2. ¿Que es genotipificacion?
• Genoma: “es la totalidad de la información genética que posee un
organismo en particular y que codifica para él.. En humanos, el genoma
consiste de 23 pares de cromosomas”
• Alelo: “Diferentes formas o variantes de una gen”
• Genotipo: “Conjunto particular de alelos para todos los genes portados por
un individuo”
Genotipificación
Determinación del genotipo de una persona
3. PCR
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
• Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
• (simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
4. Eventos en la Replicación del DNA:
•
Apertura de las cadenas (origen de replicación)
•
Colocación de los iniciadores (primers de RNA)
( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las
cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
•
Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
•
Eliminación de los iniciadores de RNA.
•
Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA
ligasa)
5. Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
• Componentes
– Desoxinucleotidos (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP,
dCTP
– Enzima Taq (Thermus aquaticus)
– Iniciadores (Primers) Complementarios a la cadena
de ADN
– ADN molde Concentracion de 20ng
8. ADN polimerasa
Estable a altas
temperaturas
Thermus
aquaticus
Thermococcus
litoralis
Enzima de 95kd.
Actividad
Exonucleasa: 5’—3’
Actuar altas temperaturas
9. PRIMERS
(Iniciadores, Cebadores)
Dos oligonucleótidos que
son complementarios a
cada una de las dos hebras
del ADN.
Únicos: Asegura alta especificidad:
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
CARACTERÍSTICAS
IMPORTANTES
Únicos
Tamaño
Dimeros de primers
5’
La secuencia del extremo 3’ es critica para el
funcionamiento
10. Tamaño
• Efectos en:
– Carácter de único
• Mas tamaño (15pb)
• Temperaturas de anillaje (ºTm)
– La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son
doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs)
12. Etapas de la PCR
1. Desnaturalización: Apertura de la doble cadena
2. Alineamiento: Anillaje de primers
3. Extensión: Generación de la nueva cadena
Temperatura
30 ciclos
100
Desnaturación
Desnaturación
94 oC
Extension
72 oC
50
50-60oC
Anillaje
0
Tiempo
94 oC
24. El numero de copias del DNA delimitado por
los primers se duplica en cada ciclo de PCR.
Numero de copias
1
2
4
8
16
32
64
0
1
2
3
4
5
6
Numero de ciclos
28. Tinción con Bromuro de etidio
Agente intercalante Bromuro
de Etidio
Molécula fluorescente que se
intercala entre la s bases de la
molécula de DNA
Absorción a 330 nm
(UV)emisión en luz visible
29. Factores que afectan la velocidad de migración
1. TAMAÑO DEL FRAGMENTO
la velocidad de migración del fragmento es
inversamente proporcional al log del nº de
pares de bases
2. CONFORMACION DE LA
MOLECULA
ADN circular
ADN Lineal
30. 3. VOLTAJE APLICADO
La velocidad de migración es
proporcional al voltaje aplicado
4. CONCENTRACIÓN
AGAROSA
Inversamente proporcional a
velocidad de corrido
2% 1.5%
1% 0.5%
32. Ejemplos de corridos de electroforesis
Con marcador de 100pb
Con marcador de 50pb
M
1
2
3
4
5
6
M
1
2
3
4
7
300pb 400pb
250pb
150pb
100pb
400pb
350pb 300pb
250pb
M
34. Interpretación de electroforesis
Calidad del ADN
BUENA CALIDAD DE ADN
1
2
3
4
5
CP: Control Positivo
CN: Control Negativo
1-6: Pacientes
6
CP CN
DIFERENTES CALIDADES DE ADN
1
2
3
4
CP
CN
CP: Control Positivo
CN: Control Negativo
Pozo 2 No ADN
Pozos 3 y 4 Bajas concentraciones
35. Técnicas derivadas/ basadas en PCR
PCR Nested
:Amplificación de una secuencia dentro
de otro previamente amplificada
PCR Multiplex
:Varios targets diferentes en forma
simultánea
PCR-RFLP
:Polimorfismo genético
RT-PCR
: Detección de mRNA
Real Time PCR
:Cuantificación de copias iniciales – en
tiempo real
36. PCR Nested (anidada)
Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers
1 Reacción
Primers externos
para amplificación
de una secuencia
extensa
2 Reacción
Primers internos
para amplificación
de una región
especifica
SEGUNDA PCR
Genera mayor ESPECIFICIDAD
37. PCR Multiplex
• Amplificación de varias
secuencias de forma
simultanea
• Diferentes set de primers
• Ojo Tamaño del
amplicon
APLICACIONES
Ensayos de deleciones
Amplifica exones
Ensayos forenses
Biomarcadores polimórficos
Ensayos microbiológicos
Cepas y especies
38. RFLPs
Restriction fragment length polymorphism
• Estudios de polimorfismos:
variación en la secuencia de
ADN
METODOLOGIA
1. Extracción de ADN
2. PCR – se obtiene la
secuencia target
3. Digestión con enzimas de
restricción mecanismo de
defensa de bacterias
4. Electroforesis en gel
39. Cambios en el sitio de restricción
Person A
5' GGCC
GGCC
GGCC
GGCC
3'
GGCC
GGTC
GGCC
3'
Person B
5' GGCC
40. Cambios en el sitio de restricción
Hae III corta:
5' GGCC
CC
5’ GGCC 3’
GGCC
GGCC
GG
CC
CC
3'
GG
CC
5' GGCC
GGCC
GGCC
GGTC
GG
GGCC
GG
CC
GG
3'
42. PCR en tiempo real (RT-PCR)
La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la detección de
los productos en un solo tubo.
“Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van
generando
Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo
real utilizando tecnologías fluorescentes
UTILIDADES
- Genotipificación
- Cuantificación de carga viral
- Cuantificación del numero de copias
de un gen
- Expresión génica (RNA)
Retrotranscripción
43. Componentes RT-PCR
Target
DNA Polimerasa
Primer
Nucleótidos
Solución Buffer
Sonda
Termociclador
Segmento de ADN que se ha seleccionado para
amplificar. Es el molde (Muestra).
Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde
una hebra simple de ADN (produce una hebra
complementaria).
Segmentos cortos de ADN de cadena simple
específico para un segmento de DNA. Los primers
son usados como punto inicial de la actividad de la
DNA polimerasa.
Pequeñas unidades de ADN; “letras“ del alfabeto
biológico (A, T, C, G).
Solución que reúne las condiciones necesarias para
que la reacción de amplificación se de.
Segmento corto de ADN complementario al target
(marcadores fluorescentes)
Equipo que produce ciclos térmicos (Capacidad de
detectar sondas)
44. PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real
PCR
tradicional
Preparación de la
Muestra
Amplificación
Detección
PCR en
Tiempo Real
Preparación de la
Muestra
Amplificación y Detección
45. Sistemas de Detección
Uso de moléculas fluorescentes
No-Específico
SYBR Green I
Molecular fluorescente que se unen
a ADN
Emisión a 520nm
DESVENTAJAS
Inespecífico
48. Sistema de Detección Específico
TaqMan
Uso de “secuencia especifica
de oligonucleotidos”
- Reportero 5’: Emite
fluorescencia
- Quencher 3’: Bloquea emisión
de fluorescencia
Actividad 5’ nucleasa
Separación reportero-quencher
49. Sistema de Detección Específico
Molecular Beacon Probes
Secuencia de la
sonda
Stem
Quencher
Fluoroforo
51. Sistema de Detección Específico
Scorpions probe
1. Hibridación del primer a una
secuencia target
Loop
Stem
Bloqueador
Quencher
Primer
Fluoroforo
2. Extensión de la
polimerasa formando un
producto de PCR
52. 4. Fase de anillaje Cambio conformacional
del loop
5. Hibridación
53. Cinética de
la PCR
Exponencial: Duplicación
exacta del producto se
acumula en cada ciclo.
Lineal: Componentes
consumidos, productos
empiezan a degradarse.
Plateau: Reacción se
consume y no se generan
más productos.
54. Fluorescencia
Plateau
Fase
logarítmica
UMBRAL
CT (CP)
Número de ciclos
• Umbral: Fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR
Green y Sondas de Hibridación (determinado automáticamente
por el instrumento).
• CT (CP): Número de ciclo en donde la fluorescencia supera el
umbral.
55. …El CT depende de la concentración inicial de ADN!
A > CT < [ ADN inicial ]
A < CT > [ ADN inicial ]
1
1.
2.
3.
4.
5.
10 ng = CT 18
1 ng = CT 21
100 pg = CT 25
10 pg = CT 28
Blanco
2
3
4
5
56. RT-PCR (Retro-transcripción)
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
mRNA
Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa
Primers: - Hexameros al azar
- Oligo dT
cDNA
PCR
Enzima Taq polimerasa
57. Métodos moleculares PCR
Ventajas
•
•
•
•
•
Método “Gold standard”
Se independizan del transporte.
Alta sensibilidad y especificidad
Se pueden utilizar sondas
Se puede utilizar en muestras no invasivas
58. Desventajas:
• Se necesita cierta información de la secuencia en
estudio para poder diseñar los primers.
• Limitaciones del tamaño del fragmento a amplificar
• Errores de la replicación.
• Contaminación (se reduce considerablemente tomando
las
precauciones
necesarias
y
en
manos
experimentadas).
64. Secuenciación automatizada
“Dye terminator”
Marca fluorescente en cada uno de los diferentes
nucleótidos: A, T, G y C.
Emisión de luz a una longitud de onda especifica
Laser de iones de argón
66. Lecturas automatizadas de las
secuencias de ADN
Cromatograma o electrofenograma
- Se representa la base según color diferente
- Intensidad de la señal luminosa (altura del pico)
68. Conclusiones
• Aunque en biología molecular existen muchas
técnicas para detección de cambios tanto a nivel
del ADN como a nivel cromosómico, el secreto esta
en seleccionar la mas adecuada dependiendo de
los requerimientos y la disponibilidad