BIOTECNOLOGIA

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
FACULTAD: INGENIERIA
PROFESIONAL: INGENIERIA AMBIENTAL
BIOTECNOLOGIA
TRABAJO
ELECTROFORESIS Y ANALISIS DE SECUENCIAS DE ADN
INTEGRANTES :
COLQUE FERNANDEZ, REYNA LUISA
CODIGO: 2018205016
DOCENTE : Dc. SOTO GONZALES, HEBERT HERNAN
23de junio del 2021

2. 1. INDICE
CODIGO: 2018205016 ................................................................................................................ 1
1, INTRODUCCIÓN: ............................................................................................................... 3
2. MARCO TEORICO:.................................................................................................................. 4
Protocolo Electroforesis de ADN en gel de agarosa ........................................................... 6
3. MATERIALES Y METODOS:..................................................................................................... 8
4. PREGUNTAS............................................................................................................................. 17

3. 2. INTRODUCCIÓN:
3. El ADN es una de las moléculas más importantes para la vida. Consiste de una doble
hélice donde cada una de las cadenas es un polímero integrado por miles o incluso
millones de nucleótidos (Stansfield 1992). Cada nucleótido, está formado por un azúcar
(desoxirribosa), una base nitrogenada que puede ser adenina (A), timina (T), citosina
(C) o guanina (G) y un grupo fosfato (Stansfield 1992). El orden que tienen los
nucleótidos en el ADN es lo que se denomina secuencia (Figura 1) y las técnicas y
métodos que se utilizan para conocer esa secuencia son llamados de secuenciación
(de Necochea y Canul 2004). Conocer el orden de los nucleótidos es una herramienta
con infinidad de aplicaciones porque la diferencia fundamental entre todas las moléculas
de ADN que forman el material genético de los seres vivos es la secuencia de estas
cuatro bases nitrogenadas (Laura Margarita Márquez Valdelamar 1)
4. La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías más
utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos.
Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función de
su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el
contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su
concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del gel los fragmentos de
ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones. La
electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia primordial
en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética. La idea de
utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de
ADN corresponde a Vin Thorne, un bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow,
quien a mediados de los años 60 del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las
distintas formas de ADN
5. En el informe aremos un practica virtual donde utilizaremosel programa simulale
Agarose Gel Ha alterado drásticamente la investigación que hace mi laboratorio,
dándonos la confianza para afrontar la clonación difícil con un mínimo esfuerzo analizar
el ADN O ARN en este caso analizaremos bacterias y encimas

4. 2. MARCO TEORICO:
i. La electroforesis de ADN puede realizarse en geles de agarosa o de
poliacrilamida. Ambos tienen características diferentes en cuanto a
sus propiedades y modo de preparación, por lo que se utilizará uno
u otro en función de la aplicación y objetivos que persigamos. La
electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para
separar y purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto
poder de resolución. Por su parte, la electroforesis en geles de
poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitación en cuanto al
tamaño de los fragmentos que podemos separar (5-600 pb), posee
un poder de resolución mucho mayor, permitiendo la separación de
moléculas que difieren en un sólo par de bases. Los geles de
poliacrilamida se corren de forma vertical y tienen la desventaja de
ser más complicados en su elaboración y manipulación.
3. Los geles de agarosa tienen un poder de resolución mucho menor que los de
poliacrilamida, porque no permiten separar moléculas de ADN que difieren en
tamaño menos de unas 50 pb. Sin embargo, el rango de tamaños que pueden
separarse es mucho mayor en un gel de agarosa (moléculas desde 50 pb hasta
unas 40 kb) dependiendo de la concentración del mismo (0.3-2% p/v); cuanto más
baja es la concentración de agarosa mayor es el tamaño de las moléculas que
pueden separarse, y viceversa
4. La electroforesis en gel de agarosa tiene un límite superior de unas 40-50 kb en el
tamaño de las moléculas de ADN que puede separar. Por lo tanto, no es posible
separar el producto de digestiones con enzimas de restricción de corte infrecuente,
como NotI o SfiI, y menos aún separar cromosomas enteros (los cromosomas de
eucariotas inferiores tienen tamaños de entre 0.2 y 12 Mb). Reducir la concentración
de agarosa hasta un 0.1 o 0.2% puede incrementar el límite de separación hasta los

5. 750 pb, sin embargo estos geles son extremadamente frágiles y muy difíciles de
manipular.
a. Esquema del sistema de electroforesis convencional en gel de agarosa. El
rectángulo representa la cámara de electroforesis con los electrodos positivo

6. y negativo, y en el centro en gris más claro el gel de agarosa con sus pocillos.
La flecha indica la dirección de migración del ADN.
b. Esquema del fundamento del sistema de electroforesis en gel de campo
pulsado (PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis), en este sistema dos
campos eléctricos en ángulo sobre el gel funcionan de forma alternante.
c. Esquema de uno de los sistemas de electroforesis en gel de campo pulsado
más utilizados, el CHEF (Contour-Clamped Homogeneous Electric Field).
Las líneas formando un hexágono representan los electrodos. La distribución
de cargas permite que el campo eléctrico sea homogéneo en todo el gel y
de esta forma evitar distorsiones en la migración del ADN en los diferentes
carriles.
d. Protocolo Electroforesis de ADN en gel de agarosa
5. La agarosa es un polímero lineal compuesto de residuos alternantes de D-galactosa
y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por enlaces glucosídicos α(13) y β(14). Las
cadenas del polímero de agarosa forman fibras helicoidales, que al solidificar forma
una malla tridimensional de canales con diámetros entre 50 y >200 nm (Kirkpatrick
1990). Existen diferentes tipos de agarosa que se clasifican en función de la
temperatura a la que se disuelven y solidifican. Las agarosas estándar se disuelven
en el buffer a una temperatura de 90-95°C y solidifican a 35-45°C. Las agarosas de
bajo punto de fusión se disuelven a unos 65°C y solidifican a 30-35°C. Existen
además otros tipos, como las agarosas de alta fuerza de gel o las de baja viscosidad,
que permiten respectivamente una mejor separación y un rango inferior del tamaño
de las moléculas a separar. La concentración (p/v) de la agarosa es un parámetro
de gran importancia pues determina el rango de tamaños en los que obtendremos
una buena separación de los fragmentos de ADN. En la Tabla 1 se muestran las
concentraciones de agarosa que es recomendable utilizar en función del rango de
tamaño que pretendamos separar.
6. Equipo
7. Cámara horizontal de electroforesis con los accesorios correspondientes (molde
para hacer el gel, peine, cables para conectar a la fuente de alimentación)
8. Fuente de alimentación o de poder Electroforesis de ADN 33
9. Transiluminador (fuente de luz ultravioleta)
10. Equipo fotográfico que permita tomar fotos del gen

7. 11. Estos dos últimos aparatos es preferible sustituirlos por un equipo de análisis de
geles, el cual incluye la fuente de luz ultravioleta, el equipo fotográfico para la toma
y digitalización de imágenes, y un equipo de cómputo con Software que permite
distintos tipos de análisis, como el densito métrico. Ejemplos de este tipo de equipos
son el Molecular.

8. 3. MATERIALES Y METODOS:

12. 4.

13. 5.

17. 4. PREGUNTAS.
1.- ¿Qué es un gel de agarosa y cómo influye la concentración en la migración de los fragmentos
de ADN?
Es un polisacárido natural provenientes de las algas. Su función es la separación de
cadenas en tamaños pequeños hasta un rango de kb( kilobases). El gel suele correrse de
manera horizontal y. con buffer de manera TBE (Tris, Borato, EDTA) y TAE (Tris, Ácido
Acético, EDTA). Para la migración de los fragmentos de ADN, se separa por tamaño en
un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional
al logaritmo de su peso molecular, ya que es sabido que el ADN tiene una uniforme
relación masa / carga.
2.- ¿Dibuje a mano el proceso de la PCR?

19. 3.- ¿Dibuje a mano el proceso de la electroforesis?
4.- ¿En el primer video mostrado por el profesor por que las muestras de ADN son mesclados
con un colorante azul? ¿Cómo se llama?
El buffer de carga (azul), cargar y visualizar las muestras en el gel, para poder interpretar cargar
un marcado de peso molecular, glicerol presente en la muestra de carga, bromuro etidio. El
buffer de carga (azul) contiene colorante que sirve para visualizar la migración de DNA durante
el proceso de electroforesis.
5.- ¿Qué es el bromuro de etídio (BrEt), como lo podemos remplazar, existe otros colorantes?
existe otros colorantes?
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante (se intercala entre las bases nitrogenadas)
que se usa como colorante fluorescente para la visualización de ácidos nucleicos en geles de
agarosa y poliacrilamida. Lo podemos remplazar por GelRed™ y GelGreen™ son tintes
fluorescentes ultra sensibles para ácido nucleico, extremadamente estables y ambientalmente
seguros; diseñados para reemplazar el altamente tóxico bromuro de etidio (EtBr) para teñir dsDNA
(DNA bicatenario), ssDNA (DNA monocatenario) o RNA en geles de agarosa o geles de
poliacrilamida. Si existen otros colorantes que pueden remplazar al bromuro de etidio

20. 6.- ¿Por qué se utilizaron dos marcadores de peso molecular?
Un marcador es un carácter o un gen que debido al ligamiento puede usarse para indicar la presencia
de otro gen; es decir, cualquier característica A (sea un gen, una proteína, tipo de hoja, etc.) que
esté asociada a la presencia o expresión de una característica B (como vigor, altura, resistencia a
enfermedades, etc.) puede considerarse como un marcador, pues la presencia de A necesariamente
implica la de B. La importancia de los marcadores radica en que ofrecen la posibilidad de estudiar
poblaciones de organismos y seleccionar aquellos que presentan rasgos de interés para el hombre.
En ocasiones, el uso de marcadores permite seleccionar los individuos aun antes de que expresen
el rasgo de interés.
7.- ¿Cuál es tamaño molecular de cada gen obtenido por usted, en caso que se sea de
diferentes tamaños como justifica?
En el caso del peso molecular ya está determinado en el cuadro que nos presenta el resultado, por
ejemplo si nosotros colocamos el click en una de las bandas ahí nos indica los pares de bast que
tiene cada una, y los números que salen a la izquierda de los datos de las bandas serian el peso
molecular pero en KB, los tamaños se justifica por las secuencias escogidas, es decir a mayor
secuencia como 4000 pb y otro de 1500 pb, el peso molecular de la de 4000pb se colocaría primera
en nuestros resultados, indicando su peso molecular mas alto.

21. 6.

22. 8.- ¿Tipos de electroforesis y cómo funciona en gel de agarosa para segmentos de ADN?
TIPOS
 La electroforesis en gel se utiliza en biología molecular, genética y bioquímica:
 Electroforesis de frente móvil o libre
 Electroforesis de zona: (convencional)
 En papel
 En acetato de celulosa
 En gel (agarosa, poliacrilamida y almidón)
 Electroforesis capilar
 Electroforesis de ADN.
 Zimografía o zimogramas
 Extracción en gel.
Electroforesis en gel de campo pulsado La electroforesis en gel de agarosa es de las más
utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su
tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en
una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores
de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño
aproximado del DNA en estudio
9.- ¿Es posible recuperar un fragmento de ADN del gel de agarosa para clonar en un plásmido y
mantener en un organismo? Fundamente.
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular muy comunes en bacterias que se
replican de modo autónomo e independiente del cromosoma de la célula. Constituyen una
herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se pueden usar
como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés y de esta forma
amplificarlo (es lo que se llama “clonar” un fragmento de DNA).

23. La frecuente necesidad de recuperar y purificar fragmentos de ADN separados sobre geles de
agarosa y poliacrilamida ha llevado al desarrollo de gran variedad de métodos (1 -9). Teniendo
en cuenta que ninguno ha mostrado ser plenamente satisfactorio, se han realizado
modificaciones a cada uno de ellos con el fin de hacerlos más eficientes. Uno de los métodos
utilizados es la electroforesis y recuperación sobre un papel de DEAE-ce lulosa. Es una técnica
simple que se puede aplicar a varias muestras simultáneamente. El ADN obtenido es de alta
pureza.
10.- ¿Qué son las enzimas de restricción, mencione 10?
Las enzimas de restricciónson aquellas que presentan actividad endonucleasa, son de origen
bacteriano y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica
denominada secuencia diana. El uso de estas enzimas como herramienta biotecnológica surgió de
la necesidad de cortar las largas cadenas de ADN genómico para manipularse y analizarse en
fragmentos más pequeños. El empleo de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican
ácidos nucleicos, como la ligasa, permitió desarrollar la metodología del ADN recombinante.
11.- ¿En sus secuencias obtenidas en el patrón de corte indique cuantas enzimas fueron de tipo
palindrónicas y por qué no metilan? Describa en un cuadro

27. 7.

28. 12.- ¿En sus secuencias obtenidas por el patrón de corte indique cuantas enzimas fueron de
tipo Romo y cuáles serían sus consecuencias? Describa en un cuadro.

31. 13NO TIENE SMIL
14 NO TINE
La 5, 10 11 no tiene para realizar e rome los demás si