Contribution à l’étude phytochimique.pdf

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24/01/2023
Contribution à l’étude phytochimique des
extraits d’une plante médicinale
(Zilla Spinosa L.)
Dr. Rim MECHERI
Dr. Rim.mechri@gmail.com

Table des matières
Introduction ................................................................................................................................ 1
Matériels et méthodes................................................................................................................. 3
Screening phytochimique ....................................................................................................... 3
Réactifs ............................................................................................................................... 3
Méthodes............................................................................................................................. 4
Extraction.............................................................................................................................. 11
Matériels ........................................................................................................................... 11
Réactifs ............................................................................................................................. 11
Méthodes........................................................................................................................... 11
Méthodes chromatographiques analytiques.......................................................................... 12
Chromatographie sur couche mince (CCM) ..................................................................... 12
Purification par HPLC analytique..................................................................................... 12
Purification par HPLC préparative ................................................................................... 13
Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire(RMN)............................................. 14
Spectroscopie de Masse SM ............................................................................................. 15
Spectroscopie de Masse HPLC-MS/MS........................................................................... 16
Identification LCMS/MS .................................................................................................. 17
Résultats ................................................................................................................................... 19
Discussion ................................................................................................................................ 48
Conclusion................................................................................................................................ 49
Références bibliographiques .................................................................................................... 50

Liste des photos
1. Protocole de mise en évidence de la présence des saponosides et calcul d’indice de
mousse
2. Protocole de mise en évidence de la présence des anthraquinones
3. Protocole de mise en évidence et la caractérisation des tanins
4. Protocole de mise en évidence de la présence de coumarines
5. Protocole de mise en évidence de la présence des stérols
6. Protocole de mise en évidence de la présence des flavonoïdes
7. Protocole de mise en évidence de la présence des alcaloïdes
8. Profil chromatographique des différents extraits sur Couche Mince ; (a) extrait
Butanolique de lyophilisat, (b) extrait aqueux de lyophilisat
9. Profil chromatographique analytique de l’extrait aqueux de lyophilisat de Z. spinosa
10. Profil chromatographique en HPLC analytique de l’extrait butanolique de lyophilisat
de Z. spinosa
11. Profil chromatographique en HPLC préparative de l’extrait butanolique de Z. spinosa
12. Spectre RMN-1H du composé F22
13. Attribution des données spectrales de 1H-NMR de la fraction F22 /Rutine
14. Spectre de masse en mode positif de F22
15. Spectre de masse en mode négatif de F22
16. Attribution des données spectrales SM de la fraction F22 Rutine : C27H30O16
17. Chromatogramme de la fraction F7(Zst3) à 280 nm
18. Spectre de masse du F7(Zst3) : (a) MS, (b) Fractionnement MS MS
19. Spectre de masse en mode négatif de F27
20. Attribution des données spectrales SM de la fraction F27 /Kaempferol 3-O-rutinoside
C27H30O15
21. Chromatogramme de la fraction F8(Zst4) à 280nm
22. Spectre de masse du F8(Zst4): (a) MS, (b) ;(c) Fractionnement MS MS
23. Chromatogramme de l’isoquercitine à 280nm
24. Spectre de masse d’isoquercitine dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS
25. Attribution des données spectrales LC-MS /MS: Isoquercitine C21H20O12

26. Spectre de masse du quercetine triglygosides dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement
MS MS
27. Chromatogramme d’Adénine à 280nm
28. Spectre de masse d’Adénine dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS
29. Attribution des données spectrales LC-MS /MS d’adénine C5H5N5
30. Chromatogramme de tryptophane à 280nm
31. Spectre de masse du L-Tryptophane dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS
32. Attribution des données spectrales LC-MS /MS : L-Tryptophane C11H12N2O2
33. Chromatogramme de phenylalanine à 280nm
34. Spectre de masse du DL-Phenylalanine dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS
35. Attribution des données spectrales LC-MS /MS : DL-Phenylalanine C9H11NO2
36. Chromatogramme de Guanosine C10H13N5O5 à 280nm
37. Spectre de masse du Guanosine dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS
38. Attribution des données spectrales LC-MS /MS: Guanosine C10H13N5O5
39. Chromatogramme de Typtamine C10H12N2. à 280nm
40. Spectre de masse du dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS
41. Attribution des données spectrales LC-MS /MS: Typtamine C10H12N2

Liste des tableaux
1. Récapitulatif de Screening phytochimique global des parties aériennes et souterraines
de Z. spinosa
2. Les fractions correspondantes aux pics remarquables
3. Les tubes dont les purifications par HPLC préparative a révélé une seule tache
4. Etude spectrale du composé F22
5. Récapitulatif des composés de l’extrait de lyophilisat de Z. spinosa identifiés par
LCMS/MS

Introduction
Dès l’aube de l’humanité, la présence de calculs rénaux est attestée. Le premier calcul urinaire
a été découvert chez un garçon de 15-16 ans dont les restes datant de près de 7000 ans ont été
exhumés du cimetière d’El-Amrah, en haute Égypte. De nos jours, la lithiase urinaire, ou "
maladie de la pierre " (« lithos » signifiant en grec « pierre ») est une affection très répandue
qui touche 4 à 18% de la population selon les pays. En progression dans tous les pays
industrialisés, sa fréquence a presque doublé depuis un demi-siècle.
Cette pathologie s’accompagne parfois de douleurs extrêmement violentes, les coliques
néphrétiques, provoquées par l'augmentation de la pression des urines dans le rein suite à
l'obstruction de l'uretère par le calcul. En cas d’absence d’évacuation naturelle du calcul,
différents types d’interventions médicales peuvent être proposés pour libérer les voies
urinaires : lithotritie extracorporelle par ondes de choc, urétéroscopie, chirurgie percutanée,
chirurgie laparoscopie, chirurgie ouverte, voire néphrectomie lorsque le rein a été détruit par
infection en amont de l’obstacle lithiasique.
La lithiase étant une pathologie récidivante dans presque un cas sur deux, il convient de
poser un diagnostic étiologique de manière systématique. Celui-ci s’établit notamment sur la
base d’une relation entre la nature physico-chimique du calcul et la pathologie.
Les composés chimiques associés à la prévalence sont : les oxalates de calcium (mono ou
dihydraté), les acides uriques (anhydre ou dihydraté), les phosphates calciques (apatites,
brushite) et la struvite, ou encore la cystine. Chacun de ces constituants peut présenter
différentes morphologies et différentes couleurs qui peuvent être rattachées à des
environnements biochimiques particuliers, voire à des causes spécifiques.
Pour les lithiases qui présentent une résistance vis-à-vis de la lithotripsie extracorporelle
(LEC) comme la cystine, l’oxalate de calcium type Id et la brushite, l’efficacité de certaines
plantes utilisées en médecine traditionnelle a été prouvée. Cette alternative serait
particulièrement intéressante pour des populations ayant un accès difficile aux soins
hospitaliers.
L'Algérie est caractérisée par sa diversité florale : Méditerranéenne, Saharienne et une
flore Paleo Tropicale, estimée à plus de trois milles (3000) espèces appartenant à plusieurs

2
familles botaniques. Ces espèces sont pour la plupart spontanées avec un nombre non
négligeable (15%) d'espèces endémiques ; ce qui a donné à la pharmacopée traditionnelle une
richesse inestimable.
Motivation de la recherche
A travers ce travail de thèse, notre motivation est de participer à la réalisation d’une
pharmacopée algérienne des plantes médicinales.
La valorisation des espèces endémiques de la flore algérienne ainsi que la médecine
traditionnelle riche et variée (du fait de la grande superficie et des différentes régions
géographiques) sont des patrimoines nationaux à sauvegarder.
Nous souhaitons aussi participer à la mise en évidence de molécules bioactives qui
intéresseraient la pharmacie industrielle.

3
Matériels et méthodes
L’investigation structurale a été réalisée au niveau de laboratoire de pharmacognosie, chimie
des substances naturelles UMR CNRS 8638 de l'Université Paris Descartes.
Screening phytochimique
Dans cette partie du travail, nous cherchons à mettre en évidence la présence de certains groupes
tels que les flavonoïdes, les alcaloïdes, les coumarines, les saponosides et les tanins.
Le screening chimique a été réalisé au niveau de laboratoire de botanique médicale et
Cryptogamie du département de pharmacie de la Faculté de médecine d’Annaba.
Réactifs
▪ Ethanol (Biochem chemopharma) ;
▪ KOH;
▪ Acide acétique ;
▪ Benzène ;
▪ Acide nitreux ;
▪ KIO3 ;
▪ FeCl3 (prolabo) ;
▪ Chloroforme (Riedl de Hean);
▪ HCl (Riedel de Hean) ;
▪ Ammoniaque NH4OH ;
▪ Acide picrique (NO2)3C6H2–OH (Sigma Aldrich) ;
▪ Anhydride acétique(Fluka) ;
▪ Acide sulfurique (Fluka) ;
▪ Trichlorure d’aluminium ;
▪ Rognure de Zn.

4
Méthodes
Mise en évidence des saponosides
Test de mousse : étant donné qu’ils sont hydrosolubles, les saponosides sont extractibles par
l’eau.
L’indice de mousse = l’inverse de concentration = V/Q: et par définition, est la dilution de la
drogue dans le tube qui donne une hauteur de mousse égale à 1cm après 15 minutes de repos.
[1,2].
Figure 1. Protocole de mise en évidence de la présence des saponosides et calcul d’indice de
mousse
Ebullition 30mn
Ajuster à 10 ml
Refroidissement
11 tubes de volumes croissants de 1à10 ml
Ajuster chaque tube à 10ml
Repos 15mn ensuite mesuré hauteur de
la mousse.
Agitation 15se (2agitations par s)
1g du matériel végétal dans 100 ml
d’eau distillée

5
Mise en évidence des anthraquinones
Figure 2. Protocole de mise en évidence de la présence des anthraquinones [2]
d’eau distillée
10 ml de KOH 0,5N
Chauffage pendant 10 mn
Ajouter 1ml H2O2
Refroidissement et filtration
Acidification avec acide acétique
Ajout de 5ml NaOH
Extraction de l’extrait acide par 10ml de Benzène
Couleur rouge au niveau de la couche alcaline (réaction positive)
Caractérisation par réaction de Bornträger:avec les formes
anthraquinoniques libres.

6
Mise en évidence des tanins
Les tanins sont mis en évidence après extraction de la drogue végétale par deux types de
réaction : réaction de précipitation et réaction d’oxydation [1, 2].
.
Figure 3. Protocole de mise en évidence et la caractérisation des tanins
Refroidissement
Solution extractive aqueuse
extractive
Filtration
10 g du matériel végétal dans 100 ml
d’eau distillée bouillie (infusion 30min)
Avec FeCl3 Avec KIO3
La coloration
vire au pourpre
puis au bleu :
Les tanins
ellagiques.
En présence du
formol et HCL
et après
ébullition de
15mn : précipité
avec les tanins
catéchiques.
Une coloration
rose : Les
tanins
galliques.
Précipités
bleu-noirs :
Les tanins
hydrolysables.
Avec HNO2
Avec le réactif
de Stiasny
Précipités
Brun-
verdâtre :
Les tanins
condensés.

7
Mise en évidence des coumarines [2]
Figure 4. Protocole de mise en évidence de la présence de coumarines
0,5 g du matériel végétal dans 5 ml HCl
Bain marie 3mn
Fluorescence bleu 366mn
Filtration
Ajout HCL 0,3N
Fluorescence persiste

8
Mise en évidence des stérols [2]
Figure 5. Protocole de mise en évidence de la présence des stérols
5 g du matériel végétal dans 20 ml HCl
Macération pendant deux jours
Résidu +15 ml de chloroforme
Evaporation
Filtration 3 fois
Répartition en 3 tubes
Test de Salkowski Test de Liebermann-Burchard Test de Badjet-Kedde
Tube 1 : filtrat +1 à 2 mL
de H2SO4. On agite le
mélange légèrement et
on note le changement
graduel de coloration.
Les stérols insaturés par
une réaction qui
provoque l'apparition
d’une coloration rouge.
Tube 3: filtrat + quelques
grains d'acide picrique
(NO2)3C6H2–OH.
L'apparition d'une
coloration orange indique
la présence des stéroïdes
lactoniques.
Tube 2 : filtrat + un
mélange de chloroforme et
d’anhydride acétique
(v/v), puis on agite
légèrement. On ajoute
H2SO4 concentré.
L’apparition d’une
coloration rose est
indicative de la présence
de triterpènes
pentacycliques ou de
stéroïdes.

9
Mise en évidence des flavonoïdes [1,2]
Figure 6. Protocole de mise en évidence de la présence des flavonoïdes
HCl+10ml Ethanol
Macérer pendant 2 jours
Ajout de 10ml de
NH4OH
Filtration
Couleur jaune
(réaction positive).
Réaction à la cyanidine
02 ml de filtrat
alcoolique, 0.5 ml
d’eau distillée, 0.5
ml HCL et une
rognure de Zn.
Réaction avec le (AlCl3)
01 ml de filtrat
alcoolique, on ajoute
02 ml de trichlorure
d’aluminium

10
Mise en évidence des alcaloïdes : [1,2]
Les alcaloïdes sont des substances azotées agissant comme des bases donnant des réactions de
précipitation : en solution acide (pH 1 et 2), les sels d’alcaloïdes donnent avec les composés
iodés des métaux lourds, des précipités colorés caractéristiques.
Ajoute 4 ou 5 gouttes du
Figure 7. Protocole de mise en évidence de la présence des alcaloïdes
2g du matériel végétal dans 1,5 ml HCl
Agitation : repos 1heure puis filtration
Phase inferieure (phase
éthérée) +3ml HCl
Filtrat +10ml d’eher Ajout de lessive de soude
Phase supérieure
Phase inferieure
(Acide)
Phase supérieure
Réactif de
Bouchardat :
solution d'iodure
de potassium
iodél),
Réactif de Valsner
Mayer : solution neutre de
mercurietetraiodure de
potassium
Réactif de Dragendorff :
solution iodobismuthate de
potassium
Précipité brun. Précipité blanc. Précipité rouge orange.

11
Extraction
Matériels
▪ Lyophilisateur (Cryonext) ;
▪ Ultrason (Branson 2800) ;
▪ Rotavapor (Buchi).
Réactifs
▪ Ethanol (Sigma Aldrich) ;
▪ Butanol (Sigma Aldrich).
Méthodes
Préparation de Lyophilisat
300g de la poudre des parties aériennes de Zilla spinosa L est infusée dans 3 litres d’eau distillée
portée à l’ébullition à 1600
C.
Après la filtration, le filtrat est congelé avec l’Azote liquide dans et mis dans le lyophilsateur
pendant 24h.
Préparation des extraits
Extrait de l’infusé de lyophilisat
10g de lyophilisat est infusé dans 100ml H2O bouillant (1600
C) pendant 20 minutes, après
filtration le filtrat est évaporé à sec par évaporation sous vide à 400
C.
Extrait aqueux de la poudre total
L’extraction aqueuse avec Ultrason (Branson 2800) de 10g a été réalisée sur toute la matière
sèche de la poudre des parties aériennes pendant 30 minutes, avec 100ml H2O distillée
bouillante (160°
C).
Après la répétition de l’extraction par ultrason, les filtrats ont été réunis et évaporés à sec par
évaporation sous vide à 40°C jusqu’à un résidu sec.
Extrait hydro-alcoolique
L’extraction avec Ultrason de 10g a été réalisée sur toute la matière sèche pendant 30 minutes,
avec le mélange de solvant éthanol/eau (60V/40V), la procédure a été répétée trois fois.
Après la répétition de l’extraction par ultrason, les filtrats ont été réunis et évaporés à sec par
évaporation sous vide à 40°
C jusqu’à obtention d’un résidu sec.

12
Extrait butanolique
L’extraction avec ultrason de 10g de lyophilisat a été réalisée en utilisant le mélange de solvant
butanol/eau (50V/50V) (100ml), la procédure a été répétée trois fois.
Après la répétition de l’extraction par ultrason, les deux phases aqueuse et butanolique ont été
réunies et évaporées à sec sous vide à 40°
C jusqu’à obtention d’un résidu sec.
Méthodes chromatographiques analytiques
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Matériels
▪ Phase stationnaire
Plaque de silice CCM (60‫إ‬, F254, Silicycle) ;
▪ Phase mobile
Acétate-ethyhl (Carlo ERBA)/MeOH (Sigma-Aldrich)/H2O; 60:20.
▪ Révélation
- Solution A : vanilline à 1% dans de l’éthanol.
- Solution B: acide sulfurique H2SO4 (Sigma-Aldrich);
- Mélange de la solution A et solution B (50:1).
Méthode
Nous avons spoté nos différents extraits sur la plaque de silice. Après la migration dans la phase
mobile, les plaques sont observées sous lampe UV à 254 et 366 nm avant révélation.
Les plaques sont ensuite chauffées à 120°C pendant quelques minutes.
Le révélateur utilisé sur les plaques de silice est la vanilline sulfurique [3].
Purification par HPLC analytique
Matériels
HPLC-UV/DAD et HLPC-UV(Lachrome).
Réactifs
▪ Acétonitrile (Carlo ERBA) ;
▪ Acide formique (Sigma Aldrich).
Méthode
Préparation des échantillons
50mg de lyophilisat de l’extrait aqueux dissous dans 1 ml « 0,8H2Omilliqu+0,2Acétonitrile »
10mg de lyophilisat de l’extrait butanolique dissous dans 1 ml (0,85H2Omilliqu +0,15
Acétonitrile)

13
Système d’élution
Colonne X SelectC18 (150 mm ×4.6 mm×5µm).
Pression : 145 Bar, Injection : 5µl, Debit : 0.7ml/mn, Absorbance : 254nm.
Pour l’extrait de l’infusé de lyophilisat
Phase mobile A: Acetonitrile50%+ H2O 50%+0.1%HCOOH.
B : H2O+0.1%HCOOH.
Gradient
Temps mn A B
00 15 85
15 20 80
28 22 78
33 30 70
38 35 65
43 35 65
53 40 60
58 40 60
Pour l’extrait butanolique
Phase mobile A: Acétonitrile 100%+0.1%HCOOH.
B: H2O 100%+0.1℅HCOOH.
Gradient
Temps mn A B
00 15 85
30 40 60
35 00 100
40 00 100
50 15 85
Purification par HPLC préparative
Matériel
HPLC Préparatoire (Merck)
Réactifs
▪ Acetonitrile (Carlo ERBA).
▪ Acide formique (Sigma Aldrich)
Méthode
Préparation de l’échantillon
200mg de lyophilisat de deux extraits aqueux et butanolique dissous chaqu’un dans 3ml
(0,8H2Omilliqu+0,2Acétonitrile).

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Système d’élution
Colonne Nucléodure C18 (150mm ×32 mm×5µm).
Pression: 131 bar, Injection: 5µl, Debit: 45ml/mn (25s /Tube), Absorbance: 254nm.
Pour l’extrait de l’infusé de lyophilisat
Phase mobile A: Acetonitrile 50%+ H2O 50%+0.1%HCOOH
B : H2O+0.1℅HCOOH
Gradient
Temps mn A B
00 15 85
19 20 80
26 22 78
33 30 70
39 35 65
52 35 65
61 40 60
66 40 60
Pour l’extrait butanolique
Phase mobile A : Acetonitrile 100%+ 0.1%HCOOH.
B : H2O 100%+0.1%HCOOH.
Gradient
Temps mn A B
00 15 85
30 40 60
40 100 00
50 100 00
Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
Matériel
Spectromètre RMN 400 MHz (Bruker)
Réactifs
MeOH 1D et 2D ou/et DMSO-d6 (Sigma aldrich),
Méthode
Préparation d’échantillon : Fractions obtenues après la purification par HPLC préparative 01mg
des fractions ciblées sont dissoutes dans 0,6ml MeOH 1D et 2D ou/et DMSO-d6 (Sigma
aldrich), remplis dans des tubes RMN et sont passées par l’appareil : Spectromètre RMN
(Bruker).

15
Les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton et du carbone (RMN 1H et 13C) ont
été respectivement enregistrés à 400 et 125 MHz dans le dimethylsulfoxide deuterié (DMSO-
d6).
Spectroscopie de Masse SM
Définition
La chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse est une méthode
d'analyse qui combine les performances de la chromatographie en phase liquide et de la
spectrométrie de masse afin d'identifier et/ou de quantifier précisément de nombreuses
substances.
La LC-MS utilise un système de CLHP, mais au moment où les phases mobiles du liquide
quittent la colonne, l'échantillon est vaporisé sous forme de micro-gouttelettes. Celles-ci
s'évaporent rapidement et libèrent des molécules ionisées de l'analyte qui sont ensuite séparées
dans la spectrométrie de masse.
Composition
Une unité LC-MS est composée de deux blocs principaux : un chromatographe en phase liquide
et un spectromètre de masse.
Performances du couplage LC-/MS
Séparation d’un mélange afin d’obtenir une identification de la plupart des constituants
- Avoir la sensibilité la plus élevée possible
- Etre universel, c’est-à-dire détecter toutes les substances éluées
- Fournir le plus de données structurales possibles
- Etre sélectif (identification d’un constituant ciblé)
- Permettre des analyses quantitatives Permettre des analyses quantitatives
Matériel
Spectromètre de masse LCT premier de la société Waters (analyseur à temps de vol TOF) muni
d’une source d’électron ébullisation électrospray ESI.
Réactifs
▪ MeOH LC/MS (Carlo ERBA);
▪ Acetonitrile (Carlo ERBA) ;
Méthode
1mg des fractions obtenues après HPLC préparative de l’extrait butanolique est dissous dans
1ml de MeOH LC/MS.

16
Conditions d’analyse
- Tension capillaire = 2500 V.
- Tension de cône appliquée Vc= 30 V.
- Solvant : Méthanol LC/MS.
- Logiciel du traitement des données : MassLynx.
Spectroscopie de Masse HPLC-MS/MS
Définition
Le tandem MS/MS se différencie de la MS par une fragmentation des ions pour permettre une
meilleure identification. Les ions séparés lors d’un simple MS sont sélectionnées dans un
collecteur et sont fragmentés. Les fragments sont analysés dans un deuxième analyseur
(fragments MS). L’identification obtenue est plus fine et plus exacte.
Composition
Il est composé sous sa forme
1- Simple MS : d’un ionisateur, d’un analyseur et d’un détecteur qui détermine la masse
des iobs m/z.
2- Tandem MS/MS : d’un collecteur d’ions et d’un deuxième analyseur en plus de la partie
simple MS.
Un spectromètre de masse est composé principalement de : un ionisateur, un détecteur et un
analyseur de masse.[4]
L’ionisateur : Sert à produire des ions positifs ou négatifs. Les principales sources ioniques
dépendent de l’échantillon à analyser
L’analyseur de masse : sert à séparer les ions collectés soit sous l’action d’un champ électrique,
soit sous l’action d’un champ magnétique. Il peut être couplé avec presque tous les ionisateurs.
Les analyseurs de masse se différencient par leur résolution et leur domaine de masse d’analyse.
Le détecteur : sert à mesurer le nombre d’électrons et à amplifier le signal pour atteindre une
bonne sensibilité. Le plus utilisé est un multiplicateur d’électrons. Ensuite le signal est
enregistré et un spectre de masse est produit.
Performances
L’analyse par spectrométrie de masse de type triple quadripôle (MS/MS) est la méthode de
prédilection pour une quantification précise et une confirmation de traces d’analytes dans des
matrices complexes.
Détection des drogues et des métabolites dans des échantillons biologiques, polluants présents
dans l’environnement, pesticides contenus dans les aliments… les analystes du monde entier

17
font face au défi de la détection d’un plus grand nombre d’analytes cibles avec une plus grande
sensibilité et dans un nombre d’échantillons considérablement plus important. Les
performances d’un spectromètre de masse MS et MS/MS sont déterminées par :
a- Sa résolution : son pouvoir à séparer des ions de masses voisines
b- Son exactitude : son pouvoir à mesurer la masse exacte d’un ion
c- Sa sensibilité : son pouvoir à mesurer les petites quantités
d- Son domaine de masse : son échelle de mesure de masse
Pour obtenir des spectres MS / MS de haute qualité, Agilent Technologies ont choisi d’acquérir
des spectres à trois énergies de fragmentation différentes, 10, 20 et 40 eV.
Pour une tentative d’identification rapide des produits naturels, une recherche automatique dans
la bibliothèque spectrale MS / HRMS serait très efficace s'il existait des bibliothèques de
produits naturels appropriées.[5]
Déréplication : identification de composés déjà connus dans un mélange complexe sans isoler
les molécules, par une détection par spectrométrie de masse. La comparaison des ions détectés
dans une base de données, par le lien entre la valeur de m/z de l’ion détecté et celle des composés
de la base de données.[6]
Identification LCMS/MS
Pour les bibliothèques de produits naturels, différents algorithmes ont été utilisés pour
rechercher des spectres MS / MS pour l'identification provisoire (l'identification absolue
nécessite toujours une résonance magnétique nucléaireèc par des étalons de référence validé
(RMN).
Il existe maintenant des dépôts publics tels que MetLin, Massbank et Global natural Product
Molecular Networking(GNPS).
Néanmoins, une barrière majeure réside dans le fait que les spectres MS / MS de petites
molécules sont incohérents entre instruments, en particulier entre les instruments à piégeage
d'ions et à cellules de collision.
Fredenhagen et al recherche de données MS / MS basse résolution avec l’algorithme de
l’Institut national des standards et de la technolgie (NIST) mis au point pour l'analyse complète
electro-ionisation positive.
El-Elimat et al ont utilisé ACD-IntelliXtract qui inclut également une masse précise des
fragments, mais n'utilisez pas les données de l'ion parent comme entrée de recherche.
Récemment, une stratégie de mise en réseau MS / MS (Networking) a été publiée par le
Dorrestein /Bandeira labs, où les spectres MS / MS sont comparés par paires pour donner des
grappes de composés apparentés. La visualisation de ces groupes de métabolites permet

18
d’identifier rapidement les composés inconnus issus d’une famille phytochimique et de
comparer les différents chémotypes.[7]
Matériel
Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS
L’analyse des résultats par le logiciel Qualitative Analysis B.0.700 de Agilent Mass Hunter
Workstation des deux ionisations en comparaison avec la base de données NIST(National
Institut of Standards and Technolgy ) 2014.
Réactifs
▪ MeOH LC/MS (Carlo ERBA);
▪ Acetonitrile (Carlo ERBA) ;
Méthode
▪ Préparation d’échantillon
1mg des fractions obtenues après HPLC préparative de l’extrait de l’infuse de lyophilisat et
10mg de lyophilisat total sont dissoutes dans 1ml de MeOH LC-MS.
▪ Conditions de travail
- Pression : 145 bar, Injection : 5µl, Debit : 0.7ml/mn, Absorbance : 220 ; 254 ; 280 nm.
- Energie d’ionisation : 50.
- Colonne : X Select C18 :250mm ×4,6mm×5µm.
- Solvants:
A: Acétonitrile 50%+ H2O 50%+0.1%HCOOH.
B: H2O+0.1%HCOOH.
- Gradient
time mn A B
00 15 85
15 20 80
28 22 78
33 30 70
38 35 65
43 35 65
53 40 30
58 40 60

19
Résultats
Les tests phytochimiques consistent à détecter les différentes familles de composés existantes
dans les parties étudiées de notre plante par des réactions qualitatives de caractérisation. Ces
réactions sont basées sur des phénomènes de précipitation ou de coloration par des réactifs
spécifiques à chaque famille de composés. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau
1. Nous avons remarqué la présence de la majorité des métabolites secondaires dans les parties
aériennes sauf les anthraquinones et les stéroïdes, en revanche la racine est caractérisée par
l’absence de plusieurs métabolites sauf les tanins et les coumarines.
Tableau 1. Récapitulatif de Screening phytochimique global des parties aériennes et
souterraines de Zilla spinosa L.
Métabolites
Parties aériennes de Z. spinosa Racine de Z. spinosa
Alcaloides + +
Anthraquinones - -
Coumarines + +
Flavonoïdes + -
Saponosides + -
Stérols et
terpènes
+ -
Tanins + +
+ : présence, - : absence
Extraction
Préparation de lyophilisat
- Rendement 23.65 g.
Préparation des extraits
- Extrait aqueux : rendement 7,23g.
- Extrait butanolique : on a obtenu 6. 39g de la phase aqueuse et 2. 31 g de la phase
butanolique.

20
Méthodes analytiques chromatographiques
Chromatographie sur Couche mince
Pour chaque plante choisie pour une étude phytochimique, avant d’entamer les extractions
couteuses sur une grande quantité, on réalise d’abord un screening ou un repérage sur une petite
quantité , pour la recherche des saponosides, en appliquant une chromatographie sur couche
mince (CCM) de quelques gouttes de cet extrait , on obtient un profil CCM en phase normale
dans un solvant AcetEthy- MeOH-H2O (60 :30 :10), qui sera révélé dans une solution de
vanilline à 1%.
Un profil chromatographique riche en flavonoïdes se caractérisera par la couleur jaune (Fig. 8).
(a) (b)
Figure 8. Profil chromatographique des différents extraits sur Couche Mince ;
(a) extrait Butanolique de lyophilisat, (b) extrait aqueux de lyophilisat

21
HPLC Analytique
Nous avons obtenu les profils analytiques suivants (Fig.9 et 10) :
Pour l’extrait aqueux de lyophilisat
Figure 9. Profil chromatographique analytique de l’extrait aqueux de lyophilisat de Z. spinosa
Pour l’extrait butanolique de lyophilisat
Figure 10. Profil chromatographique en HPLC analytique de l’extrait butanolique de
lyophilisat de Z. spinosa

22
HPLC préparative
Extrait aqueux de lyophilisat
A la fin de l’opération, nous avons récupéré 205 tubes. Selon le profil chromatographique de
90 minutes, nous avons pu obtenir 11 fractions (Tableau 2) correspondantes aux pics
remarquables. Des pics massifs (F4-F11) observés de 50 à 90mn.
Tableau 2. Les fractions correspondantes aux pics remarquables
Fraction Tube Masse (mg)
F1 T11-T13 6,7
F2 T110-T114 1,4
F3 T120 0,3
F4 T122 1,4
F5 T123 1,7
F6 T124 1,5
F7 T153-T158 2,3
F8 T187-T 192 05
F9 T195-T198 1,5
F10 T199-T201 3,5
F11 T 202 2,5
Extrait butanolique de lyophilisat
A la fin de l’opération, nous avons récupéré 60 tubes dont 34 ont été évaporés.
Selon le profil chromatographique de 50 minutes, nous avons pu obtenir des fractions
correspondant aux pics remarquables (Fig.11) :
o Aucune observation entre (T1-T6).
o Des pics massifs (T7-T10) observés pendant les six premières minutes.
o Des pics plus au moins séparés entre (T11-T36) observés de 8.5 à 15.5 minutes.
o Des tubes de lavage de l’appareil entre (T37-T54).

23
Figure11. Profil chromatographique en HPLC préparative de l’extrait butanolique
de Z. spinosa
Nous avons choisi les 4 tubes dont la purification par HPLC préparative a révélé une seule
tache (Tableau 3) :
Tableau 3 . Les tubes dont les purification par HPLC préparative a révélé une seule tache
Fraction Tube Masse (mg)
F9 T9 3.3
F15 T15 05
F22 T22 3.5
F27 T27 15

24
Elucidation structurale des produits
Composé 1
L’élucidation structurale a été faite par RMN (Fig.12). La fraction F22 de l’extrait butanolique
a donné le spectre NMR-1H et NMR-13C suivant :
Figure 12. Spectre RMN-1H du composé F22
L'étude spectrale 1H-RMN a été réalisée par un Bruker Spectromètre de 300 MHz en utilisant
15 mg de la fraction F22 dissous dans MeOH deutéré 4d. Les données spectrales 1H-RMN sont
exprimées en parties par million de l'étalon interne (tétraméthylsilane, δ 0,0) (Tableau 4). Le
spectre 1H-RMN de la fraction a été comparé au spectre 1H-RMN de rutine-standard. Ainsi,
dans le spectre de la molécule pourrait être vu certains signaux supplémentaires dans les zones :
1.1-2 ppm, correspondant au composé supplémentaire identifié également par CCM. Les
signaux supplémentaires sont très petits ce qui correspond à un état de pureté acceptable de la
rutine obtenue après purification.

25
Tableau 4. Etude spectrale du composé F22
δ ppm Signal
1.12 d, 3H, CH3
3.38-3.56 m, 8H, rutinoside protons and CH2O
3.62 dd, 1H, CH-CH3 ramnose
3.82 d, 1H, CH-CH2O glucose
4.51 d, 1H, OCHO ramnose
5.10 d, 1H, OCHO glucose
6.20 d, 1H, Ar-H
6.39 d, 1H, Ar-H
6.89 d, 1H, Ar-H
7.61-7.67 m, 2H, Ar-H
Figure 13. Attribution des données spectrales de 1H-NMR de la fraction F22 /Rutine
- Pour confirmer l’identification structurale, on a passé la même fraction sur spectre SM
(Fig. 14, 15, 16).

26
Figure 14. Spectre de masse en mode positif de F22
Figure 15. Spectre de masse en mode négatif de F22
En mode positif
528.5-304.3=224.2
1034.0-809.8=224.2
809.8 - 304.3+23 = 528.5 ou 528.5 + 304.3 – 23 = 809.8
528.5-23=505.5 505.5*2=1011 1011+23=1034
Formation de dimères et association dìons.
En se basant sur lànalyse en mode négatif, il est clair que M-H=609 donc M=610, cèst un
glycoside, polyphénol associé à un sucre de masse 309.

27
301+309=610, cela est confirmé par l`ion 633 en mode positif correspondant à M+Na mais qui
n`est pas majoritaire. Il existe aussi l ion 302 en mode positif qui correspond à 301+H.
Figure 16. Attribution des données spectrales SM de la fraction F22 Rutine : C27H30O16
- La même molécule a été identifiée dans l’infusé de lyophilisat par LC-MS/MS de la fraction
F7(Zst3) =2,3mg. L’analyse des résultats par le logiciel Qualitative Analysis B.0.700 de Agilent
Mass Hunter Workstation des deux ionisations en comparaison avec la base de données NIST(
National Institut of Standards and Technolgy )2014. Le pic qui apparait à un temps de rétention
de 7.76 mn avec (Fig. 17) m/z(H+)= 611.1586 Da (masse molaire theorique =610.1533Da) et
les fragments 304.0508 ; 230.0504.
Remarque : la formule brute C27H30O16 présente 115 isoméres

28
Figure 17. Chromatogramme de la fraction F7(Zst3) à 280 nm

29
(a) MS
(b) Fractionnement MS MS
Figure 18. Spectre de masse du F7(Zst3) : (a) MS, (b) Fractionnement MS MS

30
Composé 2
L’élucidation structurale a été faite par Spectre de Masse SM de la fraction F27 de l’extrait
butanolique de lyophilisat.
M-H= 593 M+Cl= 629 M= 594
L’elucidation montre qu’il s’agit du Kaempferol 3-O-rutinoside : C27H30O15.
Figure 19. Spectre de masse en mode négatif de F27
Figure 20. Attribution des données spectrales SM de la fraction F27 /Kaempferol 3-O-
rutinoside C27H30O15

31
-La même molécule a été identifiée dans l’infusé de lyophilisat par LC-MS/MS de la fraction
F8(z st4)=5mg.
Le pic qui apparait à un temps de rétention de 14.74 mn avec m/z(H+) = 595.1645 Da (masse
molaire theorique =594.522) et les fragments 153.0168 ; 288.0565 ; 129.0519.
Remarque : la formule brute C27H30O15.présente 176 isomères (Annexe 06)
Figure 21. Chromatogramme de la fraction F8(Zst4) à 280nm

32
(a) MS
(c) Fractionnement MS MS
Figure 22. Spectre de masse du F8(Zst4): (a) MS, (b) ;(c) Fractionnement MS MS

33
Composé 3
L’elucidation structurale par LC-MS/MS de l’extrait total de l’infusé (Zst1) montre la présence
du Isoquercetine
molaire theorique =464.379) et les fragments 229.0521; 303.0470; 449.0658.
Remarque : la formule brute C21H20O12 péesente 80 isoméres (Annexe 06)
Figure 23. Chromatogramme de l’isoquercitine à 280nm

34
(a) MS
Figure 24. Spectre de masse d’isoquercitine dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS

35
Figure 25. Attribution des données spectrales LC-MS /MS: Isoquercitine C21H20O12

36
Composé 4
Le pic qui apparait à un temps de rétention de 6.37mn avec m/z(H+) =773.1995 Da et les
fragments 129.0540 ; 303.0483 ; 466.1043.
Remarque : la formule brute présente 16 isomères (Annexe 01)
(a) MS.
(b) Fractionnement MS MS.
Figure 26. Spectre de masse du quercetine triglygosides dans Zst1: (a) MS, (b)
Fractionnement MS MS

37
Composé 5
Le pic qui apparait à un temps de rétention de 2.987 mn avec m/z (H+)= 136.0599 Da
(masse molaire theorique =135.13 g/mol).
Figure 27. Chromatogramme d’Adénine à 280nm

38
Figure 28. Spectre de masse d’Adénine dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS

39
Figure 29. Attribution des données spectrales LC-MS /MS d’adénine C5H5N5
Composé 6
Le pic qui apparait à un temps de rétention de 4.597 mn avec m/z (H+)= 205.0945 Da (masse
molaire theorique =204.229 g/mol) et les fragments 103.0516 ; 118.0627 ; 132.0772 ;
143.0701 ; 159.0887.
Figure 30. Chromatogramme de tryptophane à 280nm

40
Figure 31. Spectre de masse du L-Tryptophane dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS
MS

41
Figure 32. Attribution des données spectrales LC-MS /MS : L-Tryptophane C11H12N2O2
Composé 7
Le pic qui apparait à un temps de rétention de 4.004 mn avec m/z =166.0860 (masse
molaire theorique = 165.192g/mol) et fragment 120.0803 .
Remarque : la formule brute C9H11NO2 preéente 78 isomères (Annexe 06)
Figure 33. Chromatogramme de phenylalanine à 280nm

42
(a) MS
Figure 34. Spectre de masse du DL-Phenylalanine dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS
MS

43
Figure 35. Attribution des données spectrales LC-MS /MS : DL-Phenylalanine C9H11NO2
Composé 8
molaire theorique =283.244g/mol) et les fragments 110.0334 ; 135.0280 ; 152.0547 ;
194.0115.
Remarque : la formule brute C10H13N5O5 présente 15 isomères
Figure 36. Chromatogramme de Guanosine C10H13N5O5 à 280nm

44
Figure 37. Spectre de masse du Guanosine dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS
a
B

45
Figure 38. Attribution des données spectrales LC-MS /MS: Guanosine C10H13N5O5
Composé 9
Le pic qui apparait à un temps de rétention de 5.487 mn avec m/z (H+)= 144.0777 Da.
Figure 39. Chromatogramme de Typtamine C10H12N2. à 280nm

46
Figure 40. Spectre de masse du dans Zst1: (a) MS, (b) Fractionnement MS MS

47
Figure 41. Attribution des données spectrales LC-MS /MS: Typtamine C10H12N2
Tableau 5. Récapitulatif des composés de l’extrait de lyophilisat de Z. spinosa identifiés par
LCMS/MS
Temps de
retention (mn)
m/z(H+) Fragments
majoritaires (m/z
Formule
moleculaire
composés
2.987 136.0599 C5H5N5 Adenine
3.919 284.0970 110.0334135.0280
152.0547 ;194.0115
C10H13N5O5 Guanosine
4.004 166.0860 120.0803 C9H11NO2 DL-
Phenylalanine
4.597 205.0945 103.0516;118.0627
132.0772 ;143.0701
159.0887
C11H12N2O2 L-Tryptophan
5.785 144.0777 C10H12N2. Tryptamine
6.37 773.1995 129.0540 ;303.0483
466.1043
C36H36O19 Quercetin
Triglycoside
6.438 465.1010 229.0521 ;303.0470
449.0658
C21H20O12 Isoquercitine
7.76 611.1586 304.0508 ;230.0504. C27H30O16. Rutin
14.74 595.1658 153.0168 ;288.0565
;129.0519
C27H30O15 Kaempferol 3-O-
rutinoside

48
Discussion
Les différents métabolites qui existent dans les parties aériennes de notre plante, justifient son
emploi thérapeutique. En effet, la présence des stéroïdes explique l’utilisation de Zilla spinosa
L comme antinflammatoire, alors que celle des tanins rend clair son indication dans les troubles
gastriques et les maux d'estomac, ainsi que la disolution des calculs rénaux est liée à la présence
des flavonoïdes.
Les résultats de El Sawi et al 2018[8], montrent que les parties aériennes de Zilla spinosa L
contiennent de grandes quantités de : glucides, flavonoïdes, alcaloïdes et anthraquinones, et des
quantités modérées de : stérols et / ou terpènes, coumarines et tanins, alors que seules les
saponines sont absents ce qui est en discordance avec nos résultats.
Les résultats expérimentaux du screening phytochimique, réalisé par A.Berrouigha 2016[9] sur
l’espèce Zilla macropetra L, ont révélé la présence de flavonoïdes, saponosides et tanins. En
revanche, la même étude a indiqué l'absence des stérols et des cardinolides insaturés dans la
partie aérienne, et la présence de stéroïdes et alcaloïdes en quantité moindre.
Elucidation structurale des produits
Nous avons pu isoler, par les différentes méthodes d’analyses structurales, quatre molécules de
type flavonoïdes (Rutin, Kaempferol 3-O-rutinoside, Isoquercetine, Quercetine triglycoside),
ainsi que certains acides aminés (Adenine, Tryptophane, Tryptamine, Phénylalanine et
Guanosine).
El-Toumy S.A et al 2011[10] a pu également isoler le Kaempherol mais à partir d’une partie
glucidique 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(166)-β-D-glucopyranoside et 3-O- β-glucopyranoside.
Bergapten, Psoralene, Umbleferone, ß- Amyrin, Friedelene et 6-Stérol-glucoside ont été isolés
par EL-Sharabasy F et al 2013[11] en utilisant les parties aériennes de Zilla spinosa L.
L’étude d’A. Berreghioua 2016 sur l’espèce macropetra de Sahara d’ Algérie montre la
présence d’un autre type de flavonoïdes de 8,4'diméthoxy, 5,7- dihydroxyflavone 7-(6’’
methylglucuronyl) apigenin.
La présence d’Adénine oriente la recherche vers le rôle des acides aminés et leurs effets
biologiques notamment celui anti-lithiasique.

49
Conclusion
Notre travail de screening phytochimique, a permis de détecter la présence des: flavonoïdes,
tanins, alcaloïdes et saponosides ;Quatre flavonoïdes (Rutine, Kaempferol 3-O-rutinoside,
isoquercetine, quercetine triglycoside).
Cinq acides aminés (Adenine, Tryptophane, Tryptamine, Phénylalanine et Guanosine) ont été
purifiés à partir de l’extrait aqueux des parties aériennes.

50
Références bibliographiques
1. Bruneton J. Pharmacognosie : phytochimie, plantes médicinales. 3éme éd. Paris :
lavoisier éditions tec & doc; 1999, 199-204 p.
2. Faugeras G, Lavenir R. Guide de travaux pratiques des essais végétaux. Edition Vegot
Freres ; 1965,175 p.
3. Stahl E. Analyse chromatographique et microscopique des drogues. Paris : Entreprise
moderne d’édition, technique et documentation; 1974, 436 p.
4. Lindon J C, Tranter G E, Holmes J L .Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry.
Academic Press, 2000. 2581p.
5. Dass C.Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry, John Wiley & Sons
Publishers, Wiley. Inter. Science,2007. 577 p.
6. Kildgaard S, Mansson M, Dosen I, Klitgaard A, Frisvad J C, LarsenTO, Nielsen
KF.Accurate Dereplication of Bioactive Secondary Metabolites from Marine-Derived
Fungi by UHPLC-DAD-QTOFMS and a MS/HRMS Library.Mar. Drugs 2014;12,
3681-3705.
7. Bhatta R S. LC-MS/MS based dereplication tool in identification of plant secondary
metabolite. CSIR-Central Drug Research Institute, India, Biochem & Pharmacol
International Conference and Exhibition on Pharmacognosy, Phytochemistry & Natural
Products.2013;2:4.
8. El-sawi SA, Motawe HM, Ahmad SS, Ibrahim ME. Survey and Assessment of
Chemical Composition and Biological Activity of Some Wild Plants Growing in the
Egyptian Eastern Desert. Journal of Materials and Environmental Science.
2018;9:1495-1502.
9. El-toumy SA, El-sharabasy FS, Ghanem HZ, El-kady MU, Kassem AF. Phytochemical
and Pharmacological Studies on Zilla spinosa. Australian Journal of Basic and Applied
Science. 2011;5(8):1362-1370.
10. El-sharabasy F, Zayed NM. Chemical Constituents and biological activity from
chloroform extract of Zilla spinosa. J Pharm Sci. 2012;5:422-427.
11. Berrghioua A. investigation phytochimique sur des extraits bioactifs de deux
brassicaceae medicinales du sud algerien : moricandia arvensis et zilla macroptera
Thèse de doctorat. Université abou bakr belkaid, Faculté des sciences, Tlemcen ; 2016.

Annexe:01
Les isomeres de DL-Phenylalanine C9H11NO2

4
Les isomères de Rutin C27H30O16

15
Les isomères L-Tryptophan C11H12N2O2

16
Les isomères Isoquercitine C21H20O12

18
Les isomères de Quercetin Triglycoside C36H36O19
Les isomères Guanosine C10H13N5O5

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