Dokumen tersebut membahas tentang metode PCR (Polymerase Chain Reaction) yang merupakan teknik amplifikasi DNA secara in vitro. Metode ini menjelaskan komponen-komponennya seperti primer, DNA polimerase, dan dNTPs serta prinsip kerjanya melalui siklus denaturasi, annealing, dan elongasi DNA. Dokumen ini juga menjelaskan varian-varian PCR dan berbagai aplikasinya dalam diagnosis kedokteran dan penelitian.

2. CONTENTS
1. Apa itu metode PCR?
2. Komponen-komponen PCR
3. Prinsip PCR
4. Varian-Varian metode PCR
5. Aplikasi PCR dalam diagnosis

3. Apa itu metode
PCR?
 PCR = Polymerase Chain Reaction
 Merupakan teknik amplifikasi DNA in vitro
 Ditemukan oleh Karl Mullis pada tahun
1983 → Nobel Prize in Chemistry
 1989 = majalah Science menobatkan PCR
sebagai “major scientific development”
 1993 = Taq polymerase, enzim esensial
dalam PCR, dinobatkan sebagai “molecule
of the year”
 Publikasi yang menggunakan metode PCR

4. Kelebihan
metode PCR
 1. Simple
 2. Powerful
A. sensitive – sensitivity
B. specific – specificity
C. reliable – reliability; fidelity
 3. fast

5. Komponen-
Komponen PCR
 Template (DNA
cetakan)
 Primer
 DNA polimerase
 dNTPs
 Larutan buffer (+
Nuclease-free water)
 DNA-dye atau Probe

6. Mesin Thermal
Cycler
Mesin Thermal Cycler Generasi Terbaru
Mesin Thermal Cycler Generasi I
Mesin Real Time PCR

7. Consumables

8. Prinsip PCR
 Merupakan teknik amplifikasi fragmen
DNA secara enzimatik dan bersifat in vitro
 Pada setiap n siklus PCR sempurna akan
diperoleh 2n DNA target
Mis: DNA target (template) awal = 1
molekul, maka setelah 30 siklus, DNA
target akan berjumlah 230 molekul =
1.073.741.824 molekul
 Pada umumnya terdiri atas TIGA tahap
utama yaitu
1. Tahap denaturasi DNA (denaturation)

9. Sumber: Viljoen et al. 2005, Molecular Diagnostics PCR Handbook, Springer, p.22

10. DNA Replication

11. Komponen-Komponen Penting dalam
Replikasi DNA

12. Komponen-Komponen Penting dalam
Replikasi DNA
a. DNA cetakan : molekul DNA yang akan
direplikasi
b. Molekul deoksi-ribonukleotida: dATP,
dTTP, dCTP, dan dGTP
c. DNA Polymerase: enzim yang mengkatalisis
proses polimerisasi nukleotida menjadi untaian
DNA
d. DNA primase: enzim yang mengkatalisis
sintesis primer untuk memulai replikasi DNA
e. DNA helikase dan DNA girase: enzim yang
membuka ikatan untaian DNA induk &
berperan dalam mencegah aktivitas
supercoiling
f. Single strand binding protein (SSB): molekul
protein yang menstabilkan untaian DNA yang
sudah terbuka
g. DNA ligase: enzim yang menyambung
fragmen-fragmen DNA
dATP = Deoxyadenosine triphosphate
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAReplication.html

13. The Reaction
PCR tube THERMOCYCLER

14. Denature (heat to
95oC)
Lower temperature to 56oC
Anneal with primers
Increase temperature to
72oC DNA polymerase +
dNTPs

16. Varian-Varian
PCR
 Basic PCR
 Nested PCR
 Multiplex
PCR
 Real Time
PCR
 RT-PCR
 Inverse

17. PCR & Gel
Electrophoresi
s
PCR Gel Electrophoresis

18. Real Time PCR

19. HRM Analysis
High Resolution Melting Analysis

20. Homoduplexes C or T
C
T
G
A
Homozygotes represented by a single base change are
differentiated by a difference in Tm melt.
20

21. Struktur DNA
Ikatan Hidrogen
Ikatan Fosfodiester
Gula Pentosa
Fosfat
Basa
Purin/Pirimidin
Susunan DNA: Double helix, Antiparalel
Chargaff’s Rule: DNA from any cell of all organisms should have a 1:1 ratio (base Pair Rule)
of pyrimidine and purine bases and, more specifically, that the amount of guanine is equal to cytosine and
the amount of adenine is equal to thymine
Copyright © 2004 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings

22. Applications of PCR
Basic Research Applied Research
• Mutation screening • Genetic matching
• Drug discovery • Detection of pathogens
• Classification of organisms • Pre-natal diagnosis
• Genotyping • DNA fingerprinting
• Molecular Archaeology • Gene therapy
• Molecular Epidemiology
• Molecular Ecology
• Bioinformatics
• Genomic cloning
• Site-directed mutagenesis
• Gene expression studies

23. Aplikasi Dalam
Dunia Farmasi
 Farmakogenetik
 Farmakogenomik
 Resistensi Mikroba
Terhadap Obat
 Disease Susceptibility

24. Penyakit Infeksi
Tropis di Indonesia
 Demam berdarah
dengue
 Malaria
 TBC
 Demam tifoid
 Melioidosis
 Dll

25. Aplikasi PCR dalam
Diagnosis
 Penentuan genotipe virus Dengue: DEN
1-4
 Penentuan spesies Plasmodium
dalam kasus infeksi malaria
 Identifikasi gen Mycobacterium
tuberculosis yang bertanggung
jawab dalam patogenesis
 Genotyping Salmonella enterica
serovar Typhi sebagai penyebab

26. Sumber: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166093405001564
Sumber: http://jcm.asm.org/content/43/5/2435.full.pdf+html

27. Aplikasi PCR dalam
Pengobatan
 Penentuan profil mutasi gen mikroba.
Mis: mutasi gen GyrA menyebabkan
penurunan sensitivitas terhadap
fluorokuinolon
 Penentuan aktivitas ekspresi gen yang
bertanggung jawab dalam imunitas
tubuh (mis: gen IL dan MHC) sebagai
gambaran tingkat imunitas seseorang
 Identifikasi fragmen DNA tertentu pada
individu sebagai hasil integrasi DNA

28. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567576912001488
Sumber: http://aac.asm.org/content/early/2012/02/22/AAC.06414-11.abstract

32. Suggested Readings