Tests in vitro pour évaluer la sensibilité de P. falciparum aux drogues - Conférence de la 7e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - RASON Marie-ange - Madagascar - mieange@pateur.mg

1. Tests in vitro pour évaluer la sensibilité
de P. falciparum aux drogues
par
Marie-Ange Rason, MD
7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”
08 Avril 2009 – Institut Pasteur de Madagascar

2. …, il est impératif de surveiller la
sensibilité/résistance de Plasmodium sp aux
antipaludiques, notamment dans les pays
d’endémie.

3. Test in vivo
(traitement et suivi)
Echantillon
de sang
Tests in vitro
Evaluation de la sensibilité de
P. falciparum aux antipaludiques
Test de
chimiosensibilité
Génotypage
(marqueurs de
résistance)

4. 4
Test de chimiosensibilité in vitro
Mise en culture
des parasites
viables
Microscopique
OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001
Colorimétrique (pLDH, HRPII)
Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57
Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-64
Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3575-3577
Isotopique (hypoxanthine tritiée)
Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29
Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51
Cytométrie en flux
Pattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91
Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)
Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
Smilkstein et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1803-1806
Bennet et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1807-1810
M.A. Rason et al. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102, 346-351

5. 5
Tests de chimiosensibilité in vitro
Microscopique
OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001
Colorimétrique (pLDH, HRPII)
Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57
Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-
64
Isotopique (hypoxanthine
tritiée)
Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29
Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51
Cytométrie en flux
Pattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91
Microfluorimetrique (PicoGreen,
Sybergreen)
Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24

6. Cycle biologique des plasmodies infectant
l’homme

7. Cycle biologique des plasmodies infectant
l’homme

8. Contraintes logistique et technique (communes)
• isolats (souches de parasites provenant des malades)
• Équipements de laboratoire
• Personnel compétent
• Bonnes pratiques de laboratoire
• Clones de référence de P. falciparum (3D7, FCM29, D6
…)

9. Procédure:
Randrianarivelojosia et al, 2002
Le Bras & Deloron, 1983
Plasmodium falciparum (synchronisé)
 Préparation de la suspension parasitaire dans du RPSH
10%(200µl par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de
parasitémie; 1,5% d’hématocrite; hypoxanthine tritiée 0,4
µCi/puits)
 Incubation 42h à 37°C (atmosphère microaérophile et
humide)
 Evaluation de la radioactivité incorporée et calcul des
CI50
Conduite du test isotopique in vitro

10. Plaques de culture
à 96 puits, à fond plat,
pré médicamentées
Exemple de drogues :
Chloroquine
Monodesethyl-AQ
Quinine
Dihydro-artémisinine
Méfloquine
Conduite du test isotopique in vitro

11. Modular Incubator Chamber
Billups-rothenberg

12. Mise en culture
Incubation pendant 42h à
37°C; atmosphère humide;
en microaérophilie
Congélation
Décongélation des plaques
de culture
Conduite du test isotopique in vitro

13. Salle de collecte, collecteur et filtre en fibre de verre

14. Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthine
tritiée dans l’ADN du parasite (Base purine: A-G)
+
Hypoxanthine-3H
ADN plasmodial
(début du test)
ADN marqué
au tritium

15. Compteur à scintillation liquide piloté par ordinateur
. Comptage de la radioactivité en
coups/mn(cpm) à l ’aide du Microbeta
. Calcul des CI50 (concentration
inhibitrice 50%) en nanomolaire (nM)
. Seuil resistance: chloroquine (100 nM),
monodesethylamodiaquine (60 nM) ,
quinine (800 nM).

16. Disposition et concentration des molécules en
nanomolaire (nM) dans la plaque
vert = Témoin négatif (puits sans médicaments)
Faible
concentration
Forte
concentration
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 12,5 12,5 2,5 2,5 25 25 0,25 0,25
B 25 25 25 5 5 5 50 50 50 0,5 0,5 0,5
C 50 50 50 10 10 10 100 100 100 1,25 1,25 1,25
D 100 100 100 20 20 20 200 200 200 2,5 2,5 2,5
E 200 200 200 40 40 40 400 400 400 5 5 5
F 400 400 400 80 80 80 800 800 800 10 10 10
G 800 800 160 160 1600 1600 20 20
H 1600 1600 320 320 3200 3200 40 40
CQ MAQ Q DHA
TDD01

17. Résultats du comptage de radioactivité pour
un test de chimiosensibilité in vitro de P. falciparum
vert = Témoin négatif (puits sans médicaments)
Faible
concentration
Forte
concentration
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 13819 13626 14042 13988 14141 14103 12061 12252 14425 11577 11489 14374
B 13276 12774 14926 15296 15550 14952 8243 7737 7353 8487 6670 8765
C 6373 5763 5547 12805 13048 12214 4816 5046 4912 1125 845 1106
D 859 1015 1112 880 914 1062 2916 2381 2746 700 479 672
E 549 593 549 417 392 444 1104 1250 1333 529 555 520
F 553 478 477 496 390 402 496 592 643 583 457 1015
G 567 485 13177 820 638 13372 746 766 12513 12014 466 1077
H 521 587 11900 783 635 11898 782 1210 11944 11444 700 495
CQ MAQ Q DHA
TDD01 TDD01 TDD01 TDD01

18. 18
Test de chimiosensibilité in vitro
Mise en culture
des parasites
viables
Microscopique
OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001
Colorimétrique (pLDH, HRPII)
Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57
Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-64
Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3575-3577
Isotopique (hypoxanthine tritiée)
Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29
Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51
Cytométrie en flux
Pattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91
Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)
Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
Smilkstein et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1803-1806
Bennet et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1807-1810
Rason et al. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102, 346-351

19. SYBR Green I is a DNA- intercaling dye that prefers G and C base pairs.
formule chimique: C32H37N4S - cyanines asymétriques (fluorophores)
Excitation is at 488nm and emission at 510 to 550

20. Mise en culture des parasites
. Plaque prémédicamentée
. Lavage 3x avec RPMI-1640
. RPSH 10% sans hypoxanthine tritiée
. Parasitémie à 0.5%, hématocrite à 1,5%
. Incubation 72 h à 37°C, atmosphère microaérophile et humide
. Congélation plaque
lecture:
. Décongeler les plaques pendant 2 H au moins à température ambiante(RT)
. Transférer 100 µL de la suspension parasitaire dans une plaque vierge
. Préparer mix: 0,2µL/ml de Sybr Green avec tampon lyse MSF (Malaria
Sybr Green fluorescence)
. Ajouter 100µL/puits de ce mix dans la suspension parasitaire
. Incuber 30 mn à RT, à l’abri de la lumière
. Lecture 485/535 nanomètre au fluorimètre
Méthode avec Sybr Green (fluorophore)
______________________________________________

21. Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green
Plaque prémédicamentée Plaque prémédicamentée
Suspension parasitaire + hypox-3H
Incubation culture (72H)
Incubation culture (42H)
Suspension parasitaire
Transfert sur filtre
Séchage filtre
Rajout liquide scintillant
scellé
Compteur à scintillation liquide
Transfert 100µL+ rajout Tp Lyse MSF
avec Sybr Green
Incubation 30mn
Lecture / Fluorimètre

22. Fluorimètre

23. Table 1: Comparison of the isotopic and SYBR Green I measurements for clinical isolates of P. falciparum tested against four drugs
______________________________________________________________________________________________________________
Drug tested No. isolates Geometric mean (nM) [95%CI] P-valuea αcb
tested ___________________________________
Isotopic assay [3H]- SYBR Green I
hypoxanthine
_________________________________________________________________________________________________
50% inhibitory concentration
Chloroquine 138 20.2 [16.5-27.7] 22.3 [18.7-26.7] 0.46 0.93
Monodesethylamodiaquine 138 7.6 [6.6-8.8] 7.2 [6.3-8.3] 0.61 0.92
Quinine 135 48.7 [40.6-58.4] 52.3 [44.7-61.3] 0.56 0.90
Dihydroartemisinine 130 0.80[0.65-0.97] 0.80[0.65-0.96] 0.99 0.81
90% inhibitory concentration
Chloroquine 138 116.6[98.0-138.8] 119.4[102.3-139.5] 0.84 0.68
Monodesethylamodiaquine 138 32.9[28.8-37.7] 35.5[30.8-40.8] 0.45 0.73
Quinine 135 342.1[296.7-394.4] 335.8[287.7-391.9] 0.86 0.72
Dihydroartemisinine 130 4.4[3.8-5.1] 4.6[3.95-5.46] 0.66 0.58
____________________________________________________________________________________________________________
a Significances by Mann-Whitney U tests are given for the difference in inhibitory concentrations measured with the two assays.
b Concordance coefficient correlation.

24. Correlation between individual IC50s (in nM) for chloroquine
determined by the SYBR Green I and the isostopic assays
(n=541; r = 0.93, CI95% 0.92-0.94) P< 0.0001
0,01 0,1 1 10 100 1000
1000
100
10
1
0,1
0,01
Log IC50 SYBR Green I
LogIC50isotopic

25. Avantages et Inconvénients
_________________________________________________
Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green
. Radioélément . Fluorophore
. Référence . Simple
. Radioprotection . Rapide
. Personne compétente . très sensible
. Compteur à scintillation . Fluorimètre
. Incubation 42H . Incubation 72H
. Résultats en cpm . RFU(Relative Fluorescence Units)
. 50$ par plaque 96 puits . 0,88$ par plaque 96puits

26. Conclusion avec méthode Sybr Green
Préférable d’utiliser cette méthode avec:
 signal
 coût
Son utilité dans le test de chimiosensibilité:
 idéal pour un screening avec un grand nombre
d’échantillons
 approprié pour comparer avec un autre méthode
 faisable sur le terrain

27. Tests in vitro pour évaluer la sensibilité
de P. falciparum aux drogues
par
Marie-Ange Rason, MD
7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”
08 Avril 2009 – Institut Pasteur de Madagascar