2. COLORATION DE GRAM
1. REALISATION D'UN FROTTIS
2. COLORATION DE GRAM
3. OBSERVATION AU MICROSCOPE
3. REALISATION D'UN FROTTIS
- nettoyer une lame de verre à l'éthanol / acétone
- déposer sur une lame propre une goutte de suspension
bactérienne
- réaliser le frottis à partir du centre de la lame en
décrivant un mouvement circulaire
- sécher le frottis en passant la lame à la flamme du bec
bunsen (2 à 3 fois)
- fixer la préparation en flambant la lame avec l'éthanol /
acétone
- sécher la lame à la flamme
4. COLORATION DE GRAM
- Coloration développée en 1884 par un médecin danois
Christian Gram
- méthode de coloration la plus largement utilisée en
bactériologie
- mise en évidence de différences de nature de la paroi
bactérienne (bactéries à Gram négatif ont un peptidoglycane
plus fin que celles à Gram positif)
- se déroule en 3 temps :
1. coloration au violet de gentiane et fixation de la coloration
par le lugol
2. traitement à l'éthanol (dissolvant le violet de gentiane
décolorant les bactéries à Gram négatif)
3. contre-coloration à la fushine ou safranine (colorant en rose
les bactéries précédemment décolorées)
5. COMPOSITION DE LA PAROI BACTERIENNE
Gram + Gram-
Peptidoglycane épais Peptidoglycane fin
90% de la paroi 10% de la paroi
L'éthanol traverse uniquement la paroi des bactéries à Gram
négatif (dissolution des lipides de la membrane externe) et
décolore le cytoplasme !
6. COLORATION DE GRAM :
PROTOCOLE
- verser quelques gouttes de violet de gentiane sur le
frottis
- attendre 1 minute
- éliminer l'excès de violet de gentiane puis avec un peu
d'eau sans insister
- plonger la lame 1 minute dans le lugol
- rincer abondamment à l'eau
- rincer à l'éthanol / acétone des 2 côtés de la lame
- rincer abondamment à l'eau
- plonger la lame 1 minute dans la fushnine ou safranine
- rincer abondamment à l'eau
- sécher la lame à la flamme
7. COLORATION DE GRAM :
RESULTATS
- les bactéries à Gram positif apparaissent violettes
- les bactéries à Gram négatif apparaissent roses
- les vieilles cultures bactériennes peuvent donner des
résultats de Gram variables en raison de la dégradation de
la paroi cellulaire
8. OBSERVATION AU MICROSCOPE
- grossissement x100 à immersion dans l'huile de paraffine
- ouverture maximale du diaphragme
