Slides su Silenziamento Genico NON sono di mia produzione.

1. RNA INTERFERENCE: TECNICHE E APPLICAZIONI
Catia Giovannini
U.O. Medicina Interna
Prof. L. Bolondi

2. Scoperta dell’RNA interference
La scoperta dell’RNAi avvene nel tentativo di aumentare l’attività del
gene della calcone sintasi (un enzima coinvolto nella produzione di
specifici pigmenti) in petunia. Inaspettatamente la pigmentazione non
aumentò, si ebbe una variegazione del colore e, in alcuni casi la
toatale perdita dello stesso.
Questo fenomeno fu definito
co-soppressione, intendendo
la soppressione sia del gene
introdotto che di quello endogeno.

3. RNA interference (RNAi)
• RNAi compreso solo dopo gli esperimenti di Fire e Mello (Fire et al., Nature
1998).
• RNA a singolo filamento agisce come inibitore poco efficiente.
• L’RNA a doppia elica (dsRNA) è un inibitore potente.
• Alterazioni fenotipiche possono essere indotte, in C. Elegans,
solo con sequenze complementari a regioni esoniche
suggerendo un silenziamento post-trascrizionale.

4. RNA interference
• L’RNAi è un processo mediante il quale RNA doppio-
strand silenzia, in modo sequenza-specifico, l’espressione
genica attraverso l’appaiamento con l’ mRNA bersaglio
seguito dalla sua degradazione, quindi: SILENZIAMENTO
POST-TRASCRIZIONALE.
• Meccanismo biochimico altamente conservato che
coinvolge più di 10 geni e set di proteine correlate.

5. RNA interference
• Funzioni biologiche:
Resistenza ai virus (piante,insetti): il dsRNA si forma grazie ad
appaiamenti intramolecolari dell’RNA virale.
Silenziamento dei trasposoni (dimostrata dall’osservazione che
l’innattivazione dei geni coinvolti nell’RNAi nei nematodi causa
l’attivazione di molti trasposoni nella linea germinale).
Regolazione dell’espressione genica.

6. Meccanismo base dell’RNAi
Il modello funzionale dell’RNAi consta di tre fasi fondamentali:
Fase di “iniziazione”:
taglio del dsRNA in siRNA (21-23nt)
Fase “effettrice”:
il siRNA viene incorporato in un
complesso proteico definito RISC “ RNA-
induced silencing complex”
Fase di “amplificazione”:
sintesi di nuovo dsRNA da parte di una
RNA-polimerasi RNA-dipendente

7. Meccanismo
FASE DI INIZIAZIONE
Enzima ribonucleasico della
superfamiglia delle RNAsi III.
Genera siRNA di 21-23 paia
di basi
ATP
DICER
ADP + Pi
siRNA

8. FASE EFFETTRICE
Costituito da due RNA binding proteins e
da una nucleasi chiamata Slicer
RISC RISC ATTIVATO
ATTIVAZIONE
ATP ADP + Pi
Target mRNA

9. RNA polimerasi-RNA dipendente: un sistema di
amplificazione
• Sono stati identificati due meccanismi di amplificazione entrambi
operati da una RNA polimerasi-RNA dipendente (RdRP).
• Le amlificazioni aumentano il substrato per il Dicer o per il RISC, in
entrambi i casi il RISC avrà la possibilità di effettuare un maggior
numero di tagli.

10. Amplificazione dell’mRNA aberrante
RdRP
Serve come substrato per il Dicer nella fase
di iniziazione

11. Amplificazione del singolo filamento di RNA generato dal
RISC
RISC
Attivazione
RdRp
Taglio dell’ mRNA
target

12. RNAi in cellule di mammifero
• In cellule di mammifero sono state riscontrate più difficoltà nell’indurre
RNAi utilizzando lunghi dsRNA. Questo perché a seguito dell’introduzione
di dsRNA, spesso a rispondere non è un silenziamento sequenza specifico,
ma un sistema che inibisce tutta l’espressione proteica cellulare. Il dsRNA
introdotto in una cellula di mammifero interagisce con una proteina
chinasica (PKR) che scatena la risposta immunitaria dell’interferone
bloccando globalmente la trascrizione.
• La risposta interferonica non viene scatenata se vengono introdotti nella
cellula direttamente siRNA o shRNA.

13. siRNA
Il crescente interesse per questa metodologia di silenziamento
genico ha permesso lo sviluppo di software che, attraverso algoritmi
specifici, generano i possibili siRNA applicabili ad un determinato
mRNA target. La potenzialità di questi software, abbinata alla
possibilità di allineare, attraverso BLAST, tutte le sequenze presenti
nelle banche dati permette di individuare geni che potrebbero
essere silenziati contemporaneamente per omologia di sequenza.

14. siRNA
• Numerose collezioni di siRNAs, sintetizzati chimicamente, sono oggi
disponibili in commercio, per i diversi mRNA delle diverse specie.
• Non vengono fornite informazioni sulla sequenza dei siRNA, talvolta
è indicato l’esone contenente la sequenza di appaiamento con il
siRNA.
• Solitamente testati in alcune linee cellulari.

15. Progettare i siRNA
I piccoli RNA sintetizzati chimicamente (siRNA) sono facilmente
transfettabili. Una volta introdotti in una cellula, non devono essere
processati da Dicer e vengono direttamente incorporati nel RISC
guidando la degradazione dell’mRNA. Massimo knockdown dopo 2-3
giorni dalla trasfezione.

16. Progettare i siRNA
siRNA “potenzialmente” funzionale:
• La regione target deve essere a valle del codone di inizio, ad una
distanaza che varia da 50 a 100bp.
• Lunghezza compresa fra 19-22 bp.
• Contenuto in GC fra il 35-55%
2-nt 3´ overhangs di residui di uridina
5´-phosphate and 3´-hydroxyl group.

17. Scelta dei siRNA
Confrontare i siRNAs forniti da almeno tre ditte diverse per uno
stesso messaggero.
1005-1027
GTGAGAGCTGCAGTCAGAATATCGATG
GGTGAGCTGCAGTCAGAATATCGATGA 1006-1028
TGCTCTGCGAGATTAATGAGGATGA 3546 42.86 ATGGGGGGACCTGCCGTGGCTATAT 3366-3386
TTGACCTCGTGGCCCGCTATCTCT 3495-3514
CCCGAGGTGATCGGCTCGGTAGTAA 4805 52.38
TGGGGGTGCTCTGCGAGATTAAT 3536-3558
AGGGCCCCTTTGTAACGTGGAGATC 2032 42.86
GGGGTGCTCTGCGAGATTAATGA 3538-3560
CGAGGGTGATCGGCTCGGTAGTAAT 4806-4826
CCTGCCACGAGGATGCTATCTGT 52.63 % 1158
CATAGGCCAGTTCACCTGTATCT 47.37 % 1429
GGCCGTACTGGTAGCCACTGTGA 52.63 % 3345
GGGGTGCTCTGCGAGATTAATGA 42.11 % 3542
GTGCTGGCGCCTCTTCAACAACA 52.63 % 4378
GAGGTGATCGGCTCGGTAGTAAT 47.37 % 4808
AGCTGCAGTCAGAATATCGATGA 42.11 % 1010

18. Scelta dei siRNA
RISC
RISC incorpora il filamento con la minor stabilità interna al 5’

19. G 1 10 20 G 1 10 20
-13.0 -13.0
-12.5 -12.5
-12.0 -12.0
-11.5 -11.5
-11.0 -11.0
-10.5 -10.5
-10.0 -10.0
-9.5 -9.5
-9.0 -9.0
-8.5 -8.5
-8.0 -8.0
-7.5 -7.5
-7.0 -7.0
-6.5 -6.5
-6.0 -6.0
-5.5 -5.5
-5.0 -5.0

20. Effect off-target
Testare sempre più siRNA per trovarne almeno due che abbiano lo
stesso effetto a livello cellulare. In questo modo si esclude la
possibilità che i siRNAs utilizzati silenzino geni diversi dal target
(effect off target).
Il silenziamento aspecifico può essere causato anche dall’elica senso
(identica all’mRNA bersaglio).

21. Vettori plasmidici
RNA polymerase III
promoter
• U6 promoter
• H1 promoter
Non necessitano di sequenze indispensabili per la trascrizione a valle del
promotore.

22. shRNA

23. Vettori virali
shOligo
cloning site
XhoI or
HdIII Bgl 2 RI Puro
MSCV 3’SIN
LTR Ts H1 Pgk Blast LTR
GFP
pSuper.retro puro original (pSR); and
Blast and GFP derivatives (pSB & pSG):
Moloney retroviral vectors harboring
H1 Pol III promoter driven shRNAs
AMP ori
= PCR primers for
H1= HI Pol III promoter DNA sequencing
Pgk= Phosphoglycerol kinase Pol II promoter and pENTR/D-Topo
Ts = 5 X Tter Pol III termination signal > Gateway cloning

24. Fattori determinanti l’efficienza di silenziamento
• Incorporazione e stabilità all’interno del complesso RISC dei siRNA
• Frequenza di traduzione dell’ mRNA target
• Abbondanza ed emivita dell’ mRNA target
• Struttura secondaria e terziaria dell’mRNA
• Quantità di polisomi ancorati all’mRNA in traduzione
• Proliferazione cellulare

25. Technology
Steps del silenziamento genico:
1. Sintesi di siRNAs e/o scelta del vettore plasmidico.
2. Ottimizzare la trasfezione del siRNA o del vettore plasmidico.
3. Valutare l’efficenza del silenziamento mediante PCR e westen blot.
Un siRNA è efficente se il silenziamento genico è superiore al 70%

26. Applicazioni in vivo

27. Applicazioni in vivo
I siRNAs in circolo vengono rapidamente degradati dalle
ribonucleasi del siero. Sono state, recentemente,
sviluppate modificazioni chimiche che proteggono le
molecole di siRNA dalla degradazione e che potrebbero
indirizzare i siRNA in tessuti specifici.

28. Applicazioni
Antitumor activity of small interfering RNA/cationic liposome
complex in mouse models of cancer. (Yano J. Clin Cancer Res.
2004)
Cholesteryl Oligoengine delivering vascular endothelial growth factor
siRNA effectively inhibits tumor growth in colon adenocarcinoma.
(Kim W. J. Mol. Ther. 2006)
Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors
by using atelocollagen in vivo. (Takeshita F., Proc Natl Acad Sci,
2005)

29. miRNA
RNA a singolo filamento, lunghi 19-25nt, funzionano come repressori
nella regolazione genica in eucarioti.
Alcuni miRNA possiedono un proprio locus, altri sono contenuti all’interno
di regioni introniche di sequenze codificanti
Regolano l’espressione di geni target a livello della traduzione bloccando
il legame del ribosoma. Omologia non completa con l’RNA target a livello
del 3’UTR. Mediano la degradazione dell’RNA bersaglio solo nelle piante.

30. miRNA
• Circa la metà dei miRNA conosciuti si trova in prossimità
di altri miRNA. Questi cluster di miRNA vengono trascritti
da propri promotori a partire da una singola unità di
trascrizione policistronica generando un trascritto
primario policistronico (pri-miRNA)
• La trascrizione dei geni del miRNA viene
effettuata dalla RNA polimerasi II (polII)

32. Il MicroProcessor protein complex
(che include la RNAsi III Drosha)
Taglia il pri-miRNA a pre-miRNA.
Ida Adriansson

33. RNAi nel nucleo
Nelle piante i miRNA maturi
possono rientrare nel nucleo e
appaiarsi all’mRNA target che sta
finendo di trascriversi dal suo
DNA codificante. Il DNA viene
così metilato a valle delle
sequenze di legame con il miRNA.

34. RdDM (RNA-directed DNA methylation)
Nelle piante si è osservato che dsRNA contenenti sequenze omologhe
a promotori possono determinare la metilazione degli
stessi generando un silenziamento trascrizionale del gene a valle.
L’RdDM attua una metilazione de novo delle citosine presenti in
qualsiasi contesto di sequenza, non solo in presenza dei dinucleotidi
GC, considerati il tipico target della metilazione.

35. Grazie per l’attenzione