O documento discute teoria e aplicações da PCR quantitativa (qPCR). Resume os principais tópicos da qPCR, incluindo ensaios químicos disponíveis, conceitos importantes como curvas padrão e de dissociação, e fatores que afetam a eficiência. Também aborda cálculos como quantificação absoluta e relativa usando métodos como Livak.

1. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
Biologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)
ICB/UFMG
PCR quantitativa
Teoria e Aplicações
Lucas Secchim Ribeiro
Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro

2. • PCR
 Histórico
 Teoria
 Aplicações
• Desenho de primers
• qPCR
 Metodologias
Cálculos
 Aplicações
 PCR Digital

3. Dogma central da Biologia Molecular
• Francis Crick / 1956

6. PCRPCR

7. PCR - Polymerase Chain Reaction

8. Funções da PCR
• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma
grande quantidade de background;
• Amplificação de cópias de uma sequência
específica a partir de pequenas quantidades do
DNA modelo.

9. Aplicações da PCR “convencional”
• Diagnóstico
• Avaliação de mutações
• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)
• Tipagem para transplantes - MHC
• Testes forenses
• Paternidade
• Investigações criminais
• Sequenciamento e clonagem
• Epidemiologia molecular e bioinformática
• Análise de OGM
• ...

10. PCR “convencional”
Reagentes básicos
Iniciadores
senso/antissenso
(primers forward/reverse)
Cátions
(Na+
/K+
e Mg2+
)
DNA polimerase
com DNA modelo
Deoxinucleotídeos
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

11. Importância do tampão e íon potássio na PCR
• pH 8,3  pH 7,2 a 72º C
• Tris/ Tris-Cl
•Função enzimática da DNA polimerase
• K+
• Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer
pela neutralização de cargas negativas
↑ [K+
] para fragmentos pequenos
↓ [K+
] para fragmentos grandes

12. Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR
• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
• Associados ao DNA na forma de dNMPs
• Sequestradores de Mg2+
• Mg2+
• Cofator da DNA polimerase
• Especificidade e eficiência da enzima
•Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita
de DNA (↑ Tm)
• Rendimento x Concentração crítica e empírica
↑ [Mg2+
]  ↑eficiência ↓especificidade

14. Função e relevância dos primers
• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de
sequência complementar e flanqueadora à fita
molde, com a extremidade 3´-OH livre

15. Thermus aquaticus
DNA polimerase termorresistente
• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo
• Taq DNA Polimerase
• Dependente de cátions bivalentes (Mg2+
> Mn2+
>>>Ca2+
)
• Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)
Parque Nacional de Yellowstone / EUA

16. DNA molde
• Qualidade
• Cuidado com resíduos de processos de extração
• SDS (dodecil sulfato de sódio)
• Fenol
• Corantes
• Heparina/EDTA/Citrato
• Polissacarídeos vegetais/carragenina
• Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV
• Quantidade
• Excesso de DNA é prejudicial
• Aumento de reação inespecífica

18. Parâmetros de termociclagem
• Temperatura de anelamento
↑ Tanelamento  ↑estringência
↓produtos inespecíficos
↓ Tanelamento  ↑rendimento
↑ produtos inespecíficos
• Tempo de extensão
• DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C
• Mínimo = 1 minuto
• Excesso  Atividade de exonuclase 5´-3´

19. Aditivos
• Separação de fitas com alto conteúdo G:C
• Estruturas secundárias fortes
• Betaína (1 M)
• DMSO (1-10%)
• Formamida (1-10%)
• Agentes estabilizantes da DNA polimerase
• Redução da adesão de reagentes ao tubo
• BSA (0,1 mg/mL)
• Gelatina (0,1 – 1,0%)
• Detergentes não-iônicos (<0,5%)

20. Inibidores
• Derivados das próprias amostras ou do método
de extração/purificação do ácido nucléico;
• Fenol/álcoois
• EDTA
• Debris celular
• Detergentes

23. Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)

24. Visualização dos resultados
• Separação por eletroforese
• Corantes/marcação fluorescente

25. Visualização dos resultados
• Sequenciamento capilar
• Dideoxinucleotídeos

26. Antes da PCR...
• Clonagem!

27. Antes dos termocicladores...
• Banho-maria!

28. Desenho deDesenho de
primersprimers

29. Características de bons primers
• Tamanho adequado
• 15 a 25 pares de bases
• Tamanho x Temperatura de dissociação
• Temperatura adequada de dissociação (Tm)
• Conteúdo G:C
•Diferença entre primers < 5º C

30. Características de bons primers
• Tamanho do fragmento a ser gerado
• Tempo de extensão da polimerase
•Especificidade
 Primers específicos x degenerados

31. Características de maus primers
• Inter-complementariedade
• Formação de dímeros (primer dimer)
• Atenção à extremidade 3´

32. Características de maus primers
• Auto-complementariedade
• Formação de auto-dímeros e hairpins

34. Características de bons primers
• Adequação para qPCR
• Tamanho do amplicon
•Junção exon-exon e contaminação com gDNA

35. Ferramentas online de suporte
• Primer-BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
• Primer3
bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3
• IDT Oligo Analyzer 3.1
www.idtdna.com/calc/analyzer
• UCSC PCR in silico
genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
• RT Primer DB (específico para qPCR)
• medgen.ugent.be/rtprimerdb

36. Problema
detectado
Workflow para desenho de primers
Verificar
• Temp. de anelamento
• Temp. de dissociação
• Tamanho do amplicon
• Estruturas secundárias
• Complementaridade
• EspecificidadeNãoSim
PCR para
confirmação de
funcionamento
PCR para
confirmação de
funcionamento
GenBank/NCBI
Encontrar sequência da
região desejada
Encontrar sequência da
região desejada
PrimerBLAST
Primer3, etc
Desenhar primersDesenhar primers
Registrar e arquivar
resultados obtidos
Registrar e arquivar
resultados obtidos
Reação
adequada
OK?OK?
CHECAR PRIMERS!CHECAR PRIMERS!

37. PCRPCR
quantitativaquantitativa

38. PCR quantitativa
• Nomenclatura
• qPCR
• qRT-PCR
• Real-time PCR

39. Ensaios químicos disponíveis
• SYBR Green I
• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)
• Molecular Beacons
• LightCycler
• LUX
Detecção de
fluorescência!
↑ sensibilidade

40. SYBR Green I
• Corante específico para DNA de fita dupla
• Flourescência aumenta ao longo da reação
• Não tem ação inibitória
• Detecta produtos inespecíficos
SYBR Green I
Brometo de etídio

41. Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
• Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase
• Altamente específica, sem produtos espúrios
• Duas marcações simultâneas são possíveis
• Tecnologia baseada em FRET
• Flourescence Resonance Energy Transfer

42. FRET - Transferência de energia por ressonância
fluorescente
• Fenômeno quântico entre duas moléculas muito
próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão
de luz
• Quencher/bloqueador

43. Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan

45. Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
• Discriminação alélica

46. Conceitos importantes
• Fases exponencial, logarítmica e plateau
• Threshold
• Baseline
• Cycle threshold (CT)
Ciclos
Flourescência
(produtosdePCR)
Plateau
Linear
Exponencial
Threshold

47. Ciclos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Amostra A 3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536 3072
Amostra B 15 30 60 120 240 480 960 1920 3840 7680 15360
~7,05 ~9,38

48. ↑ CT ↓ Qtde. inicial↑ CT ↓ Qtde. inicial
Quantidade
inicial
CT
Amostra A 3 9,38
Amostra B 15 7,05

49. Conceitos importantes
• Quantidade inicial de amostra
• Relação CT x Quantidade inicial

50. Conceitos importantes
• Eficiência
2n
= cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%

51. Conceitos importantes
• Eficiência
Qtde.
inicial de
DNA
1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1

52. Log 10
da qtde.
inicial
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
Conceitos importantes
• Eficiência

53. E = 10(-1/slope)
Conceitos importantes
• Eficiência
Eficiência 100% = 2n
a cada ciclo = log 2 x
Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32
Slope
(inclinação)

54. Conceitos importantes
• Curva-padrão e blank sample
• Gene de referência/constitutivo/normalizador
• Gene de interesse
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação
Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0
Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0
Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0
Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33
Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0
Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 + 0,67

55. Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Indica a temperatura em que 50% dos primers
estão anelados;
• Ligação específica do corante à fita dupla

56. Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C
• Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de
primers

57. Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Importante para distinção de amplicons/primers
em protocolos multiplex

58. Fatores que afetam a eficiência da qPCR
• DNA degradado
• Produtos inespecíficos
• Tamanho do amplicon
• Condições de termociclagem
• Prática laboratorial inadequada
• Reagentes contaminados
• Primers mal desenhados
• Diluições mal feitas
• Falta de calibração e manutenção
• Pipetagem errada!

59. Funções da PCR quantitativa
• Quantificação absoluta
• Curvas-padrão
• Quantidade conhecida de “cópias por volume”
• Semelhante a um ELISA
• Exemplos: carga viral, 16S bacteriano
• Avaliação relativa
• Ausência de curva-padrão
• Gene de referência para normalização
• Apresentada em aumento/redução em relação a um
controle experimental
• Exemplo: expressão gênica

60. CÁLCULOS E
ANÁLISES
CÁLCULOS E
ANÁLISES
Verificar dispersão entre replicatas
biológicas e técnicas
Verificar dispersão entre replicatas
biológicas e técnicas
Checar controles positivos
(curva-padrão) e negativos (blank)
Checar controles positivos
(curva-padrão) e negativos (blank)
Conferir curvas de dissociação (Tm)Conferir curvas de dissociação (Tm)
Verificar ajuste do thresholdVerificar ajuste do threshold
Análise de resultados
Avaliar as curvas de amplificaçãoAvaliar as curvas de amplificação

61. Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta
• Regressão linear simples
• Método PfafflMétodo Pfaffl  Curva de cópias (plasmídeos)Curva de cópias (plasmídeos)

62. Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
• Relação matemática entre a expressão dos genes
de referência e os de interesse
• Método LivakMétodo Livak  22--ΔΔΔΔCTCT

63. Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
• Avaliada a conformidade de todos os outros
parâmetros, a única informação útil será o CT
• Exemplo:
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4
Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1
Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8
Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9
Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9

64. GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47
Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38
Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72
Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57
Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01
GAPDH IFN-γ
Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53
Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59
Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15
Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66
Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57
Controle
Infectado
ΔCT ΔΔCT 2
-ΔΔCT
ΔCT
Média ΔCT
16,32
Média ΔCT ΔΔCT 2
-ΔΔCT

66. Extração e manuseio de ácidos nucléicos
• RNA = extremamente lábil!
• Armazenamento correto
• Dosagem e normalização das amostras
• A260/280 e A260/230 > 1,8
• Contaminação com DNA genômico
Confecção de cDNA
• Normalizar a mesma quantidade (p.e. 2 µg) de
RNA para todas as amostras;
• Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;
• Ciclos de congelamento/descongelamento;

67. Escolha do gene de referência
• É necessário ter opções!
• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo
• Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem
ter a expressão do gene constitutivo alterada;
•Preparar um pool com amostras-controle
• 6 diluições em triplicata
• Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0
•Algoritmos gratuitos na internet
•NormFinder: macro para Excel

68. Antes da qPCR...
• Northern Blotting (RNA)
• Southern Blotting (DNA)

69. PCRPCR
digitaldigital

70. PCR digital (dPCR)
Baseada na compartimentalização da amostra
• Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos
• Chips com nanopoços
Individualização das moléculas!
Distribuição de Poisson
Aplicações
• Quantificação absoluta sem curva-padrão
• Expressão gênica
• Detecção de alelos raros e/ou mutações
• Discriminação de baixas diferenças para CNV

71. Sample DNA
Target

72. Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)

73. http://www.gene-quantification.de/

77. O que é importante saber?
• Teoria e suas diferenças entre as técnicas
• Vantagens e desvantagens de cada uma
• Como aplicar a PCR ao seu projeto
• Aplicações gerais e específicas
• Boas práticas laboratoriais

78. Lucas Secchim Ribeiro
secchimribeiro@gmail.com
Dpto. Microbiologia
Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
Sala C4 191 – Ramal 2735