Présentation de MALLEK Ramdane rmallek@lab-cerba.com Biologie Moléculaire et génomique, Laboratoire Cerba, Saint-Ouen l'Aumône, France Institut Pasteur de Tunis 6 Avril 2019

1. 1
Le séquençage haut débit:
NGS
Une révolution de la biologie
moléculaire au service des patients
MALLEK Ramdane
rmallek@lab-cerba.com
Biologie Moléculaire et génomique, Laboratoire Cerba, Saint-Ouen l'Aumône, France
IPT, Tunis 06 Avril 2019

2. UNE PETITE QUESTION POUR COMMENCER
• Quelle est la taille (en bases) du génome ?
• Humain :
• Bactérie Escherichia coli :
• Cytomégalovirus humain :
2

3. UNE PETITE QUESTION POUR COMMENCER
• Quelle est la taille (en bases) du génome ?
• Humain : 2,99 Milliards
• Environ 20.000 gènes (1,2% du génome) de 0,9Kb (SRY) à
2,4Mb (DMD)
• Environ 220.000 exons
• Bactérie Escherichia coli : 4,64 Millions
• Cytomégalovirus humain : 2360
3

4. UN PEU DE TERMINOLOGIE
• Séquençage « ancienne génération » ou bas débit =
Séquençage type Sanger  méthode de référence
Permet de décrypter quelques centaines de pb à la fois
• Séquençage de nouvelle génération (Next Generation
Sequencing NGS) = Séquençage à très haut débit (High
Throughput Sequencing HTS)= Séquençage massif en
parrallèle MPS= dénomination unique « post Sanger »
Permet de décrypter jusqu’à 6 milliards de pb à la fois
4

5. PROJET GÉNOME HUMAIN : 1990-2003
5
1866 1953 1977 1983 2003 2005 2008
2019: ILLUMINA annonce WGS entre 1000 et 2000 $

6. caryotype
FISH
SNP-arrays
PCR
LES OUTILS DIAGNOSTIQUES EN GÉNÉTIQUE
Séquençage
6

7. SÉQUENÇAGE DE TYPE SANGER
7
https://www.youtube.com/watch?v=3M0PyxFPwkQ

8. SÉQUENÇAGE DE TYPE SANGER
8
• Avantages
• Relativement peu coûteux (sauf rapporté à la base séquencée)
• Equipement « standard »
• Analyse des résultats simples (expertise limitée)
• Les limites
• Connaissance à priori de la cible (ce sont des produits de PCR qui sont
séquencés et non pas la séquence originelle)
• Faible débit
• Analyse séquentielle individuelle
• Pas de possibilité de multiplexage
• Seuil de sensibilité (détection de variant minoritaire) faible : environ 20%

9. Par run Séquençage SANGER Séquençage NGS
Petit débit
Séquençage NGS
Moyen débit
Séquençage NGS
Haut débit
Instrument ABI3130XL Illimuna MiSeq Illimuna NextSeq Illimuna 1500
Nombre de reads 96 25 millions
(single reads 36bp)
400 millions
(single reads 75bp)
1.5 milliards
(single reads 27bp)
Capacité 300KB (300 10+3) 15GB (15 10+9) 120GB (120 10+9) 300GB (300 10+9)
Durée 24H 56H
(2*300bp)
29H
(2*150bp)
11J
(2*100bp)
LA RUPTURE TECHNOLOGIQUE DU SÉQUENÇAGE A HAUT
DÉBIT (NGS) A PARTIR DE 2006
X 400.000 X 1.000.000X 50.000

10. Par run Séquençage SANGER Séquençage NGS
Petit débit
Séquençage NGS
Moyen débit
Séquençage NGS
Haut débit
Instrument ABI3130XL Illimuna MiSeq Illimuna NextSeq Illimuna 1500
Nombre de reads 96 25 millions
(single reads 36bp)
400 millions
(single reads 75bp)
1.5 milliards
(single reads 27bp)
Capacité 300KB (300 10+3) 15GB (15 10+9) 120GB (120 10+9) 300GB (300 10+9)
Durée 24H 56H
(2*300bp)
29H
(2*150bp)
11J
(2*100bp)
LA RUPTURE TECHNOLOGIQUE DU SÉQUENÇAGE A HAUT
DÉBIT (MPS)
AUDI A1 105CH ARIANE 5 21.500CH
10

11. SÉQUENÇAGE A HAUT DÉBIT : COMMENT ÇA FONCTIONNE ?
11
Pour ADN plusieurs approches possibles selon le besoin
- Séquençage de 1 ou plusieurs gènes en même temps (panel)
- Séquençage de l’exome ou WES
- Séquençage de l’ensemble du génome WGS
1- Définir le besoin
2- Extraction des Acides nucléiques à partir de l’échantillon biologique (ADN ou ARN)
Sang Total EDTA
Plasma
Tumeur
FFPE
Liquide Amniotique
Biopsie liquide

12. SÉQUENÇAGE A HAUT DÉBIT : COMMENT ÇA FONCTIONNE ?
12
2- Préparation de l’échantillon = Préparation de la Librairie
Adaptateur (INDEX)

13. SÉQUENÇAGE A HAUT DÉBIT : COMMENT ÇA FONCTIONNE ?
13
Flowcell= lame de verre sur laquelle
va se fixer la librairie et avoir lieu de
séquençage

14. SÉQUENÇAGE A HAUT DÉBIT : COMMENT ÇA FONCTIONNE ?
14

15. SÉQUENÇAGE A HAUT DÉBIT : COMMENT ÇA FONCTIONNE ?
15
*La librairie est ensuite amplifiée sur la Flowcell
Librairie

16. SÉQUENÇAGE A HAUT DÉBIT : COMMENT ÇA FONCTIONNE ?
16
*Séquençage par synthèse:

17. 17

18. Etudier le génome
La bioinformatique
Si vous tapiez les lettres du génome humain à raison de 60 mots par minute
durant 8 heures par jour, il vous faudrait... 50 ans pour le transcrire.
Duffourd Yannis Bioinformaticien – CHU Dijon 18

19. Etudier le génome
La bioinformatique
La bioinformatique est l’ensemble
des méthodes qui convertissent
les données biologiques en
informations.
Approche multidisciplinaire impliquant
l’informatique, les mathématiques, des
méthodes statistiques, ainsi qu’une
profonde compréhension des
problématiques biologiques.
Au delà de la prouesse technologique
le NGS nécessite de disposer de
compétences Bioinformatique

20. Etudier le génome
La bioinformatique
A quoi sert la bioinformatique ?
TCGATCTGATGAAA
GCATGATCGCATCGCATCACATATCT
 Reconstituer ces séquences pour
retrouver la séquence totale
 Comparer la séquence à la séquence
de référence
 Identifier les variants
 Déterminer leur impact
Analyser un génome requiert environ
1 Milliard de séquences de 150 bases
Duffourd Yannis Bio-informaticien – CHU Dijon
 Mise en place d’un environnement Haute performance (HPC) avec serveurs sur site
pour analyse et stockage des données

21. INTÉRÊT, CONSÉQUENCE ET IMPACT DE
L’IMPLÉMENTATION DU NGS DANS UN LABORATOIRE
21
Réduction du coût de
séquençage (par base*)
Augmentation des
capacités (par run)
Possibilité de
séquençage de novo
Plus de gènes
séquencés par patient
Plus de patients
séquencés par gène
Nouvelles applications
Réduction du temps au
diagnostic
ET/OU

22. QUESTION :
POUR QUELLES
APPLICATIONS ?
22

23. 23
Diagnostic
prénatal
Génétique
constitutionnelle
Maladies
infectieuses
Génétique
somatique
NGS

24. GÉNÉTIQUE CONSTITUTIONNELLE
24
Génétique
constitutionnelle
MPS
 Les maladies rares
- Une maladie est dite « rare » lorsqu’elle atteint moins de une
personne sur 2 000.
- Très nombreuses (plus de 8.000 décrites)
*En Tunisie, plus de 400 maladies rares et environ 600 000
Tunisiens, soit une personne sur vingt serait atteinte d’une
maladie rare, dont 85 % sont d’origine génétique. C’est ce
que Sanofi Tunisie et l’Association Tunisienne des Maladies
Lysosomales (ATML) ont annoncé lors de la 12ème Journée
internationale des maladies rares, le 28 février 2019.

25. 25
Errance diagnostique (8 ans!):
Séquençage ciblé des gènes MID1, MED12, UPF3B négatif !
Caryotype avec recherche de microdélétion 22q11.2 négatif
WES le 01/03/2017: NM_001101.3(ACTB):c.1043C>T (p.Ser348Leu)
hétérozygote de novo
ACTB est à l’origine du Syndrome de Baraitser-Winter
autosomique dominante
Le Syndrome de Baraitser Winter est une maladie très rare, seulement 30 patients
rapportés !
Déficience intellectuelle, retard global des
acquisitions, retard du langage, retard de
motricité, retard de croissance, dysmorphie,
suspicion de malformation cardiaque.
Maladie rare non reconnue = errance Diagnostique

26. La médecine de précision a pour objectif de
proposer au patient un traitement adapté
aux caractéristiques génétiques
de sa tumeur
MEDECINE DE PRECISION
26
Génétique Somatique (onco)

27. 27
Pathologie Biomarqueur Nombre de patients testés
Pourcentage de patients
présentant une altération
moléculaire
Thérapies ciblées associées
 Cancer du sein Amplification d’HER2 10 832 19,7 %
Trastuzumab, Pertuzumab
Lapatinib
 Cancer de l’estomac Amplification d’HER2 770 23,5 % Trastuzumab
 Cancer colorectal
Mutations de KRAS 21 923 43,7 % Panitumumab, Cetuximab
Mutations de NRAS 17 814 5,2 % Panitumumab, Cetuximab
 GIST
Mutations de KIT 1 218 65,5 % Imatinib
Mutations de PDGFRA 1 083 15,4 % Imatinib
 Cancer du poumon
Mutations d’EGFR 28 563 13,4 %
Gefitinib, Erlotinib
Afatinib, Osimeritinib
Translocation d’ALK 12 434 3,1 % Crizotinib, Ceritinib
Translocation de ROS1 17 680 1,0 % Crizotinib
 Mélanome Mutation de BRAF V600 5 583 37,2 %
Vemurafenib, Dabrafenib
Cobimetinib, Trametinib
 Leucémies
Détection de BCR-ABL 10 263 16,7 %
Imatinib, Dasatinib, Nilotinib,
Bosutinib, Ponatinib
Mutations d’ABL 1 014 22,4 %
Imatinib, Dasatinib, Nilotinib,
Bosutinib
Ponatinib
 Leucémie lymphoïde
chronique
Mutation de TP53 2 309 1 % Idelalisib
 Ovaire Mutation somatique de BRCA 1 608 12,6 % Olaparib
LES THERAPIES CIBLEES
27

28. VERS UNE MÉDECINE PERSONNALISÉE
28

29. NGS ET DIAGNOSTIC PRÉNATAL
29
Diagnostic
prénatal
MPS
 Dépistage des trisomies 13, 18 et 21 par analyse de l’ADN fœtal circulant
o Implémentation en routine clinique en France : Novembre 2013

30. Prélèvement tissulaire
Biopsie liquide
Vallée et Denis, Corresp Onco-Ther. 2013
ADN
circulant
(fragments)
Cellules
Tumorales
Circulantes
NGS ET « ADN CIRCULANT » (SUITE)
 Concept de biopsie liquide : le patrimoine tumoral dans un tube
30

31. 31
EN CONCLUSION…

32. 32
LA SUITE :
LES TECHNOLOGIES DE 3ÈME GÉNÉRATION
Oxford Nanopores
Single Molecule Real Time Sequencing
Le passage de la molécule d’ADN à
travers le nanopore provoque un
différentiel osmotique mesurable et
quantifiable en fonction de la base
Utilisation d’un nanopore
modifié dans une membrane

33. LA NOUVELLE ARME DE LA GÉOLOCALISATION ?

34. LA NOUVELLE ARME DE LA GÉOLOCALISATION ?
34
• Avec 1 connexion internet et utilisation de données publiques , il est capable
d’identifier l’identité de personnes qui ont bénéficiés de tests génétiques