
human DSIF
Regulated elongation (negative and positive), direct contact with polymerase and
nascent transcript
ELL: increase elongation rate of RNA Pol II
CSB: Cockayne syndrome B protein, incr. elongation rate

36. Этапы элонгационного цикла
- отбор нуклеотида и связывание с активным центром
- образование фосфодиэфирной связи
- транслокация в сторону канала выхода
- проверка на наличие ошибок (первый пункт контроля!!)
скорость 40 н/с
Точность 10-6

37. Терминация
Типичный сигнал терминации
транскрипции у прокариот –
инвертированный повтор,
полиндром.
Наличие которого тормозит
транскрипционный комплекс и
инициирует его диссоциацию.
Это приводит к высвобождению
пре-мРНК

39. Еукариоты
терминаторы!
Связываясь с
последовательностями
терминаторов, TTF-I изгибает
молекулу ДНК и вызывает
задержку элонгирующего
транскрипционного комплекса на
терминаторе. Предполагается,
что в этот момент происходит
конформационное изменение
молекулы Pol I, что ослабляет
взаимодействие компонентов
комплекса друг с другом.

40. И так, получен первичный транскрипт

41. Процессинг РНК(пре-мРНК→ мРНК)
1.Кепирование: модификация 5'-конца с образованием так называемой шапочки - Кэпа
(cap).
1.Сплайсинг (splicing): вырезания интронов и сшивания экзонов.
1.Полиаденилирование: присоединение к 3'-концу последовательности polyА,
тесно связано с терминацией транскрипции.
!!! Все этапы процессинга происходят во время транскрипции на РНК-полимеразном
комплексе, то есть процессинг является неотъемлемой частью транскрипции.
Местом сбора машинерии процессинга служит С-концевой домен (CTD) РНК-
полимеразы II, который находится рядом с каналом выхода из комплекса РНК

42. КэпированиеИзначально в составе пре-мРНК к 5’-атому
рибозы первого нуклеозидтрифосфата
присоединено 3 фосфорных остатка
Этапы:
- отщепление одного фосфата с 5'-конца,
осуществляемой фосфатазой
- перенос гуанозинмонофосфата (GMP) с
гуанозинтрифосфата (GTP) на два
фосфатные остатки, оставшиеся на
5'-конце (фермент гуанидилтрансфераза)
Формируется не фосфодиэфирная связь, а
нетипичная ковалентная!!! между 5'-фосфатом
GMP и 5'-концевым β-фосфатом пре-мРНК,
- метилирование метилтрансферазой
конечного G с образованием 7-
метилгуанина (7mG).

43. Сплайсинг
Сплайсинг –это реакция трансэтерификации
(замены одной фосфодиэфирной связи на другую),
проходит в два этапа:
- ОН-группа Аденинового нуклеотида в точке
ветвления имеет повышенную реакционную
способность и осуществляет нуклеофильную
атаку на фосфат в 5'-сплайс сайте.
Связь между этим фосфатом и 3'-концевым
нуклеотидом экзона заменяется на связь между
фосфатом и 2'-ОН группой аденинового
нуклеотида.
В 5'-концевой части интрона образуется так
называемое лассо. ОН-группа, оставшаяся на 3'-
конце первого экзона атакует фосфодиэфирной
связь в 3'-сплайс-сайте.
Эта связь разрывается, заменяясь на связь
между двумя экзонами.

44. Сплайсосома
Комплекс, состоящий из пяти малых ядерных РНК
(длинной 100-200 нуклеотидов):
U1, U2, U4, U5 та U6 и ряда белков
Функции:
- расплетение вторичных структур пре-мРНК;
- стабилизация комплекса;
- регуляция сплайсинга, особенно
альтернативного.
- второй пункт контроля!!!!

45. Полиаденилирование
Консенсус AAUAAA распознается белком
CPSF (Cleavage-Polyadenylation Specificity
Factor
~ 20 нуклеотидах ниже его U- или
G / U-обогащенная узнается фактором
разрезания
РНК СstF (Cleavage stimulation Factor)
Присоениняется polyA-полимераза (РАР),
еще два фактора разрезания (Сleavage
Factors)
CF 1 и 2
Сборка комплекса стимулируется
связанным с кэпом СВС, а также
сплайсосомой на последнем интроне. РАР
присоединяет 100-200 адениновых
нуклеотидов. С polyA-хвостом связывается
специфический белок РАВР (PolyA Binding
Protein).

46. Наконец!!! Зрелая мРНК!

47. Экспорт из ядра
Неправильно транслированная или процессированная
молекула мРНК не свяжется с экспортинами и не будет
транслоцирована в цитаплазму.
Третий пункт контроля!!!
NXF1 - nuclear RNA export factor 1
TREX - transcription export complexes
CBC - cap-binding complex
eIF4E, eukaryotic translation initiation factor 4E
EJC - exon–junction complex
InsP6 - inositol hexakisphosphate
PABP - poly(A)-binding protein
DBP5 – ATP-dependent RNA helicase
GLE1 - nucleoporin

48. Регуляция экспрессии генов у эукариот
происходит на уровне:
υ
υ
υ
генома
транскрипции
трансляции

49. υ Гетерохроматин
являетсянаиболее плотно упакованной
формой ДНК? Он не
транскрибируется, уровень
гетерохроматинизации
отличаетсяот клетки к
клетке.
υ Метилирование связано с
образованием гетерохроматина.
υ В большинстве
случаетметилируются
регуляторныеучастки – промоторы.
υ Транскрипционно активным генам
соответствуют участки с
низкимуровнем метилирования.
Метилирование ДНК

50. •Ацетилирование с помощью
гистонацетилтрансфераз (HATs)
и формировние эухроматина
•Деацетилирование
гистонов (HDACs) и
образование
гетерохроматина
Ацетилирование гистонов

51. Ремоделирование хроматина

52. Контроль на уровне ДНК –
реаранжировка генов
Транслокация гена (а может и целого
фрагмента хромосомы) из одного места в
геноме в другое – образование антител в В-
клетках, антигенные вариации у трапаносом,
транспозоны и тд.

53. Контроль на уровне сплайсинга РНК
(альтернативный сплайсинг)

54. Редактирование прекурсорной РНК

55. Всем правильных
и уместных
точек контроля)