2. Tamaño celular Las células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son de pequeño tamaño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualización. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 µm), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos líneas separadas 1mm de distancia; si hay dos líneas a 200 µm de distancia, veremos una sola línea. Los microscopios se utilizan para mejorar la resolución.
3. Tamaño celular La invención del microscopio en el siglo XVII posibilitó la serie de descubrimientos posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio óptico simple, examinó un corte de corteza, encontró que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cámaras, que llamó “células”, en realidad sólo vio las paredes celulares, ya que este tejido está muerto a la madurez y las células ya no tienen contenido. Mas tarde, Hooke y algunos de sus contemporáneos observaron células vivas.
5. Microscopio óptico El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces.
6. Microscopio óptico El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes.
7. El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazón con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especímenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectángulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espécimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través de la muestra. Los Microscopios Ópticos actuales tiene un poder resolutivo de 0,2 µm, unas mil veces la del ojo humano.
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9. Sistema Mecánico Pie Vastgo o columna Tornillos de ajuste macrométrico Micrométrico Tubo Platina Subplatina Sistema Óptico De Observación Ocular Objetivo De iluminación condensador Espejo Fuente de luz
10. Sistema mecánico Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para la iluminación y enfoque del preparado. Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato. Columna: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico. Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite el enfoque.
11. Pie y Tornillo de ajuste Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro metálico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexión de la luz. Normalmente tiene una longitud de 170 mm.
12. Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz y un vernier que posibilita la relocalización de los detalles de interés. Subplatina: sostiene al condensador y se ubica por debajo de la platina.
13. SISTEMA ÓPTICO Se compone de un sistema óptico de observación y un sistema óptico de iluminación; el primero consta de: Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio).
14. CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS: ESCALA DE REPRODUCCIÓN: relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc. PODER DEFINIDOR: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos nítidos. LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado.
15. CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS: PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en relación inversa con el límite de resolución. PODER DE PENETRACIÓN: es la propiedad de permitir la observación simultánea de varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproducción o aumento. DISTANCIA FRONTAL: es la distancia de la lente frontal al preparado colocado en la platina, cuando está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo. AUMENTO TOTAL: Debemos notar que el ocular también tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400.
16. Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora.
17. El sistema óptico de iluminación consta de: Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo de él se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador.
18. Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (lámpara incandescente común) aproximadamente a 30 cm. del espejo.
19. Consideraciones Imagen.Se debe tomar en consideración que la imagen de un microscopio óptico se encuentra siempre “cabeza abajo” y si se mueve la preparación hacia un lado se observa que se desplaza en sentido opuesto, estas características se encuentran siempre presentes en un microscopio óptico y debemos acostumbrarnos hasta encontrarlo normal.
20. Consideraciones 2. Enfoque.El enfoque de una preparación debe iniciarse siempre con el objetivo de menor aumento (lupa o 10X) ya que estos quedan siempre mas alejados de la platina; se debe subir la preparación con el tornillo micrométrico hasta el tope siempre mirando por un lado del microscopio para evitar que choque el objetivo con la preparación, después mirando a través del ocular se empieza a bajar lentamente la platina hasta localizar el foco, es decir donde la preparación se observa nítidamente. La mayor parte de los microscopios actuales están pre focalizados, lo que indica que al quedar en foco la lupa, los demás objetivos quedaran también enfocados, y solo se requiere de un pequeño ajuste del tornillo micrométrico para ver nítidamente la imagen.
21. Consideraciones Empleo del objetivo de inmersión en aceite (x100).Se deben utilizar preparaciones teñidas completamente secas. Para esto se pone una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la porción que se va a examinar. Preferentemente se deben utilizar aceites sintéticos que no se secan, en vez de aceite de madera de cedro que se seca rápidamente.
22. Consideraciones Determinación de la posición de los objetos observados.El círculo luminoso que se observa a través del ocular se denomina campo microscópico y los objetos que se observan en el se pueden localizar en relación con las manecillas del reloj. Inversión de las imágenes. Las imágenes son invertidas por los lentes. De esta manera los objetos que aparecen en el fondo del campo microscópico se encuentran realmente en la parte mas alta y los objetos que se encuentran en el lado izquierdo del campo microscópico se encuentran realmente en el lado derecho.
23. Consideraciones Preparación de la muestra.Ya que los microorganismos son transparentes es difícil distinguirlos con este tipo de microscopía y es por lo que se suelen teñir. Observación microscópica Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a: - Preparación húmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente. - Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y habitualmente, con objetivos de inmersión
24. Tinciones Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante.
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26. Tinciones - Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante.
27. Tinciones - Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.
29. Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para especímenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro.
30. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina
31. Aplicaciones Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases, estriba en que permite observar las células en acción y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migración celular. Puesto que muchos movimientos son demasiado lentos para ser observados a tiempo real, normalmente resulta útil hacer películas o vídeos por el sistema de aceleración de movimiento (microcinematografía).
32. Aplicaciones Esta técnica microscópica se usa para medir índice de refracción y concentración de sólidos de las estructuras celulares utilizando un método de refractometría por inmersión, así se sumergen las células en una solución isotónica cuyo índice de refracción puede variarse. Esta refractometría se ha empleado para ser medidos en procesos como la división celular y el desarrollo de esporas fúngicas. Igualmente es útil para determinar masa seca y espesor de las estructuras celulares.
33. Microscopía de fluorescencia Consta de una fuente de luz (lámpara de mercurio o halógena) la cual debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta , el microscopio y un sistema de filtros, tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente. FuncionamientoLa luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.
34. El Microscopio confocal: Es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas:- Un diafragma de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado Pinhole de Excitación, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen; y -Un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del fotodetector, denominado Pinhole de Emisión
35. El Microscopio electrónico: La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. La longitud de onda más corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 ángstroms (1 ángstrom es 0,0000000001 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,5 ángstroms.
36. Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elementos básicos. Disponen de un cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada. Se utilizan lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. El sistema de vacío es una parte relevante del microscopio electrónico. Los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características.
37. Por último, todos los microscopios electrónicos cuentan con un sistema que registra o muestra la imagen que producen los electrones. Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).
38. Microscopio electrónico de transmisión (MET): permite la observación de muestra en cortes ultrafinos. Un MET dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un MET debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
39. Un microscopio electrónico de barrido crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un MEB, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El MEB explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el MET, que examina una gran parte de la muestra cada vez.
40. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión.
41. Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este tipo de microscopio es muy útil porque, al contrario que los MET o los microscopios ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.
42. USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO ILUMINACIÓN KELLER Lo primero es conseguir una buena fuente de iluminación. Si la misma está incorporada al microscopio, enfocamos con el objetivo de menor aumento, cerramos el diafragma de campo y movemos el condensador hacia arriba y hacia abajo hasta que el contorno del diafragma se vea nítido. El diafragma se centra con los tornillos que lo sujetan a la subplatina. Luego se quita el ocular y se verifica que la luz esté centrada. A medida que se abre el diafragma su contorno desaparece del campo observado. Si la fuente de luz es externa, se quita el ocular, se coloca el objetivo de menor aumento, y se mueve el espejo hasta centrar la luz. Recordemos que si tenemos condensador debemos usar la cara plana del espejo. 2. Volvemos a colocar el ocular y, siempre con el objetivo de menor aumento, colocamos el preparado sobre la platina. Utilizando el tornillo de ajuste macrométrico enfocamos lo más claramente posible.
43. USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO ILUMINACIÓN KELLER 3. El condensador debe estar en la posición más alta y el diafragma abierto. Esto si el preparado está coloreado, sino el diafragma debe estar cerrado. 4. Con el tornillo micrométrico se logra el enfoque fino según nuestra visión. 5. Modificamos la apertura del diafragma hasta obtener la cantidad de luz deseada. 6. Luego de estudiado el preparado con este objetivo, podemos pasar gradualmente a objetivos de mayor aumento, corrigiendo la apertura del diafragma para cada uno de ellos.
44. USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO ILUMINACIÓN KELLER 7. En caso de utilizar el objetivo de inmersión, se coloca una pequeña gota de aceite sintético sobre el preparado y luego se enfoca con sumo cuidado, recordando que este objetivo es el de menor distancia frontal y corremos el riesgo de estropear el preparado y la lente frontal. Al finalizar el uso de este objetivo se deben retirar los restos de aceite con un papel de carilina o una gasa embebida en xilol o solvente especial para limpieza de lentes, nunca se debe dejar sucio el objetivo. 8. Cuando se termina de utilizar el microscopio se lo debe dejar de la siguiente manera:- fuente de luz apagada- condensador al tope- diafragma abierto- platina alta- objetivo de menor aumento en posición- todas las lentes limpias.
