2. The Nature of Nucleic Acids
Two Types of Nucleic Acids: DNA and RNA
Nucleotide = Base + Sugar + Phosphate
Nucleosides = Sugar + Base (no phosphate)
Structural Difference DNA-RNA - Ribose in RNA, Deoxyribose in DNA
Phosphodiester links between nucleotides
Purine bases - Adenine (A) and Guanine (G)
Pyrimidine Bases - Cytosine (C), Thymine (T), Uracil (U)
Same bases in RNA and DNA except T only in DNA, U in RNA
Properties of the Nucleotides
Ionization
Tautomerization
UV Spectra
Stability and Formation of the Phosphodiester Linkage
Dehydration - unfavorable thermodynamics
Energy of triphosphate hydrolysis coupled to synthesis
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 2
3. ACIDI NUCLEICI
Sono presenti nella cellula in forma di nucleo-
proteine, ossia l’acido nucleico (DNA o RNA)
risulta legato con legame ionico ad una
proteina basica (istone o protamina)
Le proteine che legano gli AN mancano di
alcuni aa specifici come Cys, Met, Trp, Tyr;
inoltre hanno pI molto alto (8-12) e PM
piuttosto basso (6000-40000 daltons)
Variando pH o concentrazione salina si
possono separare AN e proteine
3
4. Costituenti degli Acidi Nucleici
Gli acidi nucleici possono essere sottoposti a
IDROLISI ALCALINA mediante NH3 molto diluita a
temperatura non > a 115°C.
Si ottengono così i costituenti fondamentali dell’AN: i
nucleotidi
I nucleotidi contengono H, O, N, C, P e possono
essere ulteriormente idrolizzati con NH3 a 160°C.
Si liberano nucleosidi e H3PO4
L’idrolisi acida del nucleoside ci fornisce, infine, una
base azotata e un monosaccaride
4
5. Costituenti degli Acidi Nucleici
[ base-ms- P ]n- [ base-ms- P ]n
nucleoside
nucleotide
5
ACIDO NUCLEICO
6. Costituenti degli Acidi Nucleici
Riassumendo:
Proteine: ISTONI O PROTAMINE
Acido nucleico: DNA o RNA
Monosaccaride: RIBOSIO o DESOSSIRIBOSIO
Base azotata:
ADENINA (A)
TIMINA (T)
GUANINA (G)
CITOSINA (C)
URACILE (U)
IPOXANTINA (I)
XANTINA (X)
PSEUDOURIDINA ()
6
9. Costituenti dei nucleotidi. Monosaccaridi:
RIBOSIO e DESOSSIRIBOSIO
I gruppi fosforilici
servono da ponte tra il 3’
di un monosaccaride ed
il 5’ del monosaccaride
adiacente
9
10. STUTTURA ANELLO PIRIMIDINICO
E PURINICO
10
Sono strutture eterocicliche, variamente sostituite, che
possono trovarsi in differenti forme di risonanza. Sia le
struttura monomeriche che l’intero polimero risentono
dell’effetto risonanza.
14. Uracile: 2,4 diidrossi pirimidina
14
Lattimica Semilattamica Lattamica
•Si trova sempre associato a ribosio o porzioni alterate di
DNA.
• Presenta tre forme di risonanza
15. Timina: 2,4 diidrossi 5 metil
pirimidina (o 5 metil uracile)
15
Lattimica Semilattamica Lattamica
•E’ presente nel DNA ma talvolta può essere associata a
ribosio nel tRNA
• Presenta tre forme di risonanza (come per l’uracile)
CH3 CH3 CH3
Lattimica Semilattamica Lattamica
16. Citosina: 2 idrossi 4 amino pirimidina
16
Lattimica Semilattamica Lattamica
•E’ presente sia nel DNA che nell’RNA
HO
HO
H
H
17. Citosina: derivati metilati o
idrossimetilati in 5
17
•Questi due derivati sono meno diffusi negli AN
HO
CH3
HO
CH2OH
5 METIL CITOSINA 5 IDROSSIMETIL CITOSINA
1
2
4
1
5
6
3
18. Citosina: derivati metilati
18
•Eventuali metilazioni in 3 e 4 riducono la possibilità di risonanza
rendendo la struttura più rigida
•Talvolta si osservano queste modificazioni come modifiche post-
trascrizionali
•Conseguenze:
•Minor plasticità da risonanza
•Impossibilità a dare legami a H con modificazione della struttura
2aria e 3aria dell’AN che diventa resistente agli enzimi idrolitici
cellulari
HO
1
2
4
5
6
3
CH3
CH3
HO
H3C
21. Caratteristiche delle basi
puriniche
21
•IPOXANTINA e ADENINA, avendo un solo gruppo sostituente
hanno solo due forme di risonanza, lattimica e semilattamica
•XANTINA e GUANINA hanno tutte e tre le forme di risonanza
•ADENINA e GUANINA: frequenti in DNA e RNA
•XANTINA e IPOXANTINA: rare, sono intermedi della biosintesi di A
e G. Se compaiono in piccolissime quantità negli AN fanno variare
la struttura 2aria e 3aria per la differente distribuzione dei ponti H.
22. Derivati delle purine
22
•Tutte le purine possono essere metilate:
•6-N-dimetil adenina
•1 metil adenina
•3 metil adenina
•7 metil adenina
•6-N-isopentenil adenina
•1 o 3 alchil guanina
•Dimetil amino guanina
•Metil o alchil xantine
•Metil o alchil ipoxantine
•Anche in questo caso le metilazioni limitano le forme di risonanza e il
numero di legami a H ma l’AN diventa più resistente agli enzimi
degradativi.
1
2
3
4
5
6 7
8
9
- CH2-CH=C-CH3
CH3
25. 25
HO
H
HO
H
+
+
Il legame 1’-1 ha caratteristiche differenti nelle varie forme di risonanza
•L’azoto della pirimidina
(N1) è presente sotto
forma di azoto
quaternario, con carica
netta N+
•L’ N1 non ha carica
positiva: non ci sono
interazioni particolari
relative all’ N+ ma il
comportamento sarà
differente dalle forme
indicate in alto
31. Acidi nucleici
31
•Struttura 1aria: sequenza nucleotidi
mRNA
semplice DNA virale
•Struttura 2aria: elica
doppia DNA cromosoma
RNA virale
•Struttura 3aria: DNA superavvolto plasmidico
RNA transfer
ribosomiale
•Struttura 4aria: ribosomi
32. Acidi nucleici
32
•Sono definiti dalla sequenza di nucleotidi
•Si possono evidenziare i terminali trattando con
MONOFOSFOESTERASI che allontanano il fosforile
lasciando gli –OH liberi
•Per determinare la sequenza di basi è necessario un frazionamento
preliminare per avere dal polinucleotide degli oligonucleotidi (ribonucleasi
pancreatiche o da Aspergillus orizae). I frammenti vengono identificati per
mobilità cromatografica. Utilizzato per tRNA di lievito (processo lungo e
poco applicabile al DNA )
38. Tautomerization of the bases:
Tautomers = structural isomers with different
location of H-atoms and double bonds
Ultraviolet spectra of ribonucleotides
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 38
39. Phosphodiester Bonds
Adjacent monomer units in nucleic acids are connected via phosphate groups attached
to the hydroxyl on the 5' carbon of one unit and the 3' hydroxyl of the next one. This
linkage is called a phosphodiester bond,
1. Phosphodiester bonds in nucleic acids are very stable to hydrolysis in the absence of
a catalyst (such as an acid or a nuclease).
2. Synthesis of a phosphodiester bond in nucleic acids requires energy input. As a
result, the nucleoside monophosphates in nucleic acids are built up from hydrolysis of
nucleoside triphosphates. Cleaving a pyrophosphate from a nucleoside triphosphate
yields a nucleoside monophosphate and enough free energy to make the formation of
polynucleoside monophosphates (i.e., polynucleotides) thermodynamically favorable.
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 39
40. Stability and Formation of the
Phosphodiester Linkage
Dehydration - unfavorable
thermodynamics
Energy of triphosphate
hydrolysis coupled
to synthesis
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 40
41. Primary, Secondary, and Tertiary
Structure of Nucleic Acids
1. The primary structure is the sequence of nucleoside
monophosphates (usually written as the sequence of bases they
contain).
2. The secondary structure refers to the shape a nucleic acid
assumes as a result of the primary structure. B-DNA, A-DNA, and Z-
DNA are forms of secondary structure. B-DNA is the form that
predominates in the aqueous environment of the cell.
3. Tertiary structure refers to large-scale folding in a linear polymer
that is at a higher order than secondary structure. The tertiary
structure is the specific three-dimensional shape into which an entire
chain is folded.
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 41
46. Struttura secondaria
46
•L’elica che si forma è più ampia dell’a-elica dei peptidi ed è piuttosto
stirata
•Un altro fattore che incide sulla struttura 2aria è il sostituente in 2’:
•RNA: l’OH da ingombro sterico ma buona polarità alla molecola
•DNA: l’H non da ingombro sterico ma conferisce idrofobicità
•Generalmente O e P sono rivolti verso il mezzo acquoso mentre le basi
sono rivolte all’interno dell’elica. Lo zucchero ha orientamento diverso in
RNA o DNA.
•Nella maggior parte degli AN a doppia elica le basi sono nella
conformazione ANTI.
•Quando in una serie ANTI si inseriscono forme SIN si ha una zona
poco organizzata che può essere sede di ripiegamenti e centro di
comparsa di struttura 3aria.
•Molti ripiegamenti promuovono una struttura GLOBULARE (rRNA)
•Pochi ripiegamenti si hanno in una struttura fibrosa
48. Struttura secondaria
48
•I ponti H possono disporsi in verticale sullo stesso
filamento o tra due filamenti diversi come nel caso degli AN
a doppia elica.
•Nel complesso lo scheletro di zuccheri e fosfati non è una
struttura rigida ma il limite dato dall’impedimento alla libera
rotazione tra C4’ e C3’ conferisce stabilità all’AN.
•Se le eliche rappresentano la struttura secondaria,
l’appaiamento di due eliche nel DNA o negli RNA diplo è
una sorta di STRUTTURA SUPERSECONDARIA.
49. Struttura secondaria
49
I legami H avvengono tra due eliche di DNA antiparallele
Le basi idrofobiche interne si appaiano sempre in modo
da avere una PURINA affacciata ad una PIRIMIDINA.
La distanza tra basi è circa 20 Å (se fosse tra pirimidine
sarebbe minore e maggiore se fosse tra purine)
A=T 2 ponti
G=C 3 ponti H
5’ 3’
5’
3’
53. Struttura secondaria
53
•Esistono DNA monoelica (virus) e DNA doppia
elica (virus, plasmidi) che possono esistere in
forma circolare in cui i 3’ e 5’ terminali si
connettono con PONTE FOSFODIESTEREO
•Lo stesso fenomeno è riscontrabile per
molecole di RNA virale (a doppia e a singola
elica)
•esistono RNA diplo nei virus ma non sono molto
diffusi perché l’ingombro sterico degli-OH è
notevole e l’elica che ne risulta è molto lassa.
•Il DNA monoelica: si avvolge su se stesso per
stabilizzarsi con le basi idrofobiche all’interno.
54. Struttura secondaria: solco
maggiore e solco minore
54
Se si osserva una molecola di DNA vediamo che l’elica
presenta 2 SOLCHI:
SCANALATURA PRINCIPALE
SCANALATURA SECONDARIA
L’ampiezza di queste scanalature varia drammaticamente
nei diversi momenti fisiologici del DNA soprattutto a riguardo
del solco principale che è:
PROFONDO nel DNA a riposo
PIATTO nel DNA subito prima della trascrizione
57. Struttura secondaria: DNA A,B e Z
57
Si sono individuate diverse forme di DNA:
A: forma cristallizzata non presente “in vivo”
B: forma “a riposo” presente “in vivo”, DNA che non
trascrive
Z: DNA subito prima della trascrizione
59. 59
La forma Z interagisce con le proteine che avviano i processi di
trascrizione (proteine di apertura) nei tratti ricchi di coppie GC.
L’effetto di queste proteine è di causare una INVERSIONE di
STEREOISOMERI della GUANINA da ANTI a SIN per
rotazione attorno al legame eteroglucosidico tra la base
purifica e il desossiribosio.
La condizione SIN fa interrompere i legami H con la citosina. Si
hanno brusche deviazioni dell’avvolgimento regolare della
spirale con allentamento della spiralizzazione. Il solco
diventa piatto, l’elica si apre e si avvia la trascrizione.
In tal modo le basi vengono esposte e possono essere
trascritte.
L’assorbanza a 260 aumenta.
63. 63
DNA A DNA B DNA Z
Passo elica 28Å 34Å 45Å
Verso elica destrorso destrorso sinistrorso
Scanalatura > stretta e profonda larga e profonda piatta
Legame glicosid. Anti anti sin
71. 71
Lo stesso effetto di despiralizzazione osservato
spontaneamente nel DNA Z lo si può ottenere
artificialmente.
Il processo va sotto il nome di DENATURAZIONE-
RINATURAZIONE del DNA.
Se si fornisce energia pari ad un multiplo intero
dell’energia necessaria a scindere un singolo legame a
H di ha l’apertura delle due catene di DNA.
Si evidenzia un aumento del 40% dell’Abs nell’UV a
260: effetto ipercromico.
72. 72
La denaturazione è un effetto cooperativo: la
destabilizzazione di una parte di molecola del DNA
destabilizza progressivamente le restanti parti.
Se l’energia viene fornita come CALORE si può determinare
la curva di fusione o T di fusione o T critica o T di
denaturazione (curva di denaturazione.
La curva di denaturazione è caratteristica di ogni tipo di DNA
e cresce con il crescere della stabilità della doppia elica.
Fattori che aumentano Tfus e stabilità:
1) la % di coppie GC che avendo 3 legami a H comportano
una interazione più forte
2) la presenza di cationi, soprattutto divalenti
3) la concentrazione di ioni, il solvente, il pH
73. 73
Il processo è reversibile se si raffredda gradatamente (anche il
riscaldamento, ad es. a 80°C, deve essere graduale): si
osserva una diminuzione di Abs a 260 nm. Se il riscaldamento
e raffreddamento sono bruschi il processo diventa irreversibile.
Finalità: creare ibridi DNA-RNA.
Altre situazioni possono danneggiare la struttura
supersecondaria del DNA e anche la struttura supersecondaria
di tRNA, oltre che alla normale struttura secondaria delle
singole eliche:
1) pH: trasforma reversibilmente la forma chetonica in
enolica, impedendo il legame di T con A (T si può legare con
G che ha l’atomo in 2 in grado di dare legami a H)
derivati alogenati di amine 3arie: si legano al DNA impedendo
l’apertura delle 2 eliche al momento della duplicazione
75. Endonucleasi di restrizione
75
•Nei batteri si sono isolate endonucleasi ancora
più specifiche, probabilmente evolutesi per
degradare materiale genetico estraneo (fagico).
•Questi enzimi detti endonucleasi di
restrizione sono stati molto utili negli ultimi anni
per sequenziare il DNA di varia origine (es. il
gene dell’ADH, genoma completo virus EB,
genoma di lievito, genoma umano pari a 2.9
miliardi di paia di basi).
77. Endonucleasi di restrizione
77
•Questi enzimi riconoscono specificamente le basi (G da
A e C da T) ma soprattutto, avendo sito attivo molto
grande, ospitano la doppia elica del DNA e riconoscono
COPPIE DI SEQUENZE tra le 2 e le 6 paia di basi con
sequenza PALINDROMICA.
•L’enzima genera un taglio ogni volta che riconosce la
sequenza specifica
•Es. CGATCG
GCTAGC
79. Determinazione della sequenza
nucleotidica
79
•E’ importante determinare la sequenza nucleotidica o
sequenza genica perché rappresenta la STRUTTURA
PRIMARIA del DNA.
•Si può anche determinare la sequenza dell’mRNA.
85. H-DNA
Strands made of one all-
purine and one all-pyrimidine
strands: these regions can
give segments of triple
helices.
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 85
86. Base pairing in DNA triple helices
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 86
87. 87
DNA SUPERAVVOLTO
Occasionalmente ci si riferisce ad
esso come struttura 3aria del DNA
E’ un DNA circolare presente in
plasmidi e virus
L’asse della doppia elica è avvolto
intorno a se stesso o come attorno ad
un cilindro (elica toroidale)
89. Supercoiling is a property of a DNA double helix in which the number of turns of the two
strands around each other either exceed or are fewer than the number of turns in the
most stable helical conformation. Only a helix that is circular or else fixed at both ends
can support supercoiling. The energy stored in circular DNAs by twisting them into
supercoils may have major effects on DNA conformation.
Topoisomerases. Bidirectional replication of the circular E. coli chromosome unwinds
about 100,000 base pairs per minute. At 10 bp per turn, this is 10,000 turns of DNA per
minute or over 160 per second. If there were nothing to relieve this stress, DNA would be
a tangled mess in seconds. Relief of torsional stress is essential for DNA replication to
occur. Topoisomerases are enzymes with a "swivel" mechanism that can relieve
torsional stress.
There are two general classes of topoisomerases, type I and type II. Type I enzymes
change the DNA linking number in units of 1, whereas type II enzymes change the linking
number in units of 2.
DNA gyrase - plays the predominant role during replicative chain elongation. DNA
gyrase both relieves stress ahead of the replication and introduces negative supercoils
into newly synthesized DNA. The gyrase A subunit is the target for binding of nalidixic
acid, an inhibitor of DNA replication. Novobiocin binds to the B subunit and inhibits ATP
cleavage.
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 89
90. Tertiary
Structure:
Relaxed and supercoiled
DNA molecules:
Mitochondrial DNA,
16500bp each.
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 90
tRNA
91. 91
INTERAZIONE DNA-PROTEINE
I DNA virali sono racchiusi da proteine capsidiche
I DNA dei procarioti sono associati a 2 frazioni istoniche
di PM rispettivamente 10000 e 20000 daltons.
Esse sono inserite nelle strutture del solco minore e
solco maggiore a dare una struttura compatta.
I DNA eucaristici hanno organizzazione a
NUCLEOSOMI:
H1: PM 21000
H2A, H2B, H3, H4: PM 11000-15000
Il DNA è avvolto intorno all’ottamero istonico dato da
2H2A+2H2B+2H3 + 2H4.
Esternamente sta H1 che protegge dalle nucleasi
96. 96
RNA
Si organizza in strutture a doppia elica solo nei virus.
Le strutture a catena singole possono essere lineari o
formare ripiegamenti per i ponti H che si formano tra basi
complementari
mRNA: è complementare alla sequenza di DNA.
Contiene pochi nucleotidi mutilati ed ha quindi vita breve
perché viene riconosciuto dalle endonucleasi
Non è legato a proteine stabilmente ma può associarsi ai
ribosomi
Tutti gli mRNA hanno l’estremo 5’ terminale che è sempre
una purina (A o G) modificata, ad es. 7 metilata
97. 97
rRNA
è sempre associato a proteine basiche di PM tra 10 e 20
kdaltons e assume forma globulare con numerosi
ripiegamenti
ha molte basi mutilate che lo rendono resistente alle
nucleari: vita lunga
Si organizza in una struttura 4aria dimerica (2 subunità,
maggiore e minore) che ha forma di “meringa”.
Nei batteri le subunità sono 30 S e 50 S
Negli eucarioti 40 S e 60 S
98. 98
Corso di Propedeutica Biochimica per Scienze Naturali AA2004-05
Nella zona di interazione tra subunità maggiore e minore
c’è il sito per l’RNA messaggero
Sulla subunità minore esistonon proteine che
rappresentano FATTORI di INIZIO e FINE della sintesi
proteica
Sulla subunità maggiore esistono proteine dette fattori di
ALLUNGAMENTO e siti che interagiscono con il tRNA
99. 99
tRNA
Ha struttura tridimensionale a trifoglio-quadrifoglio
Il braccio del codice contiene la tripletta caratteristica,
complementare alla tripletta del mRNA, e che
corrisponde a 1 aa.
Esistono numerose basi mutilate in questo tratto, infatti
sono interrotti i ponti H. nel complesso il tRNA è a vita
lunga.
102. 102
Il lobo DHU contiene un nucleotide particolare, senza in saturazioni: la
diidrouridina che ha tendenza a passare nella forma SIN interrompendo i
legami H.
Sono presenti anche basi metilate.
Il lobo TC viene anche detto della ribotimidina e pseudouridina perché
contiene:
a) timida associata a ribosio
b) pseudouracile che si lega al ribosio col C5
Contiene anche numerose basi metilate
Il braccio supplementare o LOOP ha molte basi mutilate ed una funzione
ancora non chiarita
Nel complesso questa struttura a quadrifoglio è disposta in modo tale da
essere riconoscibile da proteine esterne
103. 103
1) il loop interagisce con proteine della subunità maggiore
dei ribosomi
2) il braccio DHU interagisce con i fattori di allungamento
presenti sulla subunità maggiore, attraverso proteine di
trasporto
3) il braccio del codice interagisce con mRNA e subunità
minore
4) l’estremità 3’ si lega all’aa specifico grazie ad una C-O
ligasi:
aa + ATP = AMPaa + Ppi (aminoaciladenilato)
AMPaa=AMP + aa+
aa+ da attacco su 2’ o 3’ della base ADENINA della sequenza
ACC al 3’
110. Possible questions
1. Scrivi le formule e discuti le proprieta’ chimico-fisiche dei
nucleosidi e nucleotidi che entrano nella composizione del
DNA e dell’RNA
2. Descrivi con l’uso di formule le capacita’ delle basi
puriniche e pirimidiniche nel formare i legami idrogeno
chiave alla struttura del DNA, disegnando gli appaiamenti
3. Scrivi le formule delle forme tautomeriche delle basi
azotate, indica le posizioni influenzate dal pH e le diverse
capacita’ di formare legami idrogeno.
4. Descrivi con l’uso di schemi e formule le strutture B, A, Z
e H del DNA
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 110
111. Possible questions
1. Discuti il ruolo dell’mRNA, del rRNA e del tRNA
indicandone le funzioni e la stabilità relativa anche in
relazione alla struttura 1aria, 2aria e 3aria
2. Illustra la strategia della sintesi proteica indicando il ruolo
della subunità maggiore e minore del ribosoma
3. Disegna la struttura del tRNA indicando le regioni e la loro
funzione
4. Illustra il processo di superavvolgimento del DNA
genomico sulle strutture istoniche indicando i rapporti di
impaccamento
Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 111
