PCR primeiro

1. REAÇÃO DA POLIMERASEREAÇÃO DA POLIMERASE
EM CADEIA - PCREM CADEIA - PCR
Polymerase Chain Reaction

2. O QUE É PCR?O QUE É PCR?
 É uma metodologia que se baseia naÉ uma metodologia que se baseia na
amplificação exponencial seletiva de umaamplificação exponencial seletiva de uma
quantidade reduzida de DNA de umaquantidade reduzida de DNA de uma
única célula, sem o uso de um organismoúnica célula, sem o uso de um organismo
vivo.vivo.

3. HISTÓRICOHISTÓRICO
 Karys Mullis descreveu a PCR no final daKarys Mullis descreveu a PCR no final da
década de 1980.década de 1980.
 Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-ElmerEm 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer
Corporation patenteou este processo .Corporation patenteou este processo .
 O Prêmio Nobel da Química foi atribuído àO Prêmio Nobel da Química foi atribuído à
Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.
 Atualmente, método PCR é usadoAtualmente, método PCR é usado
habitualmente nos laboratórios de investigaçãohabitualmente nos laboratórios de investigação
médica e biológica para uma variedade demédica e biológica para uma variedade de
tarefas.tarefas.

4. PARA QUE SERVE A PCR?PARA QUE SERVE A PCR?
 Diagnóstico médico;Diagnóstico médico;
 Mapeamento genético;Mapeamento genético;
 Detecção de doenças hereditárias;Detecção de doenças hereditárias;
 Clonagem de genes;Clonagem de genes;
 Testes de paternidade;Testes de paternidade;
 Criação de organismos transgênicos;Criação de organismos transgênicos;

5. PARA QUE SERVE A PCR?PARA QUE SERVE A PCR?
 Medicina Forense:Medicina Forense:
pequenas amostras de DNA retiradas dapequenas amostras de DNA retiradas da
cena de um crime (pedaços de cabelo, gotascena de um crime (pedaços de cabelo, gotas
de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou atéde sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até
mesmo a minúscula quantidade de DNAmesmo a minúscula quantidade de DNA
deixada em uma impressão digital) sãodeixada em uma impressão digital) são
amplificadas para serem analisadas peloamplificadas para serem analisadas pelo
método demétodo de fingerprintingfingerprinting..

6. PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS
 Devem ser realizados com o maior cuidado paraDevem ser realizados com o maior cuidado para
evitar contaminações que possam alterar oevitar contaminações que possam alterar o
resultado.resultado.
 Em primeiro lugar, deve-se extrair o materialEm primeiro lugar, deve-se extrair o material
genético da célula ou outro material a sergenético da célula ou outro material a ser
estudado (exemplo: vestígios de crimes) semestudado (exemplo: vestígios de crimes) sem
danificá-lo.(Normalmente o material extraído é odanificá-lo.(Normalmente o material extraído é o
DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNADNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA
(ARN) em uma RT-PCR que é um(ARN) em uma RT-PCR que é um
desdobramento da PCR e possui outrasdesdobramento da PCR e possui outras
aplicações).aplicações).

7. PROCEDIMENTOS:PROCEDIMENTOS:
 Após a extração do DNA, adiciona-se umaApós a extração do DNA, adiciona-se uma
mistura (conhecida como pré-mix) quemistura (conhecida como pré-mix) que
contém:contém:
dNTPsdNTPs
PrimersPrimers (ou iniciadores)(ou iniciadores)
Solução Tampão.Solução Tampão.
Enzima Taq DNA polimeraseEnzima Taq DNA polimerase

8. Taq DNA polimeraseTaq DNA polimerase
 AA Taq DNA polimeraseTaq DNA polimerase, também denominada, também denominada
Taq polimeraseTaq polimerase ou apenasou apenas TaqTaq, é uma DNA, é uma DNA
polimerase termoestável, utilizada napolimerase termoestável, utilizada na
amplificação de fragmentos de DNA através daamplificação de fragmentos de DNA através da
técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sidotécnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido
identificada pela primeira vez na bactériaidentificada pela primeira vez na bactéria
Thermus aquaticusThermus aquaticus, encontrada em fontes, encontrada em fontes
hidrotermais. A Taq polimerase suporta ashidrotermais. A Taq polimerase suporta as
elevadas temperaturas usadas em PCR, tendoelevadas temperaturas usadas em PCR, tendo
uma semi-vida enzimática de 40 minutos (auma semi-vida enzimática de 40 minutos (a
94ºC).94ºC).

9. PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS
 Toda esta mistura é colocada noToda esta mistura é colocada no
termociclador, o qual faz ciclos determociclador, o qual faz ciclos de
temperatura pré-estabelecidos comtemperatura pré-estabelecidos com
tempos exatos específicos para cadatempos exatos específicos para cada
reação (fragmento a ser amplificado).reação (fragmento a ser amplificado).

10. TERMOCICLADORTERMOCICLADOR

11. PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS
 O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorreO Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre
em três fases:em três fases:
Fase de Desnaturação (94-96ºC)Fase de Desnaturação (94-96ºC)
Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)
Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)

12. Fase de DesnaturaçãoFase de Desnaturação
 a temperatura é elevada de 94 a 96ºC pora temperatura é elevada de 94 a 96ºC por
pouco tempo para que haja a separaçãopouco tempo para que haja a separação
da dupla cadeia de DNA (Desnaturação)da dupla cadeia de DNA (Desnaturação)
através da quebra das pontes deatravés da quebra das pontes de
hidrogênio, dando origem a duas fitashidrogênio, dando origem a duas fitas
simples de DNA sobre as quais a síntesesimples de DNA sobre as quais a síntese
posteriormente vai ocorrerposteriormente vai ocorrer

13. Fase de hibridização ouFase de hibridização ou
anelamentoanelamento
 a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºCa temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC
dependendo da quantidade de C e Gdependendo da quantidade de C e G
encontrada no primer, para que osencontrada no primer, para que os
primers se anelem (pareiem) com a fitaprimers se anelem (pareiem) com a fita
molde de DNA (anelamento).molde de DNA (anelamento).

14. Fase de Extensão do DNAFase de Extensão do DNA
 a temperatura é elevada a 72ºC para quea temperatura é elevada a 72ºC para que
a enzima taq-polimerase possa funcionara enzima taq-polimerase possa funcionar
sintetizando a nova molécula (extensão),sintetizando a nova molécula (extensão),
em seguida um novo ciclo é iniciado.em seguida um novo ciclo é iniciado.

15. PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS
 O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.
 Duas cadeias são sintetizadas a partir deDuas cadeias são sintetizadas a partir de
cada cadeia molde em cada ciclocada cadeia molde em cada ciclo
completo de PCR, o que dá umcompleto de PCR, o que dá um
crescimento EXPONENCIAL, havendo aocrescimento EXPONENCIAL, havendo ao
fim defim de nn ciclos 2ciclos 2nn
vezes mais cópias dovezes mais cópias do
que no início.que no início.

16. RESULTADOSRESULTADOS
Nº de CiclosNº de Ciclos Nº de CópiasNº de Cópias
11 22
22 44
33 88
66 6464
2020 1.048.5761.048.576
3030 1.073.741.8241.073.741.824

17. RESULTADOSRESULTADOS
 O resultado é analisado através de umaO resultado é analisado através de uma
eletroforese em gel de agarose ou deeletroforese em gel de agarose ou de
poliacrilamida e depois é interpretado compoliacrilamida e depois é interpretado com
a ajuda de um profissional competente.a ajuda de um profissional competente.

18. VANTAGENSVANTAGENS
 Capacidade de amplificar uma sequênciaCapacidade de amplificar uma sequência
precisa de DNA.precisa de DNA.
 Simplicidade, rigor, elevada sensibilidade eSimplicidade, rigor, elevada sensibilidade e
especificidade.especificidade.
 Não é necessário isolar o DNA que se pretendeNão é necessário isolar o DNA que se pretende
amplificar, mesmo que se encontre misturadoamplificar, mesmo que se encontre misturado
com o DNA de outras espécies, uma vez que oscom o DNA de outras espécies, uma vez que os
primersprimers definirão a especificidade.definirão a especificidade.
 Técnica rápida, barata e segura.Técnica rápida, barata e segura.

19. LIMITAÇÕESLIMITAÇÕES
 Necessidade de conhecer a sequência deNecessidade de conhecer a sequência de
DNA a amplificar para sintetizarDNA a amplificar para sintetizar primersprimers
específicos.específicos.
 Relativa facilidade com que ocorre aRelativa facilidade com que ocorre a
contaminação por DNA estranho.contaminação por DNA estranho.
 Limitada extensão da sequência.Limitada extensão da sequência.
 Incorporação errônea de bases durante aIncorporação errônea de bases durante a
replicação.replicação.

20. VARIAÇÕES DA TÉCNICAVARIAÇÕES DA TÉCNICA
BÁSICA DE PCRBÁSICA DE PCR
 Nested PCRNested PCR
 Hot StartHot Start
 Real time PCRReal time PCR
 RAPD-PCRRAPD-PCR
 Entre outras...Entre outras...

21. Nested PCRNested PCR
 Para melhorar a especificidade e aPara melhorar a especificidade e a
eficiência da reação, o segmentoeficiência da reação, o segmento
genômico é amplificado primeiro de formagenômico é amplificado primeiro de forma
abrangente, copiando até mesmoabrangente, copiando até mesmo
seqüências localizadas fora dela, eseqüências localizadas fora dela, e
utilizando-se este primeiro produto,utilizando-se este primeiro produto,
segue-se à amplificação da realsegue-se à amplificação da real
sequência-alvo.sequência-alvo.

22. Hot StartHot Start
 Variação da PCR onde a reação deVariação da PCR onde a reação de
amplificação é iniciada a temperaturasamplificação é iniciada a temperaturas
elevadas.elevadas.
 Atividade daAtividade da TaqTaq DNA polimerase éDNA polimerase é
inibida durante a preparação da reaçãoinibida durante a preparação da reação
 evitando a amplificação de produtosevitando a amplificação de produtos
inespecíficos,aumentando ainespecíficos,aumentando a
especificidade e melhorando o rendimentoespecificidade e melhorando o rendimento
da reação.da reação.

23. Real time PCRReal time PCR
 PCR em tempo real compreende umaPCR em tempo real compreende uma
amplificação convencional de DNA, porémamplificação convencional de DNA, porém
a detecção do resultado é feita a longoa detecção do resultado é feita a longo
dos ciclos através de marcadores.dos ciclos através de marcadores.
 O risco de contaminação se torna menor.O risco de contaminação se torna menor.

24. RAPD-PCRRAPD-PCR
 Consiste na amplificação randômica doConsiste na amplificação randômica do
DNA, por um par de iniciadores de baixaDNA, por um par de iniciadores de baixa
especificidade para com o DNA molde,especificidade para com o DNA molde,
gerando assim anelamentosgerando assim anelamentos
inespecíficos.inespecíficos.
 Essa técnica permite a tipagem doEssa técnica permite a tipagem do
genoma de microorganismos,genoma de microorganismos,
possibilitando sua comparação entrepossibilitando sua comparação entre
isolados de amostras clínicas.isolados de amostras clínicas.

25. BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA
 http://virtual.unipar.br/courses/GMBM/dochttp://virtual.unipar.br/courses/GMBM/doc
ument/aula-PCR-MESTRADO.pdf?ument/aula-PCR-MESTRADO.pdf?
cidReq=GMBMcidReq=GMBM
 http://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htmhttp://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htm
 http://pt.wikipedia.org/wiki/PCRhttp://pt.wikipedia.org/wiki/PCR

26. OBRIGADO!!!