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1. MÉTODO DE BIURET
OBJETIVO:
Manejar en el laboratorio el método de Biuret para determinar proteínas
Observar y determinar experimentalmente el efecto de pH sobre las proteínas de la leche.
GENERALIDADES:
Investigación bibliográfica de los estudiantes sobre colorimetría y punto isoeléctrico de
proteínas
MATERIAL POR EQUIPO:
1 Probeta de 50 ml
2 gradillas
2 pipetas de 10 ml
3 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
Tubos de 15 x 100 – 12 piezas
1 vaso de precipitados de 100 ml
12 tubos de 16 x 15
1 balanza granataria
Papel parafilm para 10 tubos
Si es necesario, 1 embudo y papel filtro
REACTIVOS POR EQUIPO:
Aguas destilada
Solución de ácido acético 0.1 N
Solución de acetato de sodio 0.1 N
Solución de caseína (concentración 4 mg/mL)
Reactivo de Biuret 50 mL
APARATOS POR EQUIPO:
1 centrífuga clínica
1 balanza granataria
2 espectrofotómetros
4 celdas
LOS ALUMNOS DEBERÁN TRAER POR EQUIPO:
6 gr. Aproximadamente de leche en polvo descremada
1 plumón indeleble
Masking tape

2. Jabón y franela para limpiar
INTRODUCCIÓN
Colorimetría
La colorimetría es la ciencia que estudia la medida de los colores y que
desarrolla métodos para la cuantificación del color, es decir la
obtención de valores numéricos del color.
Espectrofotometría
Se denomina espectrofotometría a la medición de la
cantidad de energía radiante que absorbe un
sistema químico en función de la longitud de onda,
de la radiación, y a las mediciones a una
determinada longitud de onda. La principal
aplicación de la espectrofotometría es la
determinación de las concentraciones ya sea de
sustancias químicas o de microrganismos presentes en una solución.
¿Como funciona un espectrofotómetro?
El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste
básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y
calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra
en una serie de intervalos de longitudes de onda.
Ley de Beer-Lambert
Es una relación empírica que relaciona la absorción de luz
con las propiedades del material atravesado. La ley de Beer
tiene en cuenta el área y el número de partículas qué

3. atraviesa un haz de luz, deduciendo de esto la energía que queda atrapada.
La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad
saliente después de que en dicho medio se produzca absorción. La relación entre ambas
intensidades puede expresarse a través de la siguiente relación:
Donde:
I1, I0: Son las intensidades saliente y entrante respectivamente.
A=αlc: Absorbancia, que puede calcularse también como:
L: Longitud atravesada por la luz en el medio
C: concentración del absorbente en el medio.
Es el coeficiente de absorción:
: Longitud de onda de la luz absorbida.
: Coeficiente de extinción.
La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una
sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud
del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y α, la concentración de la sustancia puede ser
deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.
Ecuación de Henderson-Hasselbalch
Formula bioquímica que se utiliza para calcular el pH, de una solución buffer o tampón, a partir de
Pka (la constante de disociación del acido) y de las concentraciones de equilibrio del acido o base,
del acido o la base conjugada.
A-] / [AH])Donde:
 S es la sal o especie básica, y
 A es el ácido o especie ácida
En la última ecuación x puede ser a o b
indistintamente.

4. Método de Biuret
El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un
complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta característico,
que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da porlacoordinacióndeunátomodecobrecon
cuatroátomosdenitrógeno.El complejose basa en la desprotonación de los grupos amida para formar
el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los
pares de electrones libres de los átomos de oxigeno y de nitrógeno del péptido. Después de la
adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret
estable; es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en
configuración tris y amoniaco.
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu
2+
y los grupos NH de los enlaces
peptídicos en medio básico. 1Cu
2+
se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante
específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y
sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados.
Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptídicos

5. 1. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO
1.1 Preparación de una serie de tubos con solución amortiguadora de acetatos. Coloca en
una gradilla 6 tubos de 15 x 100 rotulados con números consecutivos. Adiciona a cada
tubo las soluciones ácido acético y acetato de sodio que
indica la siguiente tabla:
E l volumen final de cada tubo deberá ser de 5 ml.
2. PREPARACIÓN DE LA LECHE
2.1 En un vaso de precipitados de 100 ml disuelve 6 gr. De leche en polvo descremada,
con 50 ml de agua destilada.
NOTA: Añade el agua poco a poco para evitar que se
formen grumos que podrían dificultar la obtención
de una solución homogénea. No debes calentar la
leche para disolverla.
2.2 En un tubo de ensayo de 16 x 150 mm mide 2 ml de leche
rehidratada preparada como se indico anteriormente y
añade 8 ml de agua destilada, agita cuidadosamente por
inversión. Esta muestra de leche diluida (1:5) se ocupara
para llevar a cabo la determinación del punto isoeléctrico
de las proteínas.
Tubo Solución ácido
acético 0.1 N
Solución de sodio
0.1 N
1 5 ml
2 4 ml 1 ml
3 3 ml 2 ml
4 2 ml 3 ml
5 1ml 4 ml
6 5 ml

6. 3. PUNTO ISOELÉCTRICO
3.1 Añade 1 ml de la leche diluida (1:5) a cada tubo de solución amortiguadora que
preparaste en el punto 1.
3.2 Mezcla cuidadosamente por inversión todos los tubos y deja reposar por espacio de
10 minutos. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. En el tubo donde observes
grumos de leche suspendidos en la solución te indicará que las proteínas de la leche se
han insolubilizado debido al pH de las solución este pH es denominado punto
isoeléctrico.
3.3 Centrifuga los tubos a 2500 r.p.m durante 10 minutos NO SIN ANTES BALANCEARLOS.
Deberá pesar lo mismo que aquel tubo que ocupara el lugar opuesto dentro de la
centrifuga.
3.4 Separa el sobrenadante (cuidando de no suspender el
precipitado acumulado en el fondo del tubo) y transfiere

7. a tubos limpios de 15 x 100 rotulados con el número de tubo que les corresponde.
4. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS CON EL MÉTODO DE BIURET
4.1 Coloca en una gradilla 11 tubos de 16 x 150 mm, rotula uno de ellos como número
cero, el cual llevara los reactivos para calibrar el espectofotómetro (blanco de
reactivos o testigos) los siguientes 4 tubos llevarán números consecutivos del 1.
4.2 Añade a cada tubo los reactivos para determinar proteínas en la curva de calibración
(tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la
siguiente tabla:
CURVA DE CALIBRACIÓN TUBOS PROBLEMA
Tubo 0 I II II IV V 1 2 3 4 5 6
Solución
Patrón 4
mg/ml
0
ml
0.2
ml
0.4
ml
0.6
ml
0.8
ml
1
ml
0 0 0 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5
Agua 1
ml
0.8
ml
0.6
ml
0.4
ml
0.2
ml
0
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
Reactivo de
Biuret (ml)
4.0 ml a todos los tubos
Nota:

8. Mezcla cuidadosamente cada reactivo y deja en reposo 30 minutos para favorecer el desarrollo de
color. Antes de iniciar tus lecturas en el espectofotómetro, previo calentamiento de 15´, es
necesario calibrarlo con el blanco de reactivos a una absorbancia de cero, con una longuitud de
onda de 570 mm.
Si observas alguna turbidez en alguno de los tubos, es conveniente que filtres antes de hacer la
lectura.
5. RESULTADOS
Tubo I II III IV 1 2 3 4 5 6
D.O 0.082 0.121 0.163 0.202 0.048 0.046 0.048 0.050 0.059 0.048
Mg. De
proteína
0.8 1.6 2.4 3.2 0.024 0.023 0.024 0.025 0.02 0.024
Proteína mg/ml Mg/100ml
Sobrenadante 1 0.025 2.5
Sobrenadante 2 0.024 2.4
Sobrenadante 3 0.049 4.9
Sobrenadante 4 0.024 2.4
Sobrenadante 5 0.04 4
Sobrenadante 6 0.236 2.36
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Curva de calibración.
O.D

9. Bibliografía
Wikipedia la enciclopedia libre (sitio en internet). Ley de Beer- Lambert. Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Ley_de_Beer-Lambert
Scrib (sitio en internet). Colorimetría. Disponible en:
http://es.scribd.com/doc/43700968/Colorimetria-copia-3
Wikipedia la enciclopedia libre (sitio en internet). Ecuación de Henderson- Hasselbalch. Disponible
en: http://es.wikipedia.org/wiki/Ecuaci%C3%B3n_de_Henderson-Hasselbalch
www. Ehu.es (Sitio en internet). Ecuación de Henderson- Hasselbalch. Disponible
en:http://www.ehu.es/biomoleculas/buffers/hh.htm
www. Biología Arizona. Edu (sitio en internet). Ecuación de Henderson- Hasselbalch. Disponible
en:http://www.biologia.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/ph/HH.html
Scrib (sitio en internet). Método de Biuret. Disponible en:
http://es.scribd.com/doc/42854211/43/Metodo-de-Biuret
Chang, R. (1999), Química Edición breve.Ed.McGraw-Hill, México.
Trudy Mc Kee, James R, (2003), Bioquímica la base molecular de la vida. 3°Edición,
McGraw-Hill, México.