A brief presentation about pyrosecuencing in basque.

1. Xabier Arratibel, Bingen Gutierrez,
Ines Martin eta Garazi Serna

2. 

Pirosekuentziazioa luziferasa entzimak ATP gastatuz igorriko
duen argi ikusgarriaren neurketan onarritzen da.
Argi kantitatea sekuentziako nukleotido kopuruarekiko
proportzionala da.

3. 

DNA erauzi
PCR-a burutu
◦ Mix-a
 Hasle biotinizatua


(Bisulfitoarekin tratatu metilazioak aztertzen bagaude)
Desnaturalizatu
◦ NaOH

Biotinadun harizpiak harrapatu
◦ Hutsezko ponpa
◦ Estreptabidinari batu

5. 
Pirosekuentziadorea
◦ 9 putzu daude dispentsadorean
 Entzimen mixa, substratuen mixa, A, C, G eta T
◦ Nukleotido desberdinak ordenean sartzen dira plakan
(guk sartzen diogu sekuentzia, gure kasuan)

6. ◦ Harizpiarekin elkartzean PPi askatu
◦ ATP sulfurilasa
 PPi-ak ATP bihurtzeko
 (Adenosina 5’ fosfosulfatoaren laguntzaz)
◦ Luziferasa
 ATP erabiliz, luminiszentzia eragin
 Luziferina sustratu
Oxiluziferina
◦ Apirasa
 Erabili ez diren nukleotidoak degradatu
◦ Argi izpiak neurtu eta informazioa batu

17. http://www.labtube.tv/channel.aspx?v=137486&u=QIAGEN
http://www.qiagen.com/knowledge-and-support/videos-andvirtual-demos/videos/pyrosequencing%20cascade%20reaction/

18. Bisulfitoaren bidezko pirosekuentziazioa
•Metilazioa kuantifikatzeko teknika.
Prozedura:
•DNA erauzi.
•Bisulfitoarekin tratatu
•Demagun hau dela gure sekuentzia
oMetilatua badago
oEz badago metilatua
5´GCATCG…….CG………..CG……CG3’
5’ GTATCC…....CG……….CG…….CG3’
5’ GTATTG….….TG……….TG..….TG3’

20. •PCR burutu.
•Lagina desnaturalizatzen da.
•Hasleak guztiz biotinilizatuak.
•DNA sekuentziak hibridatu hasle espezifikoarekin. Harizpi osagarria aipatutako
entzimen presentzian eratuko da.
•Harizpi bakarreko anplikoiak harrapatu egiten dira estreptabidina bidez.

21. •Sekuentziazioa (3.pausua)
•25-30bp bitarteko sekuentziak
•Pirograma
Kontrolak:
•Kontrol negatiboa

22. Osasuntsua den batekiko
alderatuz nukleotido aldaerak
ikusi

23. Bisulfitoaren eraginez CG ak T bihurtu
metilatuta ez badaude.
Portzentaiak metilazio maila adierazten
du.