Caractérisation de chitinases chez les nématodes - Parole de junior de la 7e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Maeder Muriel Nirina - Suisse - murielnirina@excite.com
2. Introduction
Second composant naturel le plus
abondant après la cellulose
(1x1013kg/an)
Polysaccharide composé de résidus
N-acétylglucosamine (GlcNAc)
formant une chaîne
Constituant principal de la carapace
des insectes, des crustacés et de la
paroi des champignons
Chitine
GlcNAc
3. Introduction
Enzymes spécifiques qui coupent la chitine
Impliquées dans les mécanismes de défense, de
nutrition ou de morphogenèse (en particulier les mues)
ainsi que dans la transmission de certains parasites
Tous les organismes possèdent des chitinases
Chitinases
4. Introduction
2 familles principales: Famille * et Famille *
Famille * retrouvée chez tous les organismes
Famille * jusqu’à présent spécifique aux plantes et retrouvées
dernièrement également chez certaines bactéries
Chitinases
5. Les chitinases et les animaux
Chitinases trouvées chez tous les organismes et donc
chez tous les animaux
Etudes ciblées sur les chitinases présentes chez les
nématodes
6. Nématodes
Appelés aussi vers ronds
Cosmopolites
Vers libres et vers parasites
4 mues obligatoires: œuf → L1 → L2 → L3 → L4 → adulte
Nématodes
7. Nématodes parasites
Qu’est-ce qu’un parasite?
un parasite est un organisme vivant qui se nourrit, s'abrite et se reproduit
en établissant une interaction durable avec un hôte
Qu’est-ce qu’un vecteur?
un vecteur est un organisme qui ne provoque pas lui-même une maladie
mais qui disperse l’infection en transportant les agents pathogènes d'un
hôte à l'autre
Les nématodes peuvent être des parasites de plantes,
d’insectes, d’animaux y compris l’Homme
8. Nématodes parasites
Pertes économiques importantes
imputables aux nématodes
parasites
Dégâts aux récoltes estimés chaque
année à plus de 10%
Nématodes parasites et l’Homme
Baisse de rendement notamment au niveau de la viande et
du lait pour les animaux de rente
Responsables des maladies les plus invalidantes pour
l’Homme
9. Caenorhabditis elegans
Nématode libre: Caenorhabditis elegans
Ver utilisé comme modèle
biologique: cycle de vie
court, multiplication rapide,
simplicité anatomique
Ver utilisé comme modèle
génétique: organisme
totalement séquencé
10. Ascaris suum
Nématode parasite: Ascaris suum
Hôte définitif: cochon
Différents organes touchés:
intestin, foie, système
respiratoire
1 million d’œufs pondus par
jour
11. Heterorhabditis megidis
Ver entomopathogène avec
pour hôte définitif le charançon
Utilisation dans la lutte
biologique
Commercialement exploité
Nématode parasite: Heterorhabditis megidis
12. Brugia malayi et Brugia pahangi
Hôte définitif: Homme
Hôte intermédiaire: moustique
Responsable de l’éléphantiasis
(filariose lymphatique)
120 millions de personnes
infectées chaque année dans
80 pays
Nématodes parasites: Brugia malayi
Brugia pahangi (modèle de laboratoire)
13. Présence des chitinases chez les
nématodes?
La présence des chitinases a déjà été démontrée chez
différents nématodes (C. elegans et certaines filaires)
Les chitinases ont déjà fait l’objet de plusieurs thèses du
laboratoire de parasitologie
Les chitinases de certains nématodes parasites ont été
proposées comme cible pour des vaccins
14. Hypothèses
1. Des chitinases sont présentes chez C. elegans et
doivent avoir des rôles différents que le seul
supposé dans la transmission des nématodes
parasites par les vecteurs
2. Des chitinases spécifiques des plantes sont – elles
présentes chez C. elegans? si oui, il s'agit d'une
nouvelle découverte
15. Objectifs
Rechercher les chitinases de la Famille * et de la
Famille * chez le nématode libre appelé C. elegans et
caractériser les chitinases de la Famille *, spécifiques
aux plantes
Identifier les chitinases de la Famille * chez les vers
parasites Ascaris suum, Heterorhabditis megidis,
Brugia malayi et B. pahangi
16. Méthodologie
Base de données (traitement par ordinateur des informations disponibles)
Comparaison des séquences disponibles
Clonage pGEM-T
Clonage pPIC/pGEXProtéine recombinante Digestion
Séquençage
PurificationAmorces PCR
18. Résultats
40 gènes de chitinases trouvés pour C. elegans
34 gènes pour la Famille *
6 gènes pour la Famille *
(jusqu’à maintenant spécifique aux plantes)
Analyse des bases de données
19. Résultats
Identification de la présence des chitinases de la Famille *
chez C. elegans
Présence confirmée
par séquençage
20. Résultats
Identification de la présence des chitinases de la Famille *
chez A. suum
Présence confirmée
Confirmation de ces résultats par une publication
(Geng, 2002)
21. Résultats
Identification de la présence de chitinase de la Famille * chez
H. megidis
Présence confirmée
par séquençage
22. Résultats
Identification de la présence de chitinases de la Famille * chez
B. pahangi et B. malayi
Présence confirmée
par séquençage
24. Résultats
Alignements conservés pour les chitinases de la
Famille *
Séquences de nématodes plus longues que celles de plantes
ou bactérie
Différences dans les résidus conservés
25. Synthèse des résultats
Recherche informations dans les bases de données
Dessin des amorces
Optimisation des conditions de PCR
Clonage des gènes d’intérêt
Séquençage
Expression des protéines recombinantes
(système bactérien et de levure) à poursuivre
Alignement des séquences
26. Conclusion
1. Vue que des chitinases sont présentes chez C. elegans, les
chitinases doivent avoir des rôles différents
→ La présence confirmée de nombreuses chitinases souligne que les chitinases
sont des molécules importantes pour des fonctions diverses
2. Si des chitinases de la Famille * sont effectivement présentes
chez C. elegans, il s'agit d'une nouvelle découverte
→ La présence de ces chitinases a été confirmée et élargie chez C. elegans. Ces
chitinases sont aussi présentes chez A. suum, H. megidis, B. malayi et B. pahangi
3. Les chitinases de la Famille * deviennent ainsi de nouvelles cibles
possibles pour l’élaboration de vaccin contre les nématodes
parasites
27. Perspectives
→Acquisition des chitinases de la Famille * chez les
nématodes par transfert génétique horizontal (HGT)?
→ Présence des chitinases de la Famille * chez les vers
parasites de plantes? Expression chez les deux sexes?
Dans tous les stades de développement?
→ Système d’expression des chitinases de la Famille *?
Rôles et fonctions de ces chitinases? Implication dans
la pathogénicité?