EL siguiente documento contiene un análisis inmunológico de la concentración total de proteínas en consumidores de café y no consumidores del mismo.

1. Universidad de Puerto Rico
Recinto de Arecibo
Departamento de Biología
Comparación de la concentración y perfil de proteínas totales en
saliva de consumidores frecuentes de café y no consumidores.
Mayo 2011
Butler Maralís; Hernández Moises; López Yenilyz; Lugo Kiara; Muñiz Adriana; Morales William;
Morey Gustavo; Reyes Melanie; Rivera Kathia; Valentín Natalia; Vega Jesús
RESUMEN ABSTRACT
La saliva consiste en una secreción compuesta de Saliva is a secretion composed of minerals and proteins
minerales y proteínas que le atribuye propiedades that gives important properties.The objective of this
importantes. Este estudio tuvo como objetivo determinar study was the determination of the total protein
la concentración de proteínas totales existentes en concentration in samples of human saliva, in participants
muestras de saliva humana, en participantes de 18-19 of 18-19 years old of both genres. The students were
años. Se seleccionaron estudiantes voluntarios del selected voluntarily from the Laboratory of Immunology
laboratorio de Inmunología de la Universidad de Puerto of UPRA, to determine if coffee consumption affect
Rico en Arecibo para poder determinar si el consumo de somehow the oral proteins. The students were asked to
café afectaba de algún modo las proteínas bucales. Los abstained from eating, drinking and to carry out oral
estudiantes se limitaron de comer, beber y de realizar su hygiene two hours before the recollection of saliva.
higiene bucal dos horas antes de la colección de saliva. Samples were taken per student between 3:00 pm, all of
Se tomó una muestra por estudiante alrededor de las the under the same conditions. Later spectrophotometry
3:00 pm, todas bajo las mismas condiciones. was used in Bradford technique to determine the total of
Posteriormente se utilizó espectrofotometría mediante la proteins and also Electrophoresis en SDS PAGE to
técnica de Bradford para la determinación de proteínas compare, count and distinguish proteins. Within the
totales y Electroforesis en SDS PAGE para poder results there was found that there were differences
comparar, cuantificar y caracterizar proteínas. Dentro de between the control group and the experimental group,
los resultados se encontró que existieron diferencias like for example differences statistically probable
significativas entre la concentración de proteínas de between the concentrations of proteins in both groups
ambos grupos y diferencias en el contenido de bandas and differences in the content of visible bands in each
según la muestra. sample.
Palabras clave: proteínas totales, saliva humana, Keywords: total protein, human saliva, SDS PAGE
electroforesis en SDS PAGE, técnica de Bradford. electrophoresis, Bradford technique.
INTRODUCCIÓN
La saliva es un liquido viscoso que tiende a sintetiza mayoritariamente la amilasa, esta
extenderse por todas las regiones de la boca, glándula produce menos calcio que la glándula
excepto en la encía y en la porción anterior del submandibular, por otro lado, las mucinas
paladar, que proviene de las glándulas salivales. provienen principalmente de las glándulas
Es estéril cuando sale de dichas glándulas, pero submandibular y sublingual, las proteínas ricas en
deja de serlo inmediatamente cuando entra en prolina e histatina provienen de la parótida y de la
contacto con restos de alimentos, submandibular, al igual que las mucinas. Las
microorganismos, etc. Las glándulas salivales glándulas salivales menores son esencialmente
están formadas por células acinares y ductales. mucosas, la secreción diaria de ésta fluctúa entre
Las células acinares de la parótida producen una 500 y 700 ml, su producción está controlada por el
secreción esencialmente serosa y en ella se sistema nervioso autónomo. El volumen salival
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2. Comparación de la concentración y perfil de proteínas totales en saliva de consumidores frecuentes de café y no consumidores.
mayor se produce antes, durante y después de las Las proteínas en general, son aquellos materiales
comidas, éste alcanza su pico máximo alrededor que desempeñan un mayor número de funciones
de las 12 del mediodía y disminuye de forma muy en las células de todos los seres vivos. Por un
considerable por la noche, durante el sueño. lado, forman parte de la estructura básica de los
tejidos como los músculos, tendones, piel, uñas,
El 99% de la saliva es agua, mientras que el 1% etc. y por otro, desempeñan funciones metabólicas
restante está constituido por moléculas orgánicas e y reguladoras así como, la asimilación de
inorgánicas. La saliva es un buen indicador de los nutrientes, el transporte de oxígeno y de grasas en
niveles plasmáticos de diversas sustancias tales la sangre, la inactivación de materiales tóxicos o
como hormonas y drogas, por lo que puede peligrosos, etc. En adición, las proteínas son los
utilizarse como método no invasivo para moni- elementos que definen la identidad de cada ser
torizar las concentraciones plasmáticas de vivo, ya que son la base de la estructura del código
medicamentos u otras sustancias. Por otro lado, si genético (ADN) y de los sistemas de
la cantidad de saliva es importante, también lo es reconocimiento de organismos extraños en el
la calidad de la misma, ya que cada uno de sus sistema inmunitario.
componentes lleva a cabo una serie de funciones
específicas, tales como se muestran a continuación Las dos proteínas, las cuales fueron nombradas
en la Tabla 1. anteriormente, más importantes de la saliva son la
amilasa y la mucina, ya que la amilasa es
producida predominantemente por las glándulas
Componentes Funciones parótidas y la mucina por las glándulas
Lisocima, lactoferrina, Antimicrobianas sublinguales y submandibulares. La mucina es la
mucinas, cistinas, responsable de la viscosidad de la saliva, de la
histatinas, Ig A preparación de los alimentos para la deglución, la
Limpieza Agua lubricación, entre otros, como se muestran en la
Amilasa, lipasa, Digestión tabla 1. Otras proteínas presentes son la
ribonucleasas, muramidasa o lisozima que ataca el ácido
proteasas, agua, murámico de algunas bacterias, la lipasa lingual
mucinas que es una enzima importante para la digestión de
Agua, gustina Sabor la leche, la lactoferrina una proteína que liga al
Mucinas, electrolitos, Mantenimiento de la hierro, el factor de crecimiento epidérmico que
agua mucosa estimula el crecimiento de las células de la mucosa
Tabla 1. Componentes de la saliva y sus funciones. gástrica, inmunoglobulinas (IgA) y sustancias del
sistema sanguíneo.
La composición de la saliva es parecida a la del El objetivo de este trabajo fue determinar la
plasma, aunque contiene menos sodio y más concentración de proteínas totales existentes en
potasio, menos cloro y más HCO3-. Tanto la una muestra de saliva de consumidores frecuentes
osmolaridad como la composición electrolítica de café y no consumidores.
dependen de la velocidad de secreción,
aproximándose a la del plasma cuando la METODOLOGÍA
velocidad de secreción es alta.
Para este estudio se escogieron 4 estudiantes
Todo el compuesto mineral y proteico son los que voluntarios del Laboratorio de Inmunología del
le dan a la saliva una cantidad muy importante de UPRA. De los 4 estudiantes, 2 formaron parte del
propiedades, que ayudan al cuerpo con la grupo control (no consumen café) y 2 formaron
deglución y digestión de los alimentos, que parte del grupo experimental (consumen café), de
convierten a la boca en una barrera antibacteriana edades comprendidas entre 18-19 años y de
y que neutralizan en gran parte, al medio ácido que ambos géneros.
se produce luego de algunas comidas.
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3. Butler Maralís; Hernández Moises; López Yenilyz; Lugo Kiara; Muñiz Adriana; Morales William; Morey Gustavo; Reyes Melanie;
Valentín Natalia; Vega Jesús
Los estudiantes se abstuvieron de comer, beber y curva estándar como se muestra continuación.
de realizar su higiene bucal dos horas antes de la
colección de saliva. Se tomó una muestra por
estudiante alrededor de las 3:00 pm. La saliva de Absorbancia V.S Concentracion de Proteinas( Curva Estándar)
cada uno se recolectó en tubos desechables y 0.45
estériles de 1.5mL (no se refrigeró). Para la 0.4
obtención de concentración de proteínas totales se 0.35
llevó a cabo la técnica de Bradford, utilizando azul
Absorbancia (nm)
0.3
de Comassie G-250 y un espectrofotómetro.
0.25
Obtención de la curva estándar 0.2
0.15
Para la obtención de la curva estándar se utilizaron 0.1
5 tubos de la siguiente manera:
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración Concentración de proteínas (mg/mL)
Tubo Contenido A₅₉₅nm de proteínas Gráfica 1. Curva estándar para la determinación de
(mg/mL, proteína utilizando BSA.
µg/µL)
100µL PBS
Blanco 1mL Bradford Obtención de la concentración de proteínas
salivales
95µL PBS 0.1551
1 5µL BSA 2.5 Para establecer las proteínas salivales de los 4
1mL Bradford estudiantes se utilizó el método de Bradford a base
90µL PBS 0.2479 del acoplamiento del colorante azul de Comassie
2 10µL BSA 5.0 G-250. Para realizarlo, se centrifugó 200µL de
1mL Bradford cada muestra de saliva en una microcentrífuga a
85µL PBS 0.3323 12,000rpm x 30 minutos. Después se tomaron 5µL
3 15µL BSA 7.5 de sobrenadante de cada uno y se colocaron en
1mL Bradford tubos con 95µL de PBS y 1mL de Bradford. Se
80µL PBS 0.4169 llevaron al vortex y se dejaron reposar por 10
4 20µL BSA 10.0 minutos. Luego, se transfirió 1mL de cada solución
1mL Bradford a una cubeta de plástico para llevarlo al
95µL PBS espectrofotómetro (595nm).
Muestra 5µL
sobrenadante El espectrofotómetro identificaba la inserción del
1mL Bradford blanco e identificaba la secuencia en que las
Tabla 2. Datos para la obtención de la curva estándar. muestras tenían que ingresar para analizarse. Por
último, al obtener la absorvancia y extrapolar, se
obtuvo la concentración de proteínas salivales del
Luego, los tubos (1-4) se llevaron al vortex para grupo control y del grupo experimental (consumo
que se homogeneizaran los reactivos y de café).
permanecieron a temperatura ambiente por 10
minutos antes de leer la absorbancia. Electroforesis en SDS PAGE
Posteriormente se tomó 1mL de cada estándar en
una cubeta de plástico (especial para el Luego de obtener la concentración de proteínas
espectrofotómetro) para determinar a 595nm una salivales se procedió a realizar la corrida de
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4. Comparación de la concentración y perfil de proteínas totales en saliva de consumidores frecuentes de café y no consumidores.
electroforesis en SDS PAGE. Esta fue necesaria 5X Bromophenol Blue Sample Buffer 600mM Tris/
para poder cuantificar, caracterizar y comparar las HCl 1M pH 6.8; Glicerol; 2% SDS; 14.4 mM 2
proteínas en las muestras de saliva (Ver a mercaptoetanol; 0.1 azul de bromofenol, 1 % SDS
continuación detalles sobre la técnica). Para (Sodio Docecil Sulfato), Micropipetas y Tips,
realizar este procedimiento se escogieron 5 tubos Microtubos, Microcentrífuga, Sistema de
de 1.5 cm los cuales se prepararon de la siguiente electroforesis vertical, Power supply, Envase para
manera: teñir, Solución de tinción, Soluciones desteñidoras.
Preparación del gel de corrida:
Muestra Contenido
1 ( Grupo experimental) 14 µL muestra de saliva Ensamblar, según instrucciones de la casa
0 µL dH20 comercial, el soporte para ensamblaje que consta
(Para un total de 16 µL) de soportes, vidrios y separadores. Preparar el gel
2 µL 5x Sample Buffer de corrida. El volumen del gel de corrida deberá
2 ( Grupo experimental) 9 µL muestra calcularse del grosor del gel. En la tabla4, se
5 µL dH20 muestran las cantidades de reactivos para un gel
(Para un total de 16 µL) de acrilamida al 12%.
2 µL 5x Sample Buffer
3 ( Grupo control) 9 µL muestra de saliva
5 µL dH20 Gel de Gel de
(Para un total de 16 µL) Corrida apilamiento
2 µL 5x Sample Buffer ddH2O 3.2 mL 6.1 mL
4 ( Grupo control) 8 µL muestra de saliva Buffer 2.5 mL ( pH 1.5 mL (pH 6.8)
6 µL dH20 8.8)
(Para un total de 16 µL) SDS 10% 100 µL 100 µL
2 µL 5x Sample Buffer Acrilamida 4.2 mL 1.3 mL
TEMED 5 µL 10 µL
Marcador 5uL protein marker
5 µL dH20 APS 10 % 50 µL 50 µL
Tabla 4. Cantidades de reactivos para chorrear un gel
2 µL Sample Buffer 5x
de poliacrilamida al 12%.
Tabla 3. Preparación de muestras y marcador para la
corrida de electroforesis en SDS PAGE.
Verter cuidadosamente la solución de acrilamida
con una pipeta en el contenedor representado por
Después de preparar las muestras y el marcador dos vidrios sujetos al soporte para ensamblaje y
se procedió a hervirlas de 3- 5 min para poder distanciados por separadores. Dejar
llevar a cabo el procedimiento de electroforesis en aproximadamente 1.5 cm de distancia entre la
SDS PAGE. solución de acrilamida y el vidrio frontal. Luego de
añadido el gel de corrida, y previo a la
Procedimiento de electroforesis en SDS PAGE polimerización, añadir suavemente 200 µL de SDS
Materiales y reactivos: al 1 % para evitar que el borde del gel polimerice
de manera irregular. Esperar unos 45 minutos para
Protogel (30% Acrilamida, mezcla de acrilamida/bis una polimerización total del gel.
acrilamida), 4x Lower Separating Buffer (Solución
amortiguadora para gel de corrida), 4x Upper Preparación del gel de apilamiento:
Stacking Buffer (Solución amortiguadora de para
gel apilamiento), ddH2O, TEMED (N,N,N Luego de polimerizado el gel de corrida, descartar
tetrametilenetilendamina), 10 % APS (Persulfato de el agua de la superficie del mismo y preparar 4 mL
Amonio), Running Buffer, Protein Standard marker, del gel de apilamiento (4%) según cantidades de la
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5. Butler Maralís; Hernández Moises; López Yenilyz; Lugo Kiara; Muñiz Adriana; Morales William; Morey Gustavo; Reyes Melanie;
Valentín Natalia; Vega Jesús
tabla 4. Luego procede a verter suavemente el M Media aritmética Media
contenido del gel de apilamiento sobre el gel de de la aritmética de
corrida polimerizado y colocar el peine Concentración la
cuidadosamente para que no se formen burbujas. de Proteínas absorbancia
Esperar unos 30 minutos. Hasta que se polimerice (µg/µL) de las
el gel. Al haber polimerizado el gel de apilamiento muestras
se sembró 16 uL de cada muestra y el “marker” (nm)
en los pocillos correspondientes utilizando un tip de Grupo Control 3.6 0.15
pipeta de punta larga descartable.
Finalmente se someten las muestras a Grupo 2.6 0.19
electroforesis aplicando corriente (150V) por Experimental
aproximadamente una hora y se sumerge la gel en Tabla 6. Media aritmética de la concentración y la
solución colorante por 10 minutos (seguido de absorbancia de las distintas muestras de proteínas.
sumergirla en una solución decolorante), para así
poder observar las bandas proteicas.
RESULTADOS
M Concentración µL para Absorbancia
de Proteínas muestra de las
( µg/µL) de 30 Muestras
µg
Muestra 1 2.00 30/2.0 0.1116 nm
(Grupo = 15.0
experimental) µL
Muestra 2 3.20 30/3.20 0.1835 nm
(Grupo = 9.38
experimental) =
9.0 µL
Muestra 3 3.50 30/ 0.1900 nm Figura 1. Corrida de electroforesis en SDS PAGE de
(Grupo 3.50 = las distintas muestras de proteínas.
control) 8.57 =
9.0 µL
Muestra 4 3.70 30/ 0.1985 nm
(Grupo 3.70 =
control) 8.11 =
8.0 µL
Tabla 5. Concentración de proteínas y absorbancia del
grupo control y grupo experimental.
Figura 2. Corrida de electroforesis en SDS PAGE de
las distintas muestras de proteínas (Réplica).
5

6. Comparación de la concentración y perfil de proteínas totales en saliva de consumidores frecuentes de café y no consumidores.
DISCUSIÓN aproximadamente 50 kDA, lo cual se asimila al
peso de la banda. Las otras bandas que se
Según los resultados obtenidos en este encuentran al tope (aprox. 225 kDA) podrían ser la
experimento podemos establecer ciertos puntos. El proteína mucina, lo cual es una de las más
grupo control está constituido por las muestras 3 y abundantes en la saliva. Como visto en la
4. La concentración de proteínas fue de un total de literatura, ésta contiene un peso de
3.50 y 3.70 (µg/µL) respectivamente teniendo como aproximadamente 200-300 kDA.
media aritmética un valor de 3.6 µg/µL. Por otro
lado las concentraciones del grupo experimental, el El contenido de bandas visibles en cada una de
cual está constituido por las muestras 1 y 2, las muestras es de aproximadamente 6, 4, 3 y 4
tuvieron un total de 2.0 y 3.20 (µg/µL) respectivamente. Esto sólo indica que en el grupo
respectivamente, teniendo como media aritmética experimental existe un mayor número de proteínas
un resultado de 2.6 µg/µL. Entre las muestras que separadas por su peso molecular (kDA), pero no es
componen un mismo grupo hay diferencias de índice de que la concentración de cada una de las
cantidades, pero al ser mínimas se puede bandas en particular sea mayor. Por tanto, al llegar
establecer un rango comparativo. Por tanto si se a este razonamiento se puede observar que la
comparan las muestras 3 y 4 del grupo control banda con mayor concentración de proteínas (más
junto con las muestras 1 y 2 del grupo gruesa) se encuentra en la muestra 3 (aprox. 50
experimental, se puede deducir que si hay una kDA), seguida por una banda en la muestra 4
variación entre las cantidades proteicas de las (aprox. 50 kDA). Estos resultados favorecen y van
mismas. a la par con los estándares establecidos
anteriormente; ya que estas muestras son del
Con respecto a las absorbancias obtenidas a 595 grupo control, el cual tiene el promedio más alto de
nm se puede establecer que los datos obtenidos absorbancia y concentración de proteínas.
del grupo experimental (1 y 2) poseen unos
resultados menores que las del grupo control (3 y Por otro lado las otras muestras (1 y 2) en la
4). También al comparar la media aritmética de la corrida de electroforesis en SDS PAGE contienen
absorbancia del grupo experimental con la del bandas con menor concentración de proteínas
grupo control se pudo ver que en el grupo (más delgadas). Se puede decir que esto se debe
experimental se obtuvo un resultado menor. Esto a que éstas pertenecen al grupo experimental,
resultados y contrastes de números son en grupo en el cual la concentración de proteínas y
definitiva un índice de que las concentraciones de absorbancia es menor. Adicional, se puede ver que
proteínas en el grupo a prueba son menores que en la muestra 1 existe una banda casi llegando al
las concentraciones de proteínas del grupo control. polo positivo lo cual indica que en esta corrida hay
proteínas de bajo peso molecular en comparación
La corrida de electroforesis en SDS PAGE también a las otras de esa misma muestra. Lo mismo
fue otro método que nos ayudó a observar y a ocurre con ciertas proteínas en las muestras 2, 3 y
determinar la concentración de proteínas. En la gel 4. Cabe mencionar que todos estos resultados no
que se obtuvo experimentalmente se pudo determinan en general si la presencia de cafeína
observar cinco (5) líneas horizontales constituidas afecta o no a las proteínas de la cavidad bucal, ya
por bandas pequeñas de color purpura intenso. La que las muestras obtenidas no abarcan una
primera línea es lo que se conoce como “marker”. cantidad o un promedio general debido a que es un
Las otras líneas corresponden a las muestras 1 y 2 experimento piloto.
(grupo experimental) y las otras dos componen las
muestras 3 y 4 (grupo control). Según la literatura CONCLUSIÓN
comparada podríamos estimar que la banda
gruesa en la muestra 3 corresponde a una de la Luego de analizar todos los datos y resultados
proteínas más abundantes en la saliva, conocida obtenidos en el experimento, se puede concluir,
como amilasa. Esta tiene un peso molecular de que:
6

7. Butler Maralís; Hernández Moises; López Yenilyz; Lugo Kiara; Muñiz Adriana; Morales William; Morey Gustavo; Reyes Melanie;
Valentín Natalia; Vega Jesús
4. Las proteínas de la saliva cambian a
 Dentro de todos los resultados obtenidos se
medida que crecemos. (s.f). Recuperado el
encontró diferencias significativas como por
6 de abril de 2011, de
ejemplo, concentración de proteínas,
http://www.es.globaltalentnews.com/actuali
absorbancia de cada muestra y
dad/noticias/1371/Las-proteinas-de-la-
concentración de bandas proteínas, entre
saliva-cambian-a-medida-que-
las muestras de saliva de consumidores de
crecemos.html.
café y no consumidores.
5. Zarata D, Arith, N, Levy H, Elba R, Franco
 El consumo de café tiende alterar la
M, Fernando (septiembre 2004).
concentración de proteínas totales en la
Determinación de pH y proteínas totales en
saliva, disminuyendo su concentración.
saliva en pacientes con y sin aparatología
 Los resultados obtenidos no se pueden ortodóncica fija (estudio piloto).Vol. 8, núm.
generalizar, ya que el estudio se realizó con 3, p 59-63.
una cantidad mínima de personas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la técnica del laboratorio
de Microbiología de la Universidad de Puerto Rico
en Arecibo por facilitarnos los materiales y proveer
sus consejos, en adición, a la Profesora Marilisa
Amador por guiarnos en el procedimiento de dicha
investigación.
REFERENCIAS
1. Llena Puy, Carmen (2006, 20 de mayo). La
saliva en el mantenimiento de la salud oral
y como ayuda en el diagnóstico de algunas
patologías. Recuperado el 1 de abril de
2011, de
http://www.medicinaoral.com/medoralfree0
1/v11i5/medoralv11i5p449e.pdf.
2. Proteínas. (s.f). Recuperado el 1 de abril de
2011, de
http://www.aula21.net/Nutriweb/proteinas.ht
m.
3. Gastroenterología. (s.f). Recuperado el 1
de abril de 2011, de
http://www.iqb.es/digestivo/fisiologia/s001.h
tm.
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