Metode ekstraksi cepat DNA plasmid menggunakan alkali digunakan untuk mengekstraksi DNA plasmid dari sel bakteri dengan cara yang sederhana. Lisozim dan SDS digunakan untuk memecah dinding sel, sementara NaOH mendegradasi DNA kromosomal. DNA plasmid yang lebih kecil tetap terlarut dan dapat dipisahkan dari DNA kromosomal yang teragregasi dengan sentrifugasi. Metode ini mampu mengekstraksi DNA plasmid dari berbagai ukuran hingga plasmid kosmid yang bes
4. DASAR TEORI
Plasmid banyak digunakan sebagai wahana
kloning. Metode penyiapan DNA plasmid ada
2 yaitu, dengan cara sentrifugasi dan
kromatografi hidroksiapatit. Dimana cara
kedua lebih cepat dan menghasilkan
kemurnian DNA yang lebih tinggi. Namun
pada cara tersebut membutuhkan banyak
sampel. Pada metode ini akan dijelaskan
metode yang lebih sederhana dan
membutuhkan sampel yang sedikit.
Sel yang mengandung plasmid ditambahkan
dengan lisozim untuk dilemahkan dinding
selnya, kemudian di lisiskan dengan SDS dan
NaOH. DNA kromosomal yang memiliki bobot
molekul yang besar terdenaturasi kemudian
ditambahkan asam asetat glasial untuk
menetralkan larutan tersebut. DNA kromosom
ter-renaturasi dan membentuk agregat yang
tidak larut dalam supernatan. Kemudian
diambil supernatan dan ditambahkan etanol
lalu disentrifugasi untuk mendapat pellet
yang berisi plasmid, yang kemudian dianalisis
menggunakan gel elektroforesis.
5. MATERIAL
Cell strains and Media
1. Escherichia coli strain
HB101, SK1592, dan RRI.
2. Escherichia coli strain
GM218 dan JM856.
3. Ampisilin 100 μg/mL untuk
medium padat dan 40 μg/mL
untuk disk.
4. Tetrasiklin 10 μg/mL untuk
media agar
Ekstraksi plasmid
1. Tube polipropilen Eppendorf
1,5 mL.
2. Bench-top sentrifugasi.
3. Rak berisi 60 tube Eppendorf.
4. Pipet Pasteur.
Reagen :
1. Larutan lisozim 2mg/mL (LI).
2. Larutan alkali SDS (LII).
3. Larutan garam tinggi (LIII).
6. METHOD
Prosedur standar untuk ekstraksi
Digunakan plasmid pBR322 dan E.coli strain
HB101, RRI, dan SK 1592 ; dipilih klon yang
sudah disisipi hind III pada plasmid pBR322
yang tumbuh pada media LB cair; diinkubasi 18
jam.
Dipindahkan 0,5 mL kultur ke tube eppendorf
untuk ekstraksi plasmid, sisanya disimpan pada
suhu -200C setelah ditambah gliserol ;
disentrifugasi tube 15 detik
Dibuang supernatan, diresuspensi pelet dengan
100 μL larutan I; setelah 30 menit, ditambah
200 mL larutan II dan divorteks; tube disimpan
dalam suhu 00C selama 5 menit; ditambah 150
μL larutan III
7. Tube dipertahankan pada suhu 00C selama 60
menit untuk memungkinkan protein, RNA dengan
berat molekul besar, dan DNA kromosom
mengendap; disentrifugasi 5 menit
4/10 mL supernantan dibuang dan dipindahkan
ke tube ke-2; ditambahkan 1 mL etanol dingin
pada suhu -200 C selama 30 menit ;
disentrifugasi selama 2 menit; supernatan
dibuang.
Pelet dilarutkan dalam 100 μL natrium asetat 0,1
M/Tris-Hl 0,05 M (pH 8); ditambahkan 2 mL
etanol dingin; disentrifugasi
Pelet dilarutkan dalam 40 μL air; ditambahkan
10 μL dari sampel buffer; 10-20 μL
diaplikasikan ke dalam gel agarosa untuk
analisis elektroforesis.
8. Modifikasi yang perlu dilakukan ketika DNA plasmid akan
digunakan untuk transformasi
Diresuspensi pelet pada tahap terakhir dalam
100 μL natrium asetat 0,1 M/Tris-Hl 0,05 M (pH
8); diendapkan dengan 2x volume etanol;
Untuk transformasi, pelet dilarutkan dalam 40 μL
air atau bufer encer, ditambahkan beberapa
mikroliter sel kompeten.
Untuk analisis enzim restriksi, pelet dilarutkan
dalam 36 μL H2O dan 4 μL pankreas RNase (1
mg/mL)
Setelah 30 menit, diinkubasi pada suhu 370 C;
ditambahkan enzim restriksi sehingga terjadi
proses digesti.
9. Gel Elektroforesis
Digunakan 0,8% gel agarose.
Buffer elektroforesis mengandung 40 mM Tris,
20 mM sodium asetat, 2 mM EDTA, asam asetat
pH 7.8, 5 x sampel buffer berisi 25% sukrosa, 5
mM sodium asetat, biru bromofenol 0.05%, dan
SDS 0.1%.
Diwarnai dengan etidium bromid 1 μg/mL;
diamati di bawah lampu UV.
10. HASIL & PEMBAHASAN
1. Perlakuan DNA plasmid dengan alkali
Pada metode ini, DNA kromosom
terdenaturasi pada pH basa (diatas pH 13,
denaturasinya irreversible) pergerakan
plasmid diamati secara elektroforesis (gambar
1).
Pita 1 : DNA kromosomal
Pita 2 : pBR322 dimer
Pita 3 : pBR322 OC
Pita 4 : CCC
Pita 5 : denaturasi irreversibel
Pita 6 : Daerah RNA yang memiliki bobot
molekul kecil.
Pergerakan DNA tersebut, menunjukkan pola
gel elektroforesis.
11. 2. Skrining ukuran plasmid rekombinan
dengan menggunakan metode ekstraksi
alkali.
Untuk mengkarakterisasi plasmid
rekombinan, dilakukan dengan menetapkan
ukurannya. Jika fragmen DNA mengandung
DNA asing, maka ukurannya bisa diperkirakan
yaitu dengan elektroforesis gel agarosa untuk
membedakan plasmid rekombinan utuh atau
yang terpotong.
3. Digesti
Digesti enzim restriksi merupakan metode
penting kedua untuk mengkarakterisasi
plasmid rekombinan, untuk melakukan
metode ini digunakan DNA dengan kemurnian
yang tinggi.
12. 4. Transformasi
Sering digunakan untuk transfomasi plasmid DNA dari satu sel ke bakteri yang lain. Ekstrak
dipreparasi bedasarkan prosedur yang telah dideskripsikan dimana mengandung DNA yang
berguna untuk transformasi. Rapoport et. Al. (19) telah menggunkaann versi metode yang
sebelumnya untuk tujuan ini, mereka menemukan dalam beberapa kasus efektifitas yang cukup
rendah. Hasil dari transformasi ditingkatkan dengan prosedur pembilasan yang telah
dideskiripsikan pada material dan metode. Kita dapat menemukan ekstrak pBR322,
mentransformasikan sel kompeten HB101 pada tingkatan kemurnian pBR322 yang tinggi.
13. 5. Preparasi plasmid DNA skala besar
Plasmid rekombinaan dipreprasai dengan teknik "cosmid", diperkirakan panjangnya 38-52
kbp. Peneliti menguji metode ekstraksi alkali untuk melihat apakah plasmid DNA dapat
diaplikasikan pada rentang ukuran tersebut. DNA E.coli sebagian didigesti dengan Hind III
yang disisipkan ke dalam plasmid pHC79. Pengemasan DNA yang telah di ligasi dan di
transduksi dilakukan secara in vitro pada E. coli strain SF8. DNA kemudian diperiksa dengan
elektroforesis gel agarosa secara langsung atau setelah di digesti dengan Hind III. DNA
cosmid yang lurus yang dihasilkan dari digesti Hind III bermigrasi pada tingkat yang sangat
dekat dengan fragmen 7,0 kbp. Meskipun digesti dengan enzim restriksi tidak selesai pada
percobaan ini, tetapi cukup bukti bahwasanya plasmid yang besar dapat dipreparasi dengan
metode ekstraksi alkalin. Hasil uji pendahuluan menunjukkan bahwa plasmid F' (60 - 120 x
106 dalton) dapat juga diekstraksi dari strain E. coli yang cocok.
14. KESIMPULAN
Dari penelitian ini, plasmid berhasil diekstraksi tanpa memerlukan kemurnian yang tinggi.
Metode yang digunakan cukup sederhana dan reprodusibel.
Screening ukuran plasmid rekombinan baru dapat digunakan untuk mengkarakterisasi plasmid
baru, mendeteksi plasmid rekombinan tanpa membutuhkan penanda spesifik.
Dengan metode ini, panjang DNA superkoil dapat dianalisis lebih baik dibandingkan DNA linear
pada molekul dengan BM yang besar.
Dengan metode ini DNA plasmid dengan kemurnian yang sedang dapat didigesti dengan enzim
restriksi.
