Autor práce: Eva Klemensová Vedoucí práce: RNDr. Petr Pečinka, CSc. OSTRAVSKÁ UNIVERZITA V OSTRAVĚFAKULTA 2009 PŘÍRODOVĚDECKÁ KATEDRA BIOLOGIE A EKOLOGIE

1. OSTRAVSKÁ UNIVERZITA V OSTRAVĚ FAKULTA PŘÍRODOVĚDECKÁ KATEDRA BIOLOGIE A EKOLOGIE Detekce poškození DNA pomocí PCR BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2009 Autor práce: Eva Klemensová Vedoucí práce: RNDr. Petr Pečinka, CSc.

9. Výsledky

10. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konc. MMS (mM): 0 1,2 11,8 119,2 0,6 5,9 59,3 621,3 0,6 5,9 59,3 621,3 1,2 11,8 119,2 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM2 s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráha 1 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-8 : stoupající koncentrace (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) MMS po inkubaci 5 minut, dráhy 9-15 : stejné stoupající koncentrace MMS po inkubaci 30 minut.

11. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konc. MMS (mM): 0 1,2 11,8 119,2 0,6 5,9 59,3 621,3 0,6 5,9 59,3 621,3 1,2 11,8 119,2 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM2 s MMS po 15 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráha 1 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-8 : stoupající koncentrace (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) MMS po inkubaci 5 minut, dráhy 9-15 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) po inkubaci 30 minut.

12. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Konc. MMS (M): 0 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0,06 0,62 2,08 0,06 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM2 s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráhy 1,14 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-7 : stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráhy 8-13 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut.

13. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Konc. MMS (M): 0 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0,06 0,62 2,08 0,06 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM2 s MMS po 15 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráhy 1,14 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-7 : stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráhy 8-13 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut.

14. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konc. MMS (M): 0 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0,06 0,62 2,08 0,06 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pPGM1 s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu. Dráhy 1,15 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-7 : stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráha 8 : standard (100 bp), dráhy 9-14 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

15. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konc. MMS (M): 0 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0,06 0,62 2,08 0,06 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pBluescript II SK (-) s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Dráhy 1,15 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-7 : stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráha 8 : standard (100 bp+1 kb), dráhy 9-14 : stejné stoupající koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 10000 bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 4000 bp 3500 bp 3000 bp 2500 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 750 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 250 bp 200 bp 100 bp

16. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Konc. MMS (mM): 0,12 1,31 2,95 0,12 1,31 2,95 0 0,62 2,08 0,62 2,08 0 Inkubace 5 min Inkubace 30 min Modifikace pBluescript II SK (-) s MMS po 10 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu. Dráhy 1,13 : plasmid bez MMS jako kontrola, dráhy 2-6 : stoupající koncentrace MMS (1-20 % neboli 0,12-2,95 M) po inkubaci 5 minut, dráha 7 : standard (100 bp), dráhy 9-12 : stejné stoupající koncentrace MMS (1-20 % neboli 0,12-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

17. Dráha: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Zkouška znečištění na pBluescript II SK(-) a pPGM1 po 30 cyklech PCR Elektroforéza proběhla při 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu. Dráhy 1-4 : pBluescript II SK(-), dráha 5 : standard (100 bp), dráhy 6-9 : pPGM1. Dráhy 1 a 6 obsahují vše (plasmid, Taq DNA-polymeráza, pufr, dest.voda, primery, dNTP), dráhy 2 a 7 : vše bez primerů, 3 a 8 : vše bez plasmidu, 4 a 9 : vše bez Taq DNA-polymerázy. Neustále byla zjišťována příčina krátkých úseků, nakonec je vysvětleno, že důvodem je znečištění primerů. Ve dráhách 2 a 7, kde nejsou obsaženy primery se neobjevuje znečištění. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp pBluesript II SK(-) pPGM1