1. ANALISIS DE LA ESTRUCTURA Y ESTABILIDAD
DEL INTERCAMBIADOR Na+/Ca2+ CARDIACO
BOVINO Y SU INTERACCION CON LIGANDOS
REGULADORES Y FOSFOINOSÍTIDOS DEL
MICROENTORNO LIPÍDICO.
Dra. Posada V. Lucy
CIQUIBIC
Centro de Investigaciones en Química
Biológica de Córdoba
Departamento de Química Biológica
CONICET
UNC Facultad de Ciencias Químicas
Universidad Nacional de Córdoba

2. Objetivo General
Contribuir al conocimiento integral de los mecanismos involucrados en el
mantenimiento de la homeostasis de Ca2+ intracelular, a través del sistema de contra
-transporte Na+/Ca2+.
Objetivos Específicos
1- Estudiar en forma comparativa la estructura y estabilidad de NCX1 y de su asa
citoplasmática aislada (soluble).
2- Investigar en forma comparativa la interacción de NCX1 y del asa citoplasmática
aislada con sus ligandos reguladores: Ca2+, Na+ y H+.
3- Estudiar el efecto de la composición y fase lipídica sobre la modulación de la
conformación del asa citoplasmática del NCX1 con especial atención en su
interacción con fosfatidilinositol-4,5-di fosfato.

3. CARACTERÍTICAS GENERALES
DEL INTERCAMBIADOR Na+/Ca2+
El intercambiador Na+/Ca2+ puede introducir o eliminar Ca2+ citosólico,
reversiblemente, en intercambio con Na+, dependiendo de los gradientes
iónicos y de la diferencia de potencial transmembrana.
Es un transportador electrogénico ya que intercambia 3 o 4 Na+ por 1 Ca2+
Es incapaz de producir flujos iónicos desacoplados
1Ca2+ 3 Na+
ext ext
membrana
int int
3 1Ca2+
Ca2+ Na+ Ca2+
MODO DIRECTO MODO REVERSO
Intercambiador Na+/Ca2+
Sitio regulatorio para Ca2+i

4. Ca2+ COMO MENSAJERO INTRA-CELULAR
6 5
4
2
1
3
HOMEOSTASIS INTRACELULAR DE Ca2+ (CARDIOMIOCITOS)
Acoplamiento Excitación-Contracción

5. MODELO TOPOLOGICO DEL INTERCAMBIADOR Na+/Ca2+
Adaptado de Schulze y col., 2003.

6. REGULACION DEL INTERCAMBIADOR Na+/Ca2+
Na+ Na+
Na+
Inactivación por Na+i
- - Ca2+
Mg-ATP
- PtdIns-4,5-P2
Modulación por H+i
+
Regulación por Ca2+i
+
CITOSOL
REGULACIÓN REGULACIÓN
IÓNICA METABÓLICA

7. VÍAS DE SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DE LOS POLIFOSFOINOSÍTIDOS

8. 2) Identificación y cuantificación de los poli-fosfoinosítidos marcados:
Fosforilación ([32P]–γ-ATP)
HP-TLC
Autorradiografía electrónica (storm-Scion Image)
Identificación (patrones comerciales)
3) Cuantificación inmunológica del PtdIns-4,5-P2 asociado al Intercambiador Na+/Ca2+
3a) por “Western blot” :
Electroforesis (SDS-PAGE 7.5%)
Electrotransferencia a PVDF
Inmunodetección con Anti-PtdIns 4,5-P2 (ECF-Storm)
Inmunodetección con Anti-NCX1 (Detección color)
Cuantificación densitométrica arbitraria
3b) por co-inmuno- precipitación (control de co-migración)

9. Efecto de PtdIns-4,5-P2 y Mg-ATP sobre el intercambio Na+/Ca2+
cardíaco bovino a 1 µM Ca2+ev y pHev 7.4, en vesículas tratadas con
y sin PCMBS (100 M).
La adición de PtdIns-4,5-P2 (100 µM) incrementa el intercambio Na+/Ca2+ tanto en
las vesículas cardíacas controles como en las pre-tratadas con PCMBS.

10. CONCLUSION
Nuestros resultados indican que el efecto de PCMBS sobre la activación por
Mg-ATP del intercambiador Na+/Ca2+ cardíaco sería indirecto. Un mecanismo
posible para explicarlos sería un disturbio de las vías de producción neta de
PtdIns-4-P y PtdIns-4,5-P2 que regulan dicho sistema.
Estas evidencias experimentales marcan una diferencia con el inetrcambiador
de nervio óptico de calamar, en el que PCMBS actuaría bloqueando grupos
sulfhidrilos presentes en la propia proteína transportadora (NCX-SQ1)
afectando al sitio regulatorio para Ca2+ intra-celular, según evidencias cinéticas
(Dipolo y col., 2000).

11. CAPÍTULO II
ANALISIS DE LA POSIBLE REGULACIÓN METABÓLICA
POR FOSFÁGENOS DEL INTERCAMBIADOR Na+/Ca2+
DE CORAZÓN BOVINO

12. ¿Qué determina las divergencias en la regulación metabólica del intercambiador Na+/Ca2+ ?
(I) las diferencias en las secuencias primarias entre ambos transportadores
(II) la maquinaria bioquímica propia de cada especie.
(III) Ambas.
Identidad entre las secuencias de a.a. de los intercambiadores Na+/Ca2+
de corazon de vaca (NCX1) y de nervio de calamar (NCX-SQ1)
Total 55 %
Asa regulatoria 40 %
Segmentos TM 67 %
Repeticiones α1- α2 87 %

13. CAPÍTULO III
RELACIÓN ENTRE LA REGULACIÓN
METABÓLICA Y LA MODULACIÓN POR H+
INTRACELULARES DEL
INTERCAMBIO Na+/Ca2+ CARDÍACO
Biol Chem. 2007 ;388(3):281-8
Ann N Y Acad Sci. 2007;1099:171-4

14. Efecto de pH y Mg-ATP sobre el intercambio Na+/Ca2+ en VSCB
Captación de 45Ca2+ Eflujo de 45Ca2+
pH 7.4
Km (uM) Vmx (nmol/s.mg)
- Mg-ATP 1.33 +/ -0.02 0.89 +/- 0.02 Km (uM) Vmx (pmol/3s.mg)
Km (uM) Vmx (pmol/3s.mg)
+Mg- ATP 0.24 +/- 0.01 0.94 +/- 0.04 - -Mg-ATP 1.73 +/ -0.09 200 +/- 99
Mg-ATP 1.73 +/ -0.09 200 +/-
Km (uM) Vmx (nmol/s.mg)
- Mg-ATP 55.8 +/ -13 0.40 +/- 0.03
+Mg- ATP 0.24 +/- 0.01 0.40 +/- 0.02
pH 6.8
Km (uM) Vmx (pmol/3s.mg)
Km (uM) Vmx (pmol/3s.mg)
- -Mg-ATP 13.90 +/-1.4 201 +/- 14
Mg-ATP 13.90 +/-1.4 201 +/- 14
+Mg-ATP 3.75 +/- 0.9 178 +/- 55
+Mg-ATP 3.75 +/- 0.9 178 +/-
pH 7.8
Km (uM) Vmx (nmol/s.mg)
- Mg-ATP 0.24 +/ -0.04 0.88 +/- 0.02 Km (uM)
Km (uM) Vmx (nmol/s.mg)
Vmx (nmol/s.mg)
+Mg- ATP 0.19 +/- 0.02 0.87 +/- 0.01 - -Mg-ATP 0.17 +/ -0.04 181 +/- 99
Mg-ATP 0.17 +/ -0.04 181 +/-

15. Efecto de pH y Mg-ATP sobre el intercambio Na+/Ca2+
en VSCB
(i) la acidificación produce una reducción del intercambio
Na+/Ca2+ (Km ap y Vmax en la captación de Ca2+, mientras que
no afecta Vmax en el eflujo), efecto que es parcialmente
revertido por Mg-ATP.
(ii) la alcalinización muestra un intercambio Na+/Ca2+ basal
similar al observado en presencia de Mg-ATP a pH fisiológico.
En esas condiciones Mg-ATP no produce estimulación.

16. Efecto de pH y Mg-ATP sobre la cantidad de PtdIns-4,5-P2
“unido” a NCX1, en presencia de Ca2+ (1uM)
(A) Western blot anti-PtdIns-4,5-P2.
La misma membrana expuesta a un
anticuerpo monoclonal anti-NCX1.
(B) Cuantificación.
La alcalinización incrementa los niveles de PtdIns-4,5-P2/ NCX1 a valores
comparable a los observados en presencia de Mg-ATP a pH 7.4 y Mg-ATP no
produce ninguna modificación.

17. Efecto del pH en la síntesis “de novo” de PtdIns-4-P y
de PtdIns-4,5-P2 a partir de VSCB y [32P]-γ-ATP
A) B)
A) Fosfo-imagen de una
separación por HP-TLC
PtdIns4P de los fosfoinosítidos
del extracto acido de las
membranas vesiculares
PtdIns-4,5P2
PtdIns-
B) Cuantificación.
ORIGEN
pH 6.8 7.4 7.8
El pH no modifica significativamente la marcacíon de fosfoinosítidos a partir de
[32P]-γ-ATP

18. Efecto del pre- tratamiento con
PtdIns-PLC sobre el intercambio
Na+/Ca2+ a Ca2+ 1uM y distintos pHs
En VSCB pre-tratadas con PtdIns-PLC: (i) a
pH 7.4 y 6.8 no hay estimulación por Mg-ATP
(ii) se anula el incremento de captación de
Ca2+ por alcalinización a pH 7.8
Efecto de PtdIns exógenos sobre
el intercambio Na+/Ca2+ en VSCB
tratadas con PtdIns-PLC a pH 7.8
PtdIns exógeno, re-establece la
estimulación por Mg-ATP
PtdIns-4,5-P2 exogeno mimetiza dicho
efecto.

19. Captación y eflujo de Ca2+ dependientes del gradiente de Na+, en
vesículas tratadas con PtdIns-PLC (pH 7.8) y nativas (pH 7.4).
Los valores de los gráfico representan la media
+/- EE de triplicados (A) para captación de 45-Ca2+
45-
Km (uM) Vmx (nmol/s.mg) o (B) quintuplicados para liberación de Ca2+.
1.33 +/ -0.02 0.89 +/- 0.02
1.24 +/- 0.48 0.88 +/- 0.07
(C) Western blot revelado contra el PtdIns-4,5-P2
(panel superior) y luego de un “stripping”, con un
anti-NCX1 (panel inferior) y su cuantificacion.
Km (uM) Vmx (pmol/3s.mg)
1.73 +/ -0.09 200 +/- 9
1.71 +/- 0.11 190 +/- 9.8 (i) Ambas preparaciones presentan igual
afinidad ap. para el sitio regulatorio de Ca2+.
(ii) El tratamiento con PtdIns-PLC a pH 7.8
disminuye los niveles de PtdIns-4,5-P2
“unido” al NCX1

20. CONCLUSION
En su conjunto estos resultados señalan que el
intercambiador Na+/Ca2+ cardíaco debe estar
simultáneamente de-protonado y tener PtdIns-4,5-P2
“unido”, para presentar la máxima afinidad del sitio
regulatorio por Ca2+i. El incremento en la afinidad
por Ca2+ citosólico producido por aumento del pH
intracelular estaría mediado por un incremento del
PtdIns-4,5-P2 “unido” al NCX1, como consecuencia
de una redistribucion de PtdIns-4,5-P2.

21. DISCUSIÓN GENERAL
La contribución mas trascendente de este trabajo se relaciona
con la interacción entre PtdIns-4,5-P2 y protones que
condiciona la afinidad por Ca2+ del sitio regulatorio
intracelular del intercambiador NCX1. Aquí se brindan, por
primera vez, evidencias del mecanismo involucrado en la
estimulación por alcalinización del intercambiador Na+/Ca2+
cardíaco.

22. POSIBLES SITIOS DE UNIÓN DE PTdIns-4,5-P2 A NCX1
(asa citosólica de NCX cardíaco bobino)
NCX1(B) 250 ADRRLLFYKYVYKRYRAGKQRGMIIEHEGDRPSSKTEIEMDG
5-6
NCX1(B) 291 KVVNSHVDSFLDGALVLEVDERDQDDEEARREMARILKELKQKHPEKEIEQLIELANYQV
4-2
NCX1(B) 351 LSQQQKSRAFYRIQATRLMTGAGNILKRHAADQARKAVSMHEVNTEVAENDPVSKIFFEQ
NCX1(B) 411 GTYQCLENCGTVALTIIRRGGDLTNTVFVDFRTEDGTANAGSDYEFTEGTVVFKPGETQK
NCX1(B) 471 EIRVGIIDDDIFEEDENFLVHLSNVKVSLEASEDGILEASHVSTLACLGSPSTATVTIFD
NCX1(B) 531 DDHAGIFTFEEPVTHVSESIGIMEVKVLRTSGARGNVIVPYKTIEGTARGGGEDFEDTCG
6-7
NCX1(B) 591 ELEFQNDEIVKTISVKVIDDEEYEKNKTFFLEIGEPRLVEMSEKKALLLNELGGFTITGK
NCX1(B) 651 YLYGQPVFRKVHAREHPLPSTIITIADEYDDKQPLTSKEEEERRIAEMGRPILGEHTRLE
6-8
NCX1(B) 711 VIIEESYEFKSTVDKLIKKTNLALVVGTNSWREQFIEAITVSAGEDDDDDECGEEKLPSC
1-2-3
NCX1(B) 771 FDYVMHFLTVFWKVLFAFVPPT 792
Sitio de unión a PtdIns-4,5-P2 Proteínas Referencias
1 FSMDLRTKST(83-92) Profilin Sohn y col., 1995 ; Chaudhary y col., 1998
2 VFNDMKVRK(13-22) Cofilin/ Dextrin Yonezawa y col., 1991
3 KYGIDKDK(EMSl 198-205) Cortactin/EMSI/ HSI He y col., 1998C
4 KCYEMASHLRR(126-136) Profilin Sohn y col., 1995; Chaudhary y col., 1998
5 KGGLKYKAG(112-120) Adseverin/ scinderin Zhang y col., l996
6 RLLHVKGRR(137-146) Severin Eichinger y Schleicher 1992
7 KKL YOYKGKK(137-146) CapG /CapZ/CapB2/Cap32β Yu y col., 1990
8 YNVQRLLHVKGKKNVC(133-147) Gesolin Janmey y col., 1992

23. POSIBLES SITIOS DE UNIÓN DE PTdIns-4,5-P2 A NCX1
REPRESENTACIÓN GRÁFICA
Homología 70-90 % con
secuencias de referencia.
Homología 60-70 % con
secuenciasde referencia.
Adaptado de Schulze y col., 2003.

24. GRACIAS!!!