Curva Calibração Bradford

1. Elaboração de curva de calibração para a quantificação de proteínas
pelo método de Bradford
Jessica Gamba, Débora Grinet, Adriane M. F. Milagres, Walter Carvalho
Escola de Engenharia de Lorena, EEL - USP
1. Introdução e Objetivos
Atividades de pesquisa e desenvolvimento
na área de produção, purificação e
caracterização de enzimas exigem um método
rápido e sensível para a quantificação de
proteínas. O método baseado na adsorção do
reagente Coomassie Brilliant Blue G-250,
proposto por Marion Bradford em 1976[1]
,
preenche estes pré-requisitos.
No presente trabalho, apresentamos os
resultados obtidos durante o preparo de uma
curva de calibração para a quantificação de
proteínas pelo método de Bradford, utilizando
albumina de soro bovino como padrão.
2. Material e Métodos
Para a preparação do reagente de
Bradford, dissolveu-se 100mg de Coomassie
Brilliant Blue G-250 em 50mL de etanol 95% e,
em seguida, adicionou-se 100mL de ácido
fosfórico 85%. A solução assim obtida foi
avolumada para 1L com água deionizada. Após
filtração em papel de filtro quantitativo
(Whatman n°1), a solução foi mantida em
geladeira.
As soluções-padrão foram preparadas em
tampão acetato de sódio 0,05M em pH 4.8,
adicionado de NaCl 0,15M. O tampão foi
preparado titulando-se acetato de sódio 0,05M
com ácido acético 0,05M até pH final de 4,8 e,
em seguida, dissolvendo-se o NaCl. Uma
solução-mãe de albumina bovina foi então
preparada no tampão salino e, a partir desta
solução-mãe, preparou-se cinco diluições com
as seguintes concentrações: 4,2µg/mL,
20,8µg/mL, 52,0µg/mL, 104,0 µg/mL e
208,0µg/mL.
Em tubos de ensaio, porções de 1mL do
reagente de Bradford foram misturadas a
porções de 0,1mL de cada uma das diluições
da solução-mãe. Em seguida, as respectivas
absorbâncias a 595nm foram determinadas em
espectrofotômetro, utilizando-se água em lugar
de solução-padrão para o branco.
3. Resultados e Discussão
A curva de calibração é apresentada na
Figura 1. Conforme pode ser observado, a
correlação entre absorbância a 595nm e
concentração de albumina bovina se mostrou
linear para concentrações de albumina
variando entre 4,2 e 208μg/mL.
y = 0,004x - 0,0005
R2
= 0,9967
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0
Concentração de albumina bovina (µg/mL)
Absorbânciaa595nm(-)
Figura 1: Curva elaborada para a quantificação
de proteínas pelo método de Bradford
4. Conclusão
Durante o preparo das soluções-padrão, a
dissolução da albumina bovina em tampão
salino se mostrou uma estratégia eficiente para
eliminar a necessidade de agitação excessiva e
aquecimento. Tais medidas, necessárias para
solubilizar a proteína em água e ou solução-
tampão, provocaram intensa formação de
espuma.
5. Referências Bibliográficas
[1] Bradford, M. Analytical Biochemistry. 72,
248-254, 1976.
Agradecimento: Fapesp e CNPq