Slides Microbiologia

1. MICROBIOLOGIA
Le Colture
Porta Amalia

2. CAPPA A FLUSSO
LAMINARE
VERTICALE
QuickTime™ and a
decompressor
-Proteggere sia il are needed to see this picture.
campione che l’operatore

3. Sterilità e lavoro al bunsen
30 cm 30 cm
area sterile intorno alla fiamma
fiamma ossidante fiamma riducente
(azzurra) (gialla)

4. Lavorare in condizioni sterili
1. Pipette cotonate e NON pipettare MAI a bocca.
3. Lavorare sotto cappa possibilmente con un bunsen da
cappa a portata di mano.
5. Mettere tutto il necessario dentro la cappa prima di
cominciare. Tutti i movimenti perturbano flusso
laminare, rendendo inefficiente la cappa.
7. Tenere solo quanto necessario.

5. 2. Tenere le pipette in modo che puntino verso avanti e non
verso l'operatore. Evitare che la punta superi il piano
forellato dove si crea la barriera d'aria.
4. Richiudere le cose il piu' presto possibile.
• Non passare MAI sulle fiasche o sulle bottiglie aperte con
le mani o con le braccia.
• Apposito recipiente per materiale di scarto.
• Passare alla fiamma del bunsen il materiale prima e
dopo.
• dopo passare etanolo al 70%.

6. CAPPE A FLUSSO LAMINARE
Flusso d’aria unidirezionale formato da filetti di aria sterili paralleli che
si muovono alla stessa velocità in tutti i punti creando una corrente
d’aria omogenea senza turbolenze
Si ottiene combinando un filtro assoluto (HEPA) con una massa d’aria
che lo attraversa alla velocità costante di 0,45 m/sec.
Filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) :
• E’costituito da un sottile foglio a base di fibre di vetro
submicroniche montato in un telaio di alluminio o di legno.
• Ha un efficienza del 99.999% su particelle di 0,3 micron

7. TERRENI DI COLTURA
In campo microbiologico e’ di primaria importanza riuscire a
Coltivare e perpetuare i microrganismi
Agar: polisaccaride complesso che
deriva dalle alghe rosse.
•non tossico per microbi, o altre forme di vita.
•si scioglie solo a 100ºC, ma solidifica a circa 45ºC
•è fisiologicamente inerte

8. Fanny Angelina
Eilshemius
Walther Hesse
1877 La Capsula Julius Richard
Petri, assistente di Robert Koch.
diametro tra i 50 e 100 mm e
un'altezza di 15 mm.

9. PIASTRAMENTO ?
Spatolamento
Striscio
Per Inclusione

10. Figura 4.7 Tecnica della piastra per diffusione. Preparazione di una piastra per diffusione. (1) Deporre con una
pipetta una goccia di materiale al centro di una piastra contenente agar. (2) Immergere un’apposita bacchetta di
vetro in un beaker contenente etanolo. (3) Flambare per breve tempo la bacchetta bagnata di etanolo e lasciarla
raffreddare. (4) Distribuire uniformemente, strisciando, il campione sulla superficie dell’agar mediante la
bacchetta sterile. Incubare.

11. Spatolamento

13. Striscio
Koch inventò l’ansa di platino

14. Colonie isolate

15. Per Inclusione

17. Colonie
Forma: Spessore: Margine:
•Puntiforme •Piatto •Regolare
•Circolare •Sopraelevato •Ondulato
•Filamentosa •Convesso •Lobato
•Fusiforme •Cupoliforme •Eroso
•Irregolare •Umbonato •Filamentoso
•Increspato

18. POPOLAZIONE MISTA
COMUNITA’ MICROBICA
condizione naturale di convivenza (es. nel suolo, nell’intestino..).
Le varie procedure di arricchimento forniscono una miscela di specie
Koch colonie tutte diverse
Da una colonia:
Colture AXENICHE O PURE
• Colture che contengono 1 sola specie
• Normalmente non uniformi geneticamente

19. COLTURE PURE
• Colture Axeniche derivano da una cellula
singola o da CFU
– Colony-Forming-Unit
• Ogni colonia e’ Geneticamente uniforme

20. Procedure asettiche che portano a
COLTURE PURE
• Sterilizzazione del terreno di coltura
• Diluzione Seriale
• Striscio su piastra
• Diffusione su piastra
• Inclusione in piastra

21. CONTA VITALE SU PIASTRA
Modificato da ”Brock Biology of Microorganisms, 9th Ed.”, di Madigan, Martinko e Parker, Prentice Hall
Diluizioni seriali
Pro: molto sensibile;
titolazione selettiva in
popolazioni miste
grow o/n
calcolo del titolo in cfu (Colony Forming Units) / ml

22. Il campione originale è
sottoposto a diluizioni
seriali, in modo da ridurre
in misura sufficiente il
numero delle cellule
microbiche presenti.
Inclusione: diluizione più
alta in agar caldo, quindi in
piastre di petri. Le cellule
isolate crescono formando
colonie e possono essere
usate per costituire colonie
pure. Le colonie in
superficie sono circolari,
quelle al di sotto della
superficie in genere hanno
forma lenticolare.

24. COLTURE PURE
Inconvenienti della Diluzione Seriale
• Costosa (mezzi di crescita e vetreria)
• Molti pipettamenti, e
• Non attendibile al 100%

25. COLTURE PURE
Quadrant Streak Technique -
Robert Koch in 1880
• Richiede mezzi solidi
• Diluisce la cultura iniziale in DUE DIMENSIONI

26. TERRENI Calssificati in base alla
FUNZIONE ed alla COMPOSIZIONE:
•Terreni per uso generico
•Terreni arricchiti con particolari nutrienti
•Terreni selettivi
•Terreni differenziali (es. cromogeni).

27. Terreni cromogeni
Sostanze nutritive essenziali
Cromogeni (cromoforo+zucchero)
C
Z

28. QuickTime™ e un
Chromogenic E.coli O 157 agar:
E.coli non O 157 (colonie porpora)
decompressore TIFF (LZW)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Non E.coli (colonie blu)
E.coli O 157 (colonie bianche)
18-24 ore/37°C
Non fermenta il sorbitolo→ colonie bianche
Test di agglutinazione al lattice

29. Metodi di conta
microbica

30. Conta in piastra
Si basa sulla produzione di CFU su terreni
agarizzati
Le cellule devono essere vive e vitali
Il terreno deve essere appropriato

31. Quantificazione
spettrofotometrica
Lo spettrofotometro è uno strumento che misura la
assorbanza di un fascio di luce che attraversa un
campione in soluzione
Relazione lineare tra assorbanza e concentrazione
di un soluto
Densità ottica (1 OD600nm ≈ 8,0 x 108 cellule di
E. coli)

32. Torbidità e misurazione della
massa microbica
Determinazione della massa
microbica tramite misurazione
dell’assorbimento della luce. Al
crescere della popolazione, e
quindi della torbidità, aumenta
la dispersione della luce per cui
aumentano i valori
dell’assorbanza forniti dallo
spettrofotometro.

33. MISURA DELLA TORBIDITA’
http://www.prenhall.com/brock
La torbidità è dovuta alla
rifrazione della luce da parte delle
cellule presenti nella sospensione.
La densità ottica (OD) misurata a
600 nm con uno spettrofotometro
è proporzionale al numero totale
di cellule (vive e morte).

34. COMPARTIMENTO CELLE
• Le celle o cuvette sono di vario tipo a
seconda dell’uso e del tipo di strumento.
• Le celle di quarzo e di vetro sono utilizzate
nel UV/Vis.
• Sono utilizzate anche celle monouso di
polistirene.

35. Miceli non spettrofotometro, peso secco

36. Conta delle cellule
Emocitometri (conteggio al microscopio):
piu’ lento e faticoso, ma ci permette di valutare lo
stato di salute delle cellule.

37. Conta delle cellule
Camera di Bürker
QuickTime™ e un 2 identici ruled glass con
2 quadrati di
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
3 x 3 mm.
QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.

38. Camera di Burker
Emocitometro che porta incisa sulla camera di conteggio
questa griglia:
Ogni griglia ha
9 quadrati grandi di 1 mm2 o
QuickTime™ e un
decompressore 16 quadrati piccoli.
sono necessari per visualizzare quest'immagine.

39. • wet the ridges of the hemocytometer.
place a cover slip and press until you see
• load it by capillarity.
• allow cells to settle.
QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine. • to avoid evaporation, count within on
minute: the light of the microscope heats
the sample
• count 4 squares located at the 4 corners.

40. Se consideriamo che lo
spessore verticale tra il
vetrino portaoggetto e il 1/10 1/250
coprioggetto e’ di 0,1 mm,
avremo che il quadratino
piccolo corrisponde ad un
volume di 1/250 di
microlitro, mentre il
quadrato piu’ grande
corrisponde ad un volume
di 1/10 di microlitro.

41. Se contiamo le cellule che troviamo nel quadrato
piccolo moltiplicheremo il risultato per 250 per
avere le cellule per microlitro o per 250.000 per
avere le cellule per mL.
Se abbiamo diluito il campione dovremo moltiplicare
per il fattore di diluizione: ad es. se abbiamo
diluito 1:1 con Trypan blu per evidenziare le
cellule morte, dovremo moltiplicare per 2.

42. Dobbiamo contare le cellule che troviamo nel quadrato
grande e moltiplicare per 10 per avere le cellule per
microlitro o per 10.000 (104) per avere le cellule per
mL.
Se abbiamo diluito il campione dovremo moltiplicare per
il fattore di diluizione: ad es. se abbiamo diluito 1:1
con Trypan blu per evidenziare le cellule morte,
dovremo moltiplicare per 2.

43. Ovviamente dovremo fare una statistica,
contando piu’ quadrati
Attenzione alle cellule sui bordi, si devono
contare solo quelle su due lati, per non correre
il rischio di sovrastime o sottostime.

44. PROCEDURA PER LA CONTA CELLULARE
- Si effettua una diluizione 1:10
-Si carica la camera con 10 ul di sospensione cellulare
- Si procede alla conta delle cellule in ciascuno dei 4
quadrati d’angolo
C = n°x 10 x 104 x V
C = cellule per mL
n° = (n1+n2+n3+n4)/4
10 = fattore di diluizione
104 = fattore conversione
V= volume sospensione cellulare

45. Altri tipi di camere hanno “griglie” che
corrispondono a diversi volumi, ma sono
ovviamente riportati dalle case venditrici.

46. QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.

47. QuickTime™ e un QuickTime™ e un
decompressore
decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine.
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTime™ e un
decompressore QuickTime™ e un
sono necessari per visualizzare quest'immagine. decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine. QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTime™ e un QuickTime™ e un
QuickTime™ e un decompressore
decompressore decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine. sono necessari per visualizzare quest'immagine.
sono necessari per visualizzare quest'immagine.

48. QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.

49. QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.

50. QuickTime™ e un
decompressore
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51. QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.

53. Osservare i Microbi
• Batteri non-colorati non sono facilmente
osservabili.
• La colorzione é essenziale per un accurato
studio morfologico.
• Sono disponibili molti coloranti.

54. Batteri
Non colorati

55. Osservare i Microbi
Coloranti Acidi (anionici)
• Molecole coloranti hanno una carica negativa;
• Vengono a reagire con componenti cellulari
carichi positivamente;
• Buoni coloranti per eucarioti - legano istoni
(proteine cariche positivamente)
• Pessimi coloranti per batteri
• I2KI, Eosin, Congo Red, Fuchsin

56. Osservare i Microbi
Coloranti Basici (cationici)
• Molecole coloranti hanno una carica positiva;
• Reagiscono con componenti cellulari carichi
negativamente (DNA, proteine);
• Buoni coloranti per procarioti ed eucarioti
• Methylene blue, crystal violet, gentian violet,
safranin.

57. Osservare i Microbi
Coloranti neutri
• Molecole idrofobiche;
• Legano componenti cellulari non
carichi (depositi di grasso, PHB*)
• Sudan IV, Sudan Black, etc.
*Poly-b-Hydroxy Butyric Acid

58. Colorazione semplice

60. PROCEDURE di COLORAZIONE
COLORAZIONE DIFFERENZIALE
• Lo scopo è di colorare cellule in maniera diversa da
altre.
• Comprende l’uso di almeno 2 coloranti
– Colorazione primaria
– Colorazione secondaria
• Tra le 2 colorazione c’è uno step di decolorazione per
rimuovere il colorante primario da alcune cellule

61. Con il colorante
Secondario

62. Hans Gram

63. PROCEDURE di COLORAZIONE
GRAM
a Stendere; air dry; fissare al
calore
b Immergere in crystal violet
(“colorante primario”)
c Lavare, aggiungere I2KI
(Mordente)
d Decolorare con EtOH 95%
(rimuove colorante
primario dalle cellule G-)
e Immergere in safranina
“colorante secondario”
f lavare, dry, osservare

64. SIGNIFICATO della COLORAZIONE
GRAM
• Representa una reale differenza tassonomica
fra gruppi di batteri.
• Largamente dovuto alla natura della parete
cellulare (peptidoglicano).
• Si pensa che il PG si “denaturi” nello step con
EtOH, bloccando il CVI* all’interno delle cellule.
*CVI = Crystal Violet Iodine Complex

65. RISULTATI GRAM STAIN
‚ Cellule Gram positive sono VIOLA
– Staphylococcus aureus
ƒ Cellule Gram negative sono ROSA
– Escherichia coli
„ Cellule Gram variabili sono miste VIOLA e ROSA
- Bacillus subtilis
… Cellule che non reagiscono al Gram sono senza colore
– Mycobacterium tuberculosis

68. Solo colorante
primario

69. Dopo
Decolorizazione

70. Con il colorante
Secondario

72. GRAM VARIABILI