Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan perbedaan kecepatan migrasinya dalam medan listrik. Metode ini menggunakan gel sebagai matriks pemisahan dan mengaplikasikan medan listrik untuk memisahkan fragmen DNA dan protein berdasarkan ukuran molekulnya. Hasil elektroforesis dapat diamati dengan pewarnaan untuk mengetahui panjang fragmen DNA atau berat molekul protein.

2. Pengertian
• Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau
molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik.

3. Prinsip
• Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan.
• Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung
pada muatan terhadap massanya serta
tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya
Lorentz
F = gaya Lorentz,
q = muatan objek,
E = medan listrik

4. How will you do if :
• You’re holding a small plastic
tube with some clear liquid in it
• You’ve been told that the liquid
contains DNA strands of several
different lengths
• Your job is to figure out what
those lengths are

6. Apa Itu Elektroforesis Gel?
Metode Elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan dan menganalisis fragmenfragmen makromolekul (asam nukleat dan
protein)
Menggunakan gel sebagai “saringan”

7. Kapan Kita Menggunakan
Elektroforesis Gel?

8. Jenis-Jenis Elektroforesis Gel
Elektroforesis DNA/RNA :
•
•
Elektroforesis gel agarose : horizontal
Elektroforesis gel poliakrilamida : vertikal
Elektroforesis Protein :
PAGE (PolyAcrilamide Gel Electrophoresis)
Sistem yang digunakan dalam PAGE
- Flat Bed
- Rod atau Column
- Vertical Slab
- Capillary
• SDS PAGE
• Blue Native PAGE (BN-PAGE)
• Zymogram PAGE
• Isoelectric Focusing (IEF)
• 2-D Electrophoresis
•

10. Komponen
Elektroforesis Gel

11. Gel
1.
2.
3.
Berfungsi sebagai matriks Penyaring molekul
Pemilihan gel bergantung pada ukuran
molekul yang akan di elektroforesis
Biasanya terdiri dari
• Agarose
: digunakan secara horizontal
•
Poliakrilamida : digunakan secara vertikal

12. Agarose ditujukan pada berat molekul lebih dari 100 kb dan untuk
poliakrilamida untuk molekul –molekul 1-300 pasang basa, bahkan
mampu membedakan molekul-molekul dengan selisih panjang 1
nukleotida

13. Agarose Gel
1.
2.
3.
Dimurnikan dari polisakarida alga
Rhodophyla.
Gelidian dan Glaucaria adalah komponen
yang dimodifikasi residu galaktosanya.
Didalam hubungan dengan polisakarida,
agropefin dibentuk agar.
Agarose larut pada buffer (TAE) yang
mendidih dan ditunggu untuk dingin,
Hasil ini dicetak pada cetakan gel yang
ditempatkan pada suhu ruang.

14. Struktur Agarose Gel

16. Gambar SEM struktur agarose gel 2%
(a) 70 oC (b) 40 oC (c) 30 oC (d) 20 oC

17. Resolusi Gel Agarose
Resolusi : kemampuan memisahkan molekul
sehingga dapat terbaca dengan jelas

20. Gel Poliakrilamida
Poliakrilamida dibentuk dari akrilamida dan N,N’-methylebis-akrilamida yang dihubungkan dengan reaksi
polimerisasi dengan penambahan ammonium perisulphate
dan N,N,N,N'-tetramethylethylenediamin (TEMED). TEMED
adalah katalis yang dibentuk dari radikal bebas ion
perisulfate dan diinisiasi polymerization dari acrilamida.
Poliakrilamida dapat dikondisikan sebagai polimer yang
netral, kationik, anionik, atau amfoter dengan sifat fisika
dan kimia, panjang dan berat molekul yang bervariasi

21. Polimerisasi Akrilamida

22. Hasil SEM polyacrilamide gel
From :Journal of material chemistry website

23. Buffer
•
•
•
Fungsi : menjaga kesetimbangan pH,
memberikan ion untuk konduktivitas,
Elektroforesis DNA :
Buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), atau
TBE (Tris-borate-EDTA )
Loading buffer
Elektroforesis Protein :
Buffer Tris

24. Bagaimana caranya?
Visualisasi
(staining)
Proses
elektroforesis
Membuat
matriks gel

28. Gel Documentation System

30. Visualisasi Elektroforesis DNA
• Etidium Bromida  disinari lampu UV  berpendar

31. Staining
Dilakukan agar pemisahan elektroforesis
dapat teramati.
Staining untuk elektroforesis DNA :
Etidium bromida (penambahan EtBr
mengurangi laju migrasi sebesar 15% )
• SYBR Gold, SYBR Green, Crystal Violet, Methyl
Blue
•
Staining untuk elektroforesis protein:
Coomasie Blue
• Silver Staining
•

32. Elektroforesis Protein

33. Protein Molecular Weight Markers

34. Autoradiografi DNA

36. Seperti apa hasilnya?
• Elektroforesis DNA (EtBr Staining)

37. • elektroforesis protein

38. Elektroforesis protein
• Silver staining

39. Migrasi Molekul DNA Pada Gel
• Molekul DNA yang bermuatan negatif
karena adanya gugus fosfat akan
bergerak menuju anode (elektrode
bermuatan positif) saat dipisahkan
dengan elektroforesis
• Fragmen DNA yang memiliki ukuran
molekul yang sama akan memiliki
elektromobilitas yang sama dan
menempuh jarak migrasi yang sama
• Topologi DNA yang dipisahkan
menentukan elektromobilitas DNA.
DNA yang mengalami supercoil akan
bermigrasi lebih cepat karena
strukturnya sangat kompak.
Topologi molekul DNA
hasil Elektroforesis.

40. Faktor yang mempengaruhi pemisahan
komponen pada elektroforesis DNA
• Konsentrasi gel agarose---->
• Pengaruh Voltase : makin
tinggi voltase, migrasi
fragmen yang lebih besar
akan lebih cepat
• Buffer Elektroforesis
• Efek Etidium Bromida

41. Faktor yang mempengaruhi pemisahan
komponen pada elektroforesis protein
• Densitas molekul : berbeda diantara pH media
dan pl molekul
• Pengaruh buffer :
• Bentuk dan ukuran molekul
• Media pendukung:
•
•
•
•
Restriksi pada mobilitas
Pengaruh difusi
Elektroendosmosis
Mikro-heterogenitas molekuler spesies