Efficacia e sicurezza dell’applicazione di liposomi fosfolipidici nel trattam...
Il controllo delle micosi gli antifungini
1. Azienda Ospedaliero-Universitaria Università degli Studi di Catania
Policlinico di Catania Dipartimento di Scienze Microbiologiche
Laboratorio Centralizzato di Analisi e Scienze Ginecologiche
Laboratorio di Micologia
Il controllo delle micosi: gli antifungini
Prof.Salvatore Oliveri
oliveri@unict.it
Rappresentazione schematica della cellula fungina e
principali bersagli dei farmaci antifungini
Da: Odds et al., Trends Microbiol., 2003
1
2. Antifungini attivi sulla membrana cellulare
Membrana cellulare
• Polieni
- Amfotericina B
- Nistatina (uso topico)
• Allilamine, tiocarbamati,
morfoline
• Azoli
- Miconazolo, clotrimazolo
(ed altri per uso topico)
- Ketoconazolo
- Fluconazolo
- Itraconazolo
- Voriconazolo
- Posaconazolo
Polieni
• L’amfotericina B (AmB), prodotta da
Streptomyces nodosus, è stata per molti
anni il solo poliene somministrabile per
via sistemica
• La modalità di azione è atipica per una
molecola antimicrobica, in quanto si lega
all’ergosterolo presente nella membrana
fungina, determinando alterazioni della
permeabilità, fuoriuscita di componenti
citoplasmatici vitali e la morte
dell’organismo. Tale meccanismo fa sì
che AmB possa agire su un ampio spettro
di specie fungine, come pure sia tossica
per le cellule dei mammiferi
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3. Meccanismo d’azione
dell’Amfotericina B
Amfotericina B PORO Ergosterolo
Fosfolipidi
Membrana cellulare
Azoli
• Imidazoli (ketoconazolo, miconazolo e
clotrimazolo) e triazoli (fluconazolo e
itraconazolo) costituiscono il più ampio
gruppo di farmaci antifungini
• Il loro effetto principale è quello di
inibire la 14α-demetilazione del
lanosterolo nella via biosintetica
dell’ergosterolo, agendo sul citocromo
P450, CYP51A1, anche chiamato Erg11p,
cioè il prodotto del gene ERG11
• In alcune specie fungine tali farmaci
possono inibire anche la sterolo ∆22-
desaturasi, un enzima coinvolto
nell’ultima tappa della biosintesi
dell’ergosterolo
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4. Azoli (2)
• Con la deplezione dell’ergosterolo, risultano alterate
la normale permeabilità e fluidità della membrana
fungina, con conseguenze secondarie sugli enzimi di
membrana coinvolti nella sintesi della parete
• Dotati di un ampio spettro di azione, sono attivi nei
confronti di dermatofiti, funghi filamentosi, Candida
spp., Cryptococcus neoformans e funghi dimorfi come
Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis
Azole Antifungals for Systemic
Infections
• Ketoconazole Imidazole
• Itraconazole
Triazoles
• Fluconazole
• Voriconazole “2nd generation
triazole”
Fluconazole Ketoconazole
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5. Allilamine
• Le allilamine (terbinafina e naftifina) inibiscono l’enzima
squalene epossidasi, con conseguente deplezione
dell’egosterolo ed accumulo di squalene. Hanno effetto
fungicida nei confronti di dermatofiti e funghi
filamentosi, ma sono fungistatici per molti lieviti
patogeni. A causa della sua notevole efficacia nei
confronti dei dermatofiti, la terbinafina è il solo
farmaco di scelta per il trattamento di micosi
superficiali e infezioni ungueali sostenute da tali muffe
Allylamines - Mechanism
5
6. Cell Wall Active Antifungals
Cell membrane
• Polyene antibiotics
• Azole antifungals
DNA/RNA synthesis
• Pyrimidine analogues
- Flucytosine
Cell wall
• Echinocandins
-Caspofungin acetate
5-fluorocitosina (5-FC)
• In origine sviluppato come agente antineoplastico,
agisce come antifungino attraverso la sua
conversione a 5-fluorouracile (5-FU) nelle cellule
target. Il 5-FU viene incorporato nell’RNA,
determinando la terminazione prematura di catena,
ed inibisce la sintesi del DNA attraverso i suoi
effetti sulla timidilato sintetasi
• Ha attività fungicida, tuttavia lo spettro di attività è limitato ai lieviti
patogeni (Candida spp. e Cryptococcus neoformans)
• 5-FC non viene utilizzata nella pratica clinica singolarmente, ma in
associazione (ad es. con AmB) a causa del rapido sviluppo di resistenza
primaria e secondaria (risultante da difetti negli enzimi permeasi,
deaminasi e fosforibosil trasferasi)
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7. Flucytosine
Fluorinated pyrimidine
related to flurouracil.
Nuovi farmaci antifungini
Echinocandine (1)
• Le echinocandine sono metaboliti
fungini secondari, costituiti da un core
ciclico esapeptidico con una catena
lipidica laterale responsabile
dell’attività antifungina.
• Scoperti negli anni ’70 solo alla fine
degli anni ’90 tre composti della classe
echinocandine, anidulafungina,
caspofungina e micafungina sono
entrati nello sviluppo clinico
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8. Nuovi farmaci antifungini in sviluppo clinico
Echinocandine (2)
• Il bersaglio delle
echinocandine è il
complesso delle proteine
responsabili della sintesi
dei β-1,3 glucani della
parete, sebbene il preciso
meccanismo d’azione
rimanga sconosciuto
Resistenza ai farmaci antifungini
• La resistenza ai farmaci antifungini ha componenti
cliniche e microbiologiche
• Per resistenza clinica si intende il fallimento del
trattamento e la persistenza dell’infezione nonostante
la terapia antifungina appropriata. Una risposta clinica
adeguata è a sua volta dipendente non solo dalla
sensibilità del microrganismo patogeno ma anche da
vari fattori, quali il sistema immune, la penetrazione e
distribuzione del farmaco, la “compliance” del paziente
e l’assenza di un focolaio di infezione protetto o
persistente (es. catetere o ascesso)
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9. Resistenza ai farmaci antifungini
• La resistenza microbiologica di un dato patogeno fungino
deve essere ritenuta come una variabile quantificabile,
determinata mediante la misurazione della sensibilità al
farmaco (es. MIC), e deve essere definita rispetto ad una
popolazione di riferimento.
• Un fungo patogeno resistente ad un dato farmaco è perciò
un microrganismo che ha una “minimal inhibitory
concentration” (MIC) più alta del valore medio calcolato
nella popolazione totale
• Pertanto la resistenza microbiologica o in vitro di un dato
patogeno è basata sulla determinazione delle MIC
In vitro amphotericin B resistance in clinical isolates of
Aspergillus terreus, with head-to-head comparison to
voriconazole
80
70
60
n° of isolates
50
40
AMB
30 VOR
20
10
0
0.06 0.25 1 4 16
MIC (mcg/ml)
Sutton et al., JCM, 1999, 37: 2343-2345
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10. Resistenza ai farmaci antifungini
La resistenza microbiologica può essere distinta in:
i) resistenza primaria, anche definita come resistenza
intrinseca, che si osserva prima dell’esposizione in
vitro o in vivo al farmaco
ii) resistenza secondaria (o resistenza acquisita) che
compare dopo l’esposizione ad un agente antifungino
e può essere reversibile o acquisita stabilmente
Meccanismi di resistenza ai polieni
• La resistenza microbiologica ad AmB può essere intrinseca o
acquisita
• La resistenza intrinseca è comune ad alcune specie di Candida (C.
lusitaniae) e a Trichosporon beigelii
• La resistenza acquisita è spesso associata con alterazioni nel
contenuto dei lipidi di membrana e specialmente dell’ergosterolo
• Sono stati descritti ceppi clinici di C. albicans resistenti a AmB
che mancavano di ergosterolo e accumulavano altri steroli a
causa di un difetto dell’enzima sterolo ∆5,6-desaturasi
• Un altro meccanismo alla base della resistenza sarebbe mediato
da un’incrementata attività della catalasi, che potrebbe
contribuire a diminuire il danno ossidativo prodotto da AmB
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11. Mechanisms of resistance to
polyenes
Low ergosterol content in the cell membrane of
Aspergillus spp. decreases the activity of AMB
Walsh et al., JID,
2003, 188:305-319
Meccanismi di resistenza alla 5-FC
• Anche nei confronti di tale farmaco la resistenza può
essere intrinseca o acquisita
• La resistenza intrinseca può presentarsi per un difetto
della citosina permeasi, mentre quella acquisita deriva
dall’incapacità di metabolizzare 5-FC a 5-FUTP e 5-dUMP
oppure può essere dovuta alla perdita di un feedback di
controllo della biosintesi della pirimidina
• A causa dell’elevata resistenza intrinseca a 5-FC, tale
composto è di gran lunga utilizzato in associazione con
altri agenti antifungini, per esempio, con AmB
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12. Meccanismi di resistenza agli azoli
I meccanismi di resistenza agli azoli possono essere così
suddivisi:
1. alterazioni nel trasporto del farmaco o ridotto
accumulo di azoli nella cellula dovuto alla up-
regolazione di geni “multidrug trasporter” (MDR1,
CDR1 e CDR2).
2. alterazioni del target cellulare:
i. diminuzione dell’affinità di Erg11p (per insorgenza
di mutazioni)
ii. aumento del contenuto cellulare di Erg11p (per up-
regolazione genica
3. alterazioni della via biosintetica dell’ergosterolo,
mediante inattivazione della sterolo ∆5,6-desaturasi
Types of multidrug efflux transporters in yeast
Plasma
membrane
NH2 A B A B NH2 COOH
COOH
ATP ADP ATP ADP
ATP-binding cassette (ABC)-transporters Major Facilitators
C. albicans CDR1, CDR2 (Candida drug resistance), 170 kDa C. albicans CaMDR1 (Multidrug
- 2 x 6 transmembrane domains (TM) resistance), 63 kDa
- 2 nucleotide binding folds in Walker A and B domains - 2x6 transmembrane domains (TM)
- Efflux a large variety of drugs - Effluxes a large variety of drugs
Sanglard et al. (1995), AAC 39: 2378-2386; (1997), Microbiology 143: 405-416
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13. Azole resistance mechanisms: enhanced efflux
by upregulation of multidrug transporter genes
Major Facilitator
multidrug
transporter
CaMDR1
Lanosterol
Azole ERG11
resistant
yeast 14α-demethylated
sterols
Ergosterol
ATP Binding
Cassette
(ABC) multidrug
Transporter
Echinocandins - spectrum
Highly active Very active Some activity
Candida albicans, Candida parapsilosis Coccidioides immitis
Candida glabrata, Candida gulliermondii B. dermatididis
Aspergillus fumigatus Scedosporium species
Candida tropicalis, Aspergillus flavus Paecilomyces variotii
Candida krusei Aspergillus terreus H. capsulatum
Candida kefyr Candida lusitaniae
Pneumocystis carinii
Low MIC ,with Low MIC, but without Detectable activity,
fungicidal activity and fungicidal activity in which might have
good in-vivo activity. most instances. therapeutic potential for
man (in some cases in
combination with other
drugs).
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14. Echinocandins-Spectrum vs. Moulds
• Active against Aspergillus
species
– Glucan synthase localized in
apical tips Staining with
antisera to glucan
• Activity against other yeast synthase subunit
and moulds is less well (Fks1p)
described or variable
Aniline blue staining
of β (1-3) glucans –
stains only at apex
Beauvais et al. J. Bacteriol 2001;183:2273-79
Echinocandins act at the apical tips of
Aspergillus hyphae
DiBAC
Bowman et al. Antimicrob Agent Chemother 2002;46:3001-12
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15. A Imhof, JCM 2003, 41: 5683-5688
Saggi in terreno liquido
YeastOne-Sensititre
• Possibilità di determinare la CMI e la CMF
• Semplicità di interpretazione e di lettura
• Possibilità di saggiare funghi filamentosi
farmaci da saggiare e loro
concentrazioni
terreno di crescita
pH
temperatura e tempo di incubazione
inoculo fungino
controlli
lettura
interpretazione dei risultati
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16. NCCLS conditions for antifungal susceptibility testing
Characteristic NCCLS M27-A (135) NCCLS M38-P (133)
Suitability Yeasts Conidium- and spore-forming fungi
Inoculum 0.5 × 103-2.5 × 103 CFU/ml 0.4 × 104-5 × 104 CFU/ml
Inoculum Spectrophotometric, with reference Spectrophotometric, with specificatiion
standardization to a 0.5 McFarland BaSO4 turbidity of a target optical density that varies
standard by fungal genus
Test medium RPMI 1640, buffered to pH 7.0 with Same as M27-A
0.165 M MOPS
Format Macrodilution or microdilution Microdilution
Temp 35°C 35°C
Duration of 48 h (Candida spp.), 72 h 48 h (most fungi)
incubation (C. neoformans)
End point Optically clear well for amphotericin Prominent growth reduction from
B, ~80% reduction in growth control (~50%) for flucytosine,
(macrodilution testing with azoles), fluconazole, and azoles; optically clear
prominent decrease in turbidity well for amphotericin B; the T-level
(microdilution testing with revision will propose the use of an
flucytosine and the azole optically clear end point for
antifungals) intraconazole and the newer azoles
(e.g., voriconazole)
Da Rex, J. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14: 643-658
Interpretative Breakpoints for Isolates of Candida
Species
Drug Concentration (µg/ml)
Susceptible Susceptible Resistant
Dose-Dependent
Flucytosine ≤4 (8-16) ≥ 32
Fluconazole ≤8 16-32 ≥ 64
Itraconazole ≤ 0,125 0,25-0,5 ≥1
Voriconazole* ≤1 2
≥4
NCCLS: M27-A2 2002
*CLSI: M27-S2 2006
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17. Saggi in agar
Diffusione da disco
• Impossibilità di determinare la CMI e la CMF
• Utilizzo di terreni interferenti con l’attività dei
farmaci
• Assenza di crescita per alcune specie fungine
• Eventuale difficoltà di interpretazione e di lettura
• Semplicità e rapidità di esecuzione
• Relativa economicità
E-test
• Possibilità di determinare la CMI
• Impossibilità di determinare la CMF
• Utilizzo di terreni interferenti con l’attività dei
farmaci
• Assenza di crescita per alcune specie fungine
• Eventuale difficoltà di interpretazione e di
lettura
• Semplicità e rapidità di esecuzione
• Possibilità di saggiare funghi filamentosi
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