Apoptosis pathways, heat shock proteins, caspase dipendente apoptosis, caspase indipendent apoptosis, anoikisis.

1. VIE BIOMOLECOLARI
DELL’APOPTOSI
Le Heat Shock Proteins
Acquisizioni di biologia molecolare ed
eventuali applicazioni in
terapia medica.
26 Settembre 2005
Patologia Clinica
Dott. Stefano Mancini

2. Le fasi dell’apoptosi
I.
INDUZIONE
Include diversi meccanismi:
-recettori di superficie
-via mitocondriale;
-altre vie (es. ER).
II. PREPARAZIONE
Comprende l’attivazione di iniziatori del processo quali le
caspasi iniziatrici ed altre chinasi/fosfatasi.
III. ESECUZIONE
Detta anche “fase di morte”, coinvolge prevalentemente le
caspasi effetrici.

3. Le fasi dell’apoptosi
 Signaling phase
Death receptors: TNF-alfa, Fas(Apo1/CD95), FADD.
Physiological inducers: ROS, Ca++, JNK/SAPK activation.
Protease activators: granzymes, calpains, cathepsins,
proteasome.
 Preparation phase
Initiator caspase: caspase-8, caspase-9, caspase-10,
caspase-12.
Physiological inducers: Bax, ROS, MMPT, cytochrome c,
apoptosome.
Nucleases: AIF, endonuclease G, PARP.
 Execution phase
Effector caspase: caspase-3, caspase-6, caspase-7.
Physiological changes: membrane blebbing, apoptotic
body formation, DNA fragmentation.

4. Esistono diverse vie per
l’apoptosi
 Apoptosi caspasi-dipendente
 Apoptosi caspasi-indipendente
 Anoikisi
Le HSP possono intervenire in tutte queste
vie ostacolando o facilitando l’apoptosi.

6. Diagram showing the role of
heat-shock proteins and a
chaperonin
in protein folding. As the
ribosome moves along the
molecule of
messenger RNA, a chain of
amino acids is built up to form
a new
protein molecule. The chain is
protected against unwanted
interactions
with other cytoplasmic
molecules by heat-shock
proteins and a
chaperonin molecule until it
has successfully completed its
folding.

7. Classi di HSP nei mammiferi
5 maggiori famiglie di
HSP coinvolte nella
risposta a stress
cellulari:
-HSP 27
-HSP 60
-HSP 70
-HSP 90
-HSP 104

8. Regolazione
La sintesi è finemente regolata a livello
trascrizionale da Heat Shock Factors (HSF).
HSF 1 fa parte dei principali regolatori.

9. HSF-1
In forma monomerica nelle cellule quiescenti, è
legato da HSP-90 e -70.
Sotto stress le HSP si separano da HSF-1 il
quale migra nel nucleo come trimero.
Si lega così al DNA nella sequenza consenso in
modo da avviare la sintesi di HSP.

11. Apoptosi caspasi-dipendente
 Siti dei segnali di induzione
Membrana citoplasmatica
Citosol
Nucleo
Mitocondri
Reticolo endoplasmatico
 Effettori
Caspasi
Nucleasi
Transglutaminasi

12. Apoptosi caspasi-dipendente
 Membrana citoplasmatica
L’espressione di HSP-70 inibisce l’apoptosi Fasmediata.
Tuttavia l’iperespressione di HSP-70 non protegge
le cellule Jurkat dall’apoptosi.

14. Apoptosi caspasi-dipendente
 Membrana citoplasmatica
L’inibizione di HSP-90 attraverso oligonucleotidi
antisenso favorisce l’apoptosi in cellule di
neuroblastoma sottoposte a stress termico. Ciò
favorisce inoltre l’attivazione del death domain,
facilitando così la morte cellulare programmata.

15. Apoptosi caspasi-dipendente
 Membrana citoplasmatica
Diverse HSP (es. HSP-70) migrano sulla superficie
cellulare quando il processo apoptotico è già
avviato. Questo rende le cellule più facilmente
riconoscibili dai fagociti.

16. Apoptosi caspasi-dipendente
 Citosol
Le HSP di basso PM (es. HSP-27) sono fosforilate
in vivo dalla MAPKAP chinasi-2, la quale è a sua
volta attivata da una fosforilazione mediata dalla
p38 chinasi.
HSP-27 fosforilata è capace di interagire con
Daxx, una proteina contenente un death domain.
Il legame con Daxx previene l’attivazione di Ask-1,
una serina/treonina chinasi capace di indurre
apoptosi attraverso la via mediata da Fas.

17. Apoptosi caspasi-dipendente
 Citosol
HSP-72 è un inibitore diretto di Ask-1, favorendo la
sopravvivenza della cellula in seguito a stress
ossidativo.
L’espressione di HSP-72 induce inoltre inibizione
di JNK (c-Jun N-terminal kinase, famiglia delle
protein-chinasi indotte da stress).

19. Apoptosi caspasi-dipendente
 Citosol
HSP-105a è capace di legare JNK, provocando
inibizione della apoptosi in linee cellulari PC12
sottoposte a diversi stressor ambientali.
Tuttavia, l’espressione di HSP-105a favorisce
l’apoptosi mediata da danno ossidativo in cellule di
embrione di topo.

20. Apoptosi caspasi-dipendente
 Citosol
HSP-90 è capace di modulare Raf1.
Se Raf1 è legato a HSP-90 è incapace di avviare
l’apoptosi.
Viceversa, la dissociazione del complesso
HSP90/Raf1 avvia la morte cellulare programmata
in mastociti e in linfociti-B.

21. Apoptosi caspasi-dipendente
 Nucleo
Le HSP giocano un ruolo fondamentale nel
prevenire l’apoptosi prodotta da lesioni nucleari.
HSP-27 e -70 migrano nel nucleo a seguito di
stress ossidativo.
HSP-72 compare nel nucleo di cellule alveolari
umane L-132 a seguito di danni al DNA prodotti da
acido dimetilarsenico.

22. Apoptosi caspasi-dipendente
 Nucleo
HSP-90 interagisce direttamente con la telomerasi
stimolandone l’attività. Si è visto che HSP-90 può
facilitare la sopravvivenza cellulare nel carcinoma
della prostata.

23. Apoptosi caspasi-dipendente
 Mitocondri
Possiedono un ruolo centrale nello svolgimento
del processo apoptotico.
Molti segnali proapoptotici convergono nella
permeabilizzazione della membrana esterna.
Ciò provoca la traslocazione e multimerizzazione
della proteina Bax (B-cell lymphoma-2 protein
associated X protein) all’interno del mitocondrio.

24. Apoptosi caspasi-dipendente
 Mitocondri
Bax a sua volta induce la permeabilizzazione della
membrana interna.
Altri fattori: -Smac/DIABLO (second mitocondriaderived activator of caspases), è
capace di inibire IAP;
-IAP (inhibitors of apoptosis protein),
ad es. XIAP, c-IAP1 e c-IAP2;
-HtrA2/Omi, inibisce IAP.

26. Apoptosi caspasi-dipendente
 Mitocondri
HSP-27 lega il citocromo-c prevenendo l’interazione
citocromo-c-mediata tra Apaf-1 e procaspasi 9,
interferendo quindi con l’apoptosi.
Studi successivi hanno dimostrato la localizzazione di
HSP-27 nel mitocondrio a trattenere il citocromo-c.
HSP-27 inibisce anche il rilascio di Smac/DIABLO ed
è in grado di legare alcuni RNA inibitori dell’apoptosi al
fine di impedirne la degragdazione.

27. Apoptosi caspasi-dipendente
 Mitocondri
HSP-60 e la sua co-chaperone HSP-10 sono capaci di
legare la procaspasi-3 a livello mitocondriale.
Viceversa, HSP-60 citoplasmatica sembra sequestrare
alcuni fattori proapoptotici quali Bax o Bak.
HSP-70 sopprime l’apoptosi direttamente
associandosi ad Apaf-1 e impedendo il normale
assemblaggio dell’apoptosoma.

28. Apoptosi caspasi-dipendente
 Mitocondri
Al contrario HSP-105a, un omologo di HSP-70,
favorisce l’apoptosi inducendo il rilascio del
citocromo-c, l’attivazione della caspasi-3 e la
dissociazione della PARP (poly-ADP ribose
polymerase) in cellule embrionali di topo.
HSP-90 lega direttamente Apaf-1 e previene la
formazione dell’apoptosoma.

29. Apoptosi caspasi-dipendente
 Reticolo endoplasmatico (RE)
Interviene nell’apoptosi in almeno due modalità:
-in risposta a proteine alterate;
-con alterazioni della permeabilità al Ca++.
Recenti studi suggeriscono il coinvolgimento
delle proteasi del RE, come le caspasi 7 e 12.
La risposta ad alterazioni proteiche induce
inoltre il fattore di trascrizione CHOP/GADD153
il quale promuove l’apoptosi.

30. Apoptosi caspasi-dipendente
 Reticolo endoplasmatico (RE)
Grp78, appartenente alle HSP-70, sembra inibire
direttamente l’apoptosi RE mediata attraverso il
legame delle caspasi 7 e 12.
Grp78 è stata anche associata all’attivazione del
fattore NF-kB e all’inibizione dei disturbi del flusso
del Ca++.

31. Apoptosi caspasi-indipendente
Prevede l’entrata in gioco di mediatori che
agiscono in parallelo all’attivazione delle
caspasi.
E’ ovvio che le vie possono talora convergere.
Sono interessati i seguenti fattori:
-granzimi;
-catepsine;
-calpaine;
-ceramide;
-AIF (apoptosis-inducing factors).

32. Apoptosi caspasi-indipendente
 Granzimi
Famiglia di serin-proteasi spesso associati alle
perforine nei linfociti T attivati e nelle cellule NK.
Granzima B è fra i più rappresentati nell’uomo.
In vivo amplificano le vie apoptotiche caspasidipendenti, ma possono anche indurre l’attivazione
della proteina Bid senza coinvolgere il
reclutamento delle caspasi.
Bid produce alterazioni della membrana
mitocondriale e il rilascio del citocromo-c.

34. The Granzymes are serine protease family members structurally related to
Chymotrypsin and exhibit the characteristic catalytic triad His-Asp-Ser at the
active site.76 They are key components of the lytic granule, and are
responsible for initiating many of the apoptosis-associated events that occur
in cells targeted for destruction by cytotoxic cells.

35. Apoptosi caspasi-indipendente
 Granzimi
Ancora poco chiare sono le interazioni con le HSP.
HSP-70 espresso a livello di membrana interviene
nell’apoptosi di cellule tumorali attraverso il
legame e trasporto del granzima B.

36. Apoptosi caspasi-indipendente
 Catepsine
Classe di enzimi proteolitici contenenti vari tipi di
proteasi: cistin-proteasi (catepsine B,C,L,H,S e O),
aspartato proteasi (catepsine D,E e F) e serinproteasi (catepsina G).
Hanno origine nei lisosomi.
La catepsina B è rilasciata dai lisosomi di epatociti
trattati con TNF-alfa o nell’apoptosi indotta da p53.
La sua attivazione viene prevenuta da NF-kB.

37. Apoptosi caspasi-indipendente
 Catepsine
Relazione con le HSP ancora da approfondire.
HSP-73 e HSP-90 si accumulano in lisosomi di
cellule epiteliali tubulari di rene di topi trattati con
alte dosi di gentamicina.

38. Apoptosi caspasi-indipendente
 Calpaine
Proteasi calcio-dipendenti implicate
nell’organizzazione del citoscheletro e nella
degradazione preoteica.
Esistono come eterodimeri formati da una piccola
subunità regolatrice e una delle tre grandi subunità
catalitiche: calpaina-1, -2 e -3.
Agiscono spesso in sinergia con le caspasi,
soprattutto nel neurone.

39. Apoptosi caspasi-indipendente
 Calpaine
In diversi tumori (mammario e ovarico) così come
nell’apoptosi cisplatino-mediata del melanoma le
calpaine hanno un ruolo chiave.
Le calpaine attivano infatti Bid indipendentemente
dalla attivazione delle caspasi.
Grp-94 sembra inibire l’apoptosi mediata dalle
Calpaine in diverse situazioni quali stress da
ipossia/riossigenazione e apoptosi etoposidemediata.
Il cisplatino può legare Grp-94 inibendolo.

40. Apoptosi caspasi-indipendente
 Ceramide
Mediatore lipidico formato da sfingosina Nacetilata capace di indurre l’apoptosi attraverso
varie strade:
-caspasi dipendenti: attivazione caspasi-9 e -3;
-catepsine dipendenti;
-calpaine dipendenti.
L’apoptosi ceramide mediata può essere inibita da
Bcl-2.
HSP-70 protegge la cellula dall’apoptosi indotta da
ceramide.

41. Ceramide leads to loss of mitochondrial transmembrane potential (DYm).
Translocation of Bax to mitochondria, activation of Bax and release of
cytochrome c are all late events in this form of apoptosis. Loss of DYm is
illustrated as the thin black lines surrounding the mitochondria.

42. Apoptosi caspasi-indipendente
 AIF-Apoptosis Inducing Factors
Mediatori di recente identificazione, traslocano dai
mitocondri al citosol e al nucleo.
AIF nucleari inducono la condensazione della
cromatina e la frammentazione del DNA.
Bcl-2, Hsp-70 e Hsc-70 inibisce la migrazione di
AIF al nucleo.
La deplezione di Hsp-70 attraverso oligonucletidi
antisenso sensibilizza le cellule all’apoptosi AIF
mediata.

43. Anoikisi
“Senza casa”: apoptosi indotta dalla mancanza di
segnali intercellulari e/o di connessioni con la
matrice extracellulare.
Predominante è la via Fas-mediata che conduce
quindi all’apoptosi caspasi-dipendente.
Tuttavia presenta anche altre vie di induzione.

44. Anoikisi
Vie “alternative”:
-reclutamento diretto della caspasi-8 da recettori
per le integrine;
-FADD (Fas-associated death domain protein)
può essere attivato da alterazioni del
citoscheletro che inducono il rilascio di “recettori
di morte” (death receptors) che si trovavano in
uno stato di sequestro.
HSP-27 fosforilato, HSP-70 e -90 stabilizzano le
integrine nei trombociti.

45. Anoikisi
HSP-27 fosforilato sembra inibire il potenziale
metastatico del melanoma mentre HSP-60 attiva
un’alfa3beta1-integrina coinvolta nell’adesione di
cellule metastatiche di ca. mammario a linfonodi e
osteoblasti.
BAG, una co-chaperone di HSP-70/HSC-70, lega
e sequestra FADD, inibendo così l’anoikisi.
Molti tumori metatstatici sembrano avere alta
espressione di BAG.

46. Considerazioni finali
Il processo apoptotico è finemente regolato e le
HSP svolgono un ruolo fondamentale nella sua
evoluzione, talvolta favorendo altre volte
ostacolando l’apoptosi.
La biologia molecolare sta mettendo in luce come
sia fondamentale capire nel dettaglio i passaggi
che conducono alla morte o alla sopravvivenza di
una cellula al fine di poter sperimentare nuove
strategie terapeutiche.
Le HSP si propongono come un possibile
importante bersaglio visto il loro ruolo chiave nei
processi cellulari.

47. Alcuni esempi
HSP-27 aumenta la ‘aggressività di cellule di ca.
colico mentre HSP-70 è altamente espresso in
tumori della mammella nella donna.
HSP-90 è implicato nella aggressività del ca.
prostatico.
Le HSP vengono espresse da molte cellule
tumorali a livello di membrana e possono agire da
adiuvanti del sistema immunitario aspecifico.