Amostragem e rastreabilidade de OGMs

AMOSTRAGEM E RASTREABILIDADE

Débora Pires Paula
Controle Biológico
Laboratórios de Ecologia e Biossegurança e Bioquímica e Biologia Molecular
debora.pires@embrapa.br

AMOSTRAGEM

Estudo de um pequeno grupo de elementos, considerado idôneo, retirado de uma
população que se pretende conhecer, com margem de erro aceitável.

Pré-liberação comercial Pós

Caracterização do OGM
Amostragem
Fluxo de genes Fiscalização MAPA

Organismos não-alvo
Monitoramento pós-liberação comercial
Segurança alimentar

Critérios ideais para amostragem

- Grupo controle (comparador – isolínea – e linhagens de referência) (EFSA, 2008)
no mesmo estágio fisiológico, idade e condições ambientais.

- Número de repetições (importância do experimento piloto). Determinação do
número ideal baseada no estudo caso-a-caso.

- Réplicas múltiplas temporal e espacial para capturar uma série de interações
entre ambiente vs gene (pressões bióticas e abióticas) (p.18, Codex 2003).

- Reprodutibilidade (importância de aliquotar e preservar amostras).

- Boas Práticas de Laboratório (BPL) (OECD, 1998).

Boas Práticas de Laboratório (BPL) tratam da organização, processo e das condições
sob as quais estudos de laboratório são planejados, executados, monitorados,
registrados e relatados. As BPL têm como intenção promover a qualidade e validação
dos resultados de pesquisa (OECD, 1998).

- Análise estatística descritiva e inferencial.

Exemplo 1:
Milho com alto teor de lisina (LY038), o OGM e seu comparador em cinco locais diferentes
(Reynolds et al., 2004), porém apenas comparou um único ano.

A: Isolínea vs linhagens de referência. A B: Os componentes individuais "C", "M" e
isolínea é a linhagem mais estreitamente "Y“ são também comparados ao OGM e
relacionada ao OGM teste e deve ser sua isolínea para determinar se o OGM e
cultivada conjuntamente com o OGM em a isolínea estão fora do intervalo do
vários locais e anos (pS9, EFSA 2008). parâmetro estudado relatado para as
culturas convencionais com um histórico
de uso seguro.

Exemplo 2 (fictício):

Deseja-se averiguar se joaninhas são afetadas pela uma proteína exógena X

ESTUDO : Comparação do número médio de ovos eclodidos das joaninhas
alimentadas com pulgões, entre plantas que expressam uma proteína X (GM) e que
não a expressam (isolínea ou linhagens de referência)

Slide adaptado da aula
“Experimentação e Estatística”,
Dra. Joseane Padilha, Cenargen

Antes de tudo precisamos formular as hipóteses a serem testadas:

M1 = Número médio de ovos eclodidos ao consumir pulgões das plantas GM

M2 = Número médio de ovos eclodidos ao consumir pulgões das plantas não-GM

Hipótese do pesquisador (Hipótese Nula) H0 (Usual testar a igualdade)
H0: M1 = M2

A média de ovos eclodidos é estatisticamente
equivalente quando as joaninhas se alimentam de pulgões das plantas GM e não-GM

Hipótese alternativa (“contra-hipótese” ) H1
H1: M1 ≠ M2

A média de ovos eclodidos é estatisticamente
é diferente quando as joaninhas se alimentam de pulgões das plantas GM e não-GM

Slide adaptado da aula “Experimentação e Estatística”, Dra. Joseane Padilha, Cenargen

Montagem do experimento

Do lado direito de uma casa-de-vegetação colocou-se um vaso com a planta (idade = 2 meses)
que expressa a proteína X (T1);

Do lado esquerdo da estufa colocou-se um vaso com a planta (idade = 1 ano)
que não expressa a proteína X (T2);

Em cada planta foram colocadas 2 joaninhas e 2 pulgões;

Unidade experimental: planta

• 24 horas depois, observou-se em T1 o número de ovos eclodidos pelas joaninhas;

• 48 horas depois, observou-se em T2 o número de ovos eclodidos pelas joaninhas;

P1 P2

RESULTADO:
Planta 1 Planta 2
Joaninha1 30 60
Joaninha2 100 120 Variabilidade experimental
Média 65 90 “Erro experimental”
Desvio 49 42
CV% 76 47

O coeficiente de variação (C.V.) é o desvio padrão expresso como uma
porcentagem média.

Quão homogênea
DESVIO PADRÃO é a amostra
s
CV  
*100%
x MÉDIA
Baixa dispersão: CV  15% Depende muito
Média dispersão: CV 15-30% da área pesquisada
Alta dispersão: CV  30%

Conclusão do pesquisador: O número médio de ovos eclodidos é significativamente
maior para as joaninhas não expostas a proteína.
Posso confiar???

Influência da variabilidade experimental no teste
de hipótese
 Média do Grupo 1
d1
Di  Distância de cada ponto em relação a média d6
d2
d5 d3
 Média do Grupo 2 d4
Di  Distância de cada ponto em relação a média
d3
d4 d2
Uso um valor para representar as repetições
de todo o grupo.
d5
d1
d6

Esse ponto deve ser acompanhado de uma medida
que demonstre o quanto ele é confiável.
uma soma
Esse acompanhante pode ser a média das distâncias di
de quadrados
(d1)2 + (d2)2 +...+(d6)2/(6-1)
Slide da aula “Experimentação e Estatística”, Dra. Joseane Padilha, Cenargen

Para comparar esses dois grupos, decompomos a variabilidade em duas partes:

Parte que mede o efeito real
dos grupos + Parte que contém aquilo que não é possível
controlar no experimento
ERRO (RESIDUO)

SOMA DE QUADRADOS DOS SOMA DE QUADRADOS DOS
TRATAMENTOS RESÍDUOS

(PARTE 1) (PARTE 2)

PARTE1 Se isso for muito grande, indica que meus tratamentos diferem
PARTE2

PARTE1 Se for pequeno, indica que os tratamentos não diferem
PARTE2 significativamente que a diferença é por conta do acaso.

COM BASE NESSAS OBSERVAÇÕES
REJEITAMOS OU NÃO A HIPÓTESE TESTADA.

Se esforços não forem feitos no sentido de controlar ao máximo as possíveis
causas de variabilidade do experimento podemos cometer erros graves, como:

Falar que as joaninhas são afetadas pela
proteína X quando na verdade não são! Falar que as joaninhas
não são afetadas pela
proteína X quando na verdade são!


Em suma....
Podemos controlas as causas de variação de um experimento, através de:

• Repetição de unidades experimentais;

• Uniformidade da amostra;

• Casualização dos indivíduos experimentais aos
tratamentos;

• Uniformidade do meio;

• Uniformidade na aplicação de tratamento.


Número de Repetições

Deve-se saber que esse número depende de vários fatores:
 variabilidade do meio em que se realiza o experimento;
número de tratamentos em estudo;
 recursos financeiros, físico, humano, etc.

Na Literatura, existem vários métodos para determinar o número ótimo de repetições:

Ensaios de uniformidade;
Métodos de simulação;
Métodos baseados em ensaios anteriores;
Curvas características de operação;
 Alguns usam a fórmula:

Tais meios são trabalhosos e nem sempre chegam a resultados satisfatórios.


Uma regra prática, que tem surtido bons resultados na experimentação agrícola e
zootécnica, é a de que os ensaios devem ter, no mínimo, 20 parcelas e/ou 10
graus de liberdade para o resíduo ou erro experimental.

Voltando em nosso exemplo...
Vamos supor que o experimento foi feito em esquema inteiramente casualizado (DIC),
são dois tratamentos, então...

Lembrando que os G.L do resíduo no DIC é kr – k, então:

kr – k ≥ 10
2r ≥ 12
r≥6

Para cada tratamento usar pelo menos 6 plantas.

E o número de Joaninhas e Pulgões????


Podemos usar a ferramenta de amostragem aleatória simples (AAS)

desvio padrão valor da variável normal padrão associado
ao grau de confiança adotado

 SZ 
2 90% = 1.645

n 
95% = 1.96
99% = 2.58
 E 
Amostragem é o erro permissível
Aleatória
Simples
para
a média Então, o tamanho da amostra
(AAS) irá depender, além da variabilidade dos
dados, do erro que o pesquisador permite
cometer e do grau de confiança adotado.


Exemplo de aplicação da AAS
Vamos supor que em experimentos passados detectou-se que em média
as joaninhas apresentaram uma variabilidade em torno de 25 ovos eclodidos.
E que o pesquisador quer ter 90% de confiança que seu erro de estimativa (E) seja
de no máximo 5. Quantas Joaninhas serão necessárias?

2
 1.645  (25) 
n   70
 5 
Seriam necessárias 70 joaninhas.


Outras Técnicas de amostragem
• Vimos que quanto mais heterogênea uma população maior será a exigência
quanto ao tamanho amostral.

Então, se a população for muito heterôgenea, teremos :

+ =
SOLUÇÃO:

PODEMOS HOMOGENEIZAR A POPULAÇÃO:
DIVIDIR EM ESTRATOS HOMOGÊNEOS

AMOSTRAGEM ESTRATIFICADA


AAS
Divido a população
em estratos homogêneos

AAS
AAS
+ + =n

Nossa amostra!!!
População Heterogênea

Em cada estrato posso fazer uma amostragem aleatória simples (AAS)!


Outras técnicas (não muito utilizadas nas Ciências Biológicas) ...

• Amostragem Sistemática

• Amostragem por Conglomerados


Exemplo 3: Caso do algodão Bt Bollgard Evento 531 Monsanto – Março 2005

“(...) Diante do exposto, a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança – CTNBio após a
análise de biossegurança do algodão Bollgard evento 531, processo 01200.001471/2003-
01, delibera favoravelmente à sua liberação para plantio comercial e consumo humano e
animal, mediante as condicionantes: (i) a Monsanto do Brasil Ltda., empresa detentora da
tecnologia Bollgard, deverá fornecer as seqüências dos iniciadores (primers) para
detecção de evento específico aos órgãos de registro e fiscalização; (ii) respeitar as
zonas de exclusão para o plantio de algodão geneticamente modificado, conforme
proposto por Barroso e Freire (2004) e definir e limitar a época de plantio do algodão
Bollgard evento 531 nas diferentes regiões produtoras de algodão, principalmente em
localidades com cultivos de algodão safrinha; (iii) deverão ser preconizadas áreas de
refúgio com cultivares não transgênicas de algodão correspondentes a 20% da área a ser
cultivada com o algodão Bollgard evento 531, localizadas a distâncias inferiores a 800 m;
(iv) adotar práticas de manejo conservacionista da cultura do algodoeiro, tais como a
destruição da soqueira, a queima para controle de doenças, a rotação de culturas, o
emprego de culturas armadilhas e o controle biológico. Aos órgãos de fiscalização
competentes cabe garantir o cumprimento das exigências contidas no Parecer Técnico
Prévio Conclusivo, principalmente aquelas relativas às áreas de refúgio e zonas de
exclusão. Não há restrições ao uso do OGM em análise e seus derivados, desde que
obedecidas as exigências contidas no Parecer Técnico Prévio Conclusivo. Assim sendo,
a CTNBio considera que essa atividade não é potencialmente causadora de significativa
degradação do meio ambiente e da saúde humana. (...)”

RASTREABILIDADE

Cadeia logística de informação sobre determinado produto que permite conhecer o histórico de
produção (matérias-prima, local, circunstância, intervenientes), os processos de recepção,
armazenamento, produção e expedição até comercialização (cadeia de distribuição).

Indústria agro-alimentar

Objetivos:

* Informar os consumidores graças à rotulagem de produtos derivados de OGM

* Criar uma rede de segurança baseada na rastreabilidade dos produtos em qualquer
fase da produção e colocação no mercado

A rede de segurança permite o controle e verificação das alegações nutricionais feitas
nos rótulos, o acompanhamento dos potenciais efeitos na saúde humana e no ambiente
e a retirada de produtos do mercado, se for verificado um risco imprevisto para a saúde
humana ou para o ambiente.

A rastreabilidade dos OGM abrange tanto produtos ou elementos de produtos, inclusive
sementes, quanto dos produtos destinados à alimentação humana ou animal
produzidos a partir de OGM.

Rotulagem de OGM no Brasil: Decreto 4680/03, IN 1 e 22, Portaria 2658/03

“Art. 2º - Na comercialização de alimentos e ingredientes alimentares destinados ao
consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de OGMs, com
presença acima do limite de 1% do produto, o consumidor deverá ser informado da
natureza transgênica do produto.
(...)
- Os alimentos e ingredientes produzidos a partir de animais alimentados com ração
contendo ingredientes transgênicos deverão ser rotulados (rastreabilidade).”

União Européia
Garante a rastreabilidade e a rotulagem dos organismos geneticamente modificados e dos
produtos produzidos a partir de OGM ao longo de toda a cadeia alimentar.

As regras de rastreabilidade aplicam-se a todos os OGM; consequentemente, os
pedidos de OGM destinados à alimentação humana ou animal (Regulamento
1829/2003/CE) devem respeitá-las, tal como os pedidos de OGM destinados a cultivo
(Directiva 2001/18/CE, parte C).

No caso dos produtos destinados à alimentação humana ou animal, incluindo os
destinados diretamente à transformação, os vestígios de OGM continuarão a ser
isentos da obrigação de rotulagem se não ultrapassarem o limite máximo de 0,9% e
se a sua presença for involuntária e tecnicamente impossível de evitar.

Os Estados-Membros asseguram a aplicação de medidas de inspecção e de controle
dos produtos, incluindo o controle por amostragem e as análises quantitativas e
qualitativas dos alimentos.

Sites sobre OGM e Biossegurança

Comissão Técnica Nacional de Biossegurança
http://www.ctnbio.gov.br/

Biosafety Clearing House (BCH):
http://bch.cbd.int/

European Food Safety Authority (EFSA):
http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_home.htm

Codex Alimentarius:
http://www.codexalimentarius.net/web/index_en.jsp

Biosafety Assessment Tool (BAT):
https://bat.genok.org/bat/

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