1. Universidade Federal de Viçosa – Departamento de Tecnologia de
Alimentos – Laboratório Processos Bioquímicos e Fermentativos
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PROTOCOLO 1: ISOLAMENTO DE LEVEDURAS Pag. 1 de 3
Data de Aprovação:
Elaborado por: Mayara Salgado silva Aprovado por:
1. Utensílios
- Placas de petri estéries;
- Tubos de ensaio;
- Frascos estéries;
- Alça de drogausk;
- Alça de platina;
- Estufa;
- Autoclave;
- Capela ou bico de Bunsen;
- Balança analítica;
- Espátulas;
- Bastão de vidro
2. Reagentes
- Peptona
- Ágar Batata Dextrose – PCA
- Ácido tartárico
2.1. Preparo dos reagentes
- Água Peptonada: Pesar 0,1 g de pelptona para cada 100 mL de água destilada
(0,1%). Faça a diluição, coloque no frasco ou tubo de ensaio e leve à autoclave a 1
atm de pressão a 121ºC por 15 minutos.
- Ágar PCA acidificado: Dissolver 39 gramas em 1000 mL de água destilada e levar
ao aquecimento até que o meio dissolva-se completamente. Esterilizar em autoclave
a 1 atm de pressão a 121ºC por 15 minutos. Para acidificação à pH 3,5 pode-se usar
ácido tartárico 10% estéril. Preparar a solução de ácido tartárico e aquece-la a
mesma temperatura do ágar liquefeito, adicionar aproximadamente 1 mL para cada
100 mL de meio e fazer a homogeneização ( o meio não pode ser aquecido após a
mistura com o ácido). Em caso de dúvidas siga as instruções do fabricante.
3. Procedimento
- Em capela esterilizada verta o meio de cultura liquefeito em placa de petri ate que a
base esteja completamente preenchida (cerca de 15 a 20 ml por cada placa ).
Aguarde a solidificação com as placas entreabertas;
- Pese a amostra diretamente no frasco com água peptonada (0,1%) seguindo as
diluições 10-1, 10-2 e 10-3. Caso haja dificuldade em identificar a colônia, mais
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diluições deverão ser realizadas. Macere a amostra com a ajuda de um bastão de
vidro estéril;
- Adicionar 0,1 mL da diluição da amostra com pipeta estéril no centro da placa e
espalha-se com o auxílio de uma alça de Drigalski estéril. Fazer este procedimento
em duplicata;
- Incubar as placas invertidas em estufa à 28 ºC por 72 horas;
- Passado este tempo, selecionar a diluição mais viável e fazer a contagem das
colônias;
- Fazer a identificação das colônias de leveduras observadas (Protocolo 2) e proceder
a uma nova semeadura por estrias em placa de petri com o mesmo meio de cultura,
inoculando um tipo de colônia por placa;
- Na semeadura por estrias deve-se flambar a alça de platina (ou então pode-se
utilizar alças de plástico descartáveis previamente esterilizadas) e introduzi-la no
meio contendo as bactérias. Fazer então o estriamento na superfície do ágar da
placa de Petri Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca
de 30˚ e puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes. A
quantidade de material a ser inoculada deve ser mínima, sendo que em muitos
casos, é necessário diluir o meio do qual os microrganismos são provenientes; caso
contrário, pode haver a justaposição das colônias e por isso não se pode isolá-las.
- Repetir o procedimento até observação de colônias puras.
- Fazer nova identificação pelo protocolo 2 e recolher as colônias com mesma
características em Tubo de ensaio ou ependoff e conservar a 8 ˚C.
4. Referências
- Moreira FMS, Huising EJ, Bignell DE (2010). Manual de biologia dos solos
tropicais. 1ª ed. Universidade Federal de Lavras, Lavras. Minas Gerais.
