Este documento presenta los resultados de un estudio sobre la microbiología del compostaje de alperujo mediante el análisis de RNA. Se encontró que la fase termófila es la más activa metabólicamente y que hay una especialización bacteriana asociada a la degradación y humificación de la materia orgánica. Luteinomonas, Parapedobacter y Planomicrobium parecen jugar un papel importante en la humificación y podrían ser biomarcadores de la maduración del compost. El estudio aporta nuevos conocimientos sobre las comun

1. Microbiología del
compostaje de
“alperujo“
Dr. Germán Tortosa Muñoz
Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas
Simbióticos
Estación Experimental del Zaidín (EEZ-CSIC)
http://www.compostandociencia.com
Email: compostandociencia@gmail.com

2. ¿Qué es el
compostaje?
- Proceso biológico de
transformación de los residuos
orgánicos en compost
- Degradación aeróbica de la MO
-Actividad metabólica de una gran
diversidad de microorganismos
presentes en los propios residuos:
bacterias y hongos.
-Liberación de energía: Incremento
temperatura y fases del
compostaje: mesófila, termófila,
enfriamiento y maduración

8. Foto: https://www.interempresas.net/Grandes-cultivos/Articulos/240818-Panorama-erosion-olivar-Jaen-procesos-
metodologias-significacion-economica-ambiental.html

9. La importancia de la materia orgánica
Mejora las propiedades físicas, químicas, y
biológicas
Dos tipos: La biológicamente no activa (humus)
y la biológicamente activa (microorganismos)

10. Foto: https://www.pnas.org/content/114/52/13587

21. Experimento Nº1: Cantidad de nitrógeno
equivalente (orgánico vs. inorgánico)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Peso seco parte aérea (78 días)
C
DN
DN+C
Tratamiento
PSPA
(g)
0
5
10
15
20
25
Peso seco parte aérea (104 días)
C
DN
DN+C
Tratamiento
PSPA
(g)

22. Experimento Nº2: Dosis compost creciente con
igual nitrógeno inorgánico
Control C1 C2 C3
0
4
8
12
16
20
Desarrollo vegetal
1º corte (98 días)
PSPA (g)
PSR (g)
Tratamientos
Peso
(g)
Control C1 C2 C3
0
4
8
12
16
20
Desarrollo vegetal
2º corte (127 días)
PSPA (g)
PSR (g)
Peso
(g)
Control C1 C2 C3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Producción de frutos
2º corte (127 días)
Peso
fresco
(g)

23. 0
50
100
150
200
250
300
Contenido en ascorbato (Vitamina C) en frutos
Control
C1
C2
C3
Tratamiento
mg/
100
g
peso
fresco

24. Microbiología del compostaje
Sigue siendo uno de los grandes retos científicos
1) Técnicas dependientes de cultivo.
2) Técnicas independientes de cultivo
- Material genético microbiano (DNA y RNA) y genes marcadores:
16S rRNA (bacterias), y 18S rRNA o ITS (hongos)
- Técnicas -ómicas: Metagenómica, metatranscriptómica, proteómica,
metabolómica, etc
- PCR cuantitativa (qPCR)
- Secuenciación masiva (NGS): Illumina MiSeq

25. DNA vs RNA
- Idea central de la biología molecular:
DNA se transcribe a RNA mensajero y éste se traduce una proteína
- Estudios de compostaje basados en DNA:
Composición microbiana y su abundancia relativa durante el proceso
- Estudios de compostaje basados en RNA:
Información sobre las poblaciones “metabólicamente activas“

26. Materiales y métodos experimentales
Proceso de compostaje
Compostaje de AL como modelo de estudio (Tortosa y col., 2012):
- Pilas de 10.000 kg, AL y estiércol de oveja (1:1, v/v)
- Estudio de dos pilas como réplicas biológicas
- Pilas estáticas y volteos mecánicos (7 volteos, más frecuentes durante la fase bioxidativa)
- Humedad entorno a 40-60%

27. Esquema experimental
PowerSoil®
DNA Isolation
kit
- Secuenciación NGS
bacterias (Tortosa et al.,
2017)
2 pilas (réplicas biológicas)
Fases mesófila, termófila
y de maduración
DNA

31. Esquema experimental
PowerSoil®
DNA Isolation
kit
- Secuenciación NGS
bacterias (Tortosa et al.,
2017)
- Secuenciación NGS
hongos y qPCR (Tortosa
et al., 2020).
2 pilas (réplicas biológicas)
Fases mesófila, termófila
y de maduración
DNA

34. DNA vs RNA
- Idea central de la biología molecular:
DNA se transcribe a RNA mensajero y éste se traduce una proteína
- Estudios de compostaje basados en DNA:
Composición microbiana y su abundancia relativa durante el proceso
- Estudios de compostaje basados en RNA:
Información sobre las poblaciones “metabólicamente activas“

35. - Compostaje de “alperujo“ (AL) como sistema modelo:
Estudio del proceso (Tortosa et al., 2012)
Descenso degradación MO (Hemi., Toc, Fat y WSCH)
Incremento de la humificación (Lig., HR, HD, PAH)
Evolución bacterias mediante NGS (Tortosa et al., 2017)
Evolución de hongos mediante NGS y qPCR (Tortosa et al., 2020)
- No hay estudios de las comunidades “metabólicamente activas“ en el
compostaje de AL
- Muy poco estudios de diversidad analizando RNA durante el compostaje:
Wang et al., (2019); Ding et al., (2020); Meng et al., (2020)
Objetivos del trabajo:
- Estudio de la diversidad, abundancia y actividad de las bacterias
metabólicamente activas durante el compostaje de AL
- Evaluar su implicación en los procesos de transformación de la materia
orgánica (humificación y maduración)

36. Esquema experimental
PowerSoil®
DNA Isolation
kit
RNA
PowerSoil®
Total RNA
isolation kit
- Secuenciación NGS
bacterias (Tortosa et al.,
2017)
- Secuenciación NGS
hongos y qPCR (Tortosa
et al., 2020).
- qPCR (Tortosa et al.
2021)
- Secuenciación
NGS bacterias
y qPCR
(Tortosa et al.,
2021)
PrimeScript
TM RT
reagent
Kit
2 pilas (réplicas biológicas)
Fases mesófila, termófila
y de maduración
cDNA
RNA
DNA

40. 3) Análisis:
qPCR (DNA y cDNA):
- Amplificación de la región V3
del gen 16S rRNA
- 341F y 534R
- iTaq Universal SYBR Green Supermix
- Patrón: plásmido de Pseudomonas putida
NCB 957
- Número copias 16S rRNA CDW-1
Secuenciación masiva (NGS). Illumina MiSeq (cDNA):
- Amplificación y secuenciación de la región V3-V4
del gen 16S rRNA
- Análisis Bioinformático:
- FastQC, FASTX-Toolkit, fastq-join
- Q20, >20 pb, 15 % overlapping
- SEED2 software (<300 pb), <Q30
- Quimeras y OTUs (SILVA y MOTHUR)
- Ribosomal Database project (RDP-II)

41. 4) Análisis estadístico
- Curvas de rarefacción
- Diversidad alfa: Observed and Chao1 richness; Shannon and InvSimpson
- Diversidad beta: Non-metric MultiDimensional Scaling Analysis (NMDS) based
on Bray-Curtis dissimilarities
- Statistical Analysis of Taxonomical and Functional Profiles (STAMP) open-
source software v2.1.3 release
- One-way ANOVA, Tukey-Kramer post-hoc test (p < 0.05), Storey’s FDR, y eta-
squared corrections
- Correlación de Pearson entre géneros y prop. Físico-químicas
- Functional Annotation of Prokaryotic Taxa
(FAPROTAX) bioinformatic tool (v.1.2.2 release)
Stilianos Louca Lab (Universidad de Oregón)
https://pages.uoregon.edu/slouca/LoucaLab/lib/
php/index.php

42. Resultados
qPCR (abundancia): DNA (a) y cDNA (b)
- DNA: Incremento durante el proceso; termófila>maduración>mesófila
- cDNA: Termófila como fase más activa del proceso

43. Resultados
Índices de diversidad
Alfa (α) Beta (β)
- Incremento de la diversidad alfa durante el compostaje
- Similitud en diversidad beta con el avance del proceso

44. Diversidad bacteriana durante el proceso
- Phyla predominantes: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes y Actinobacteria
(>84 % secuencias identificadas)

45. Diversidad bacteriana durante el proceso
- Descenso durante el proceso: Stenotrophomonas, Halotea, Pseudomonas,
Acinetobacter, ...

46. Diversidad bacteriana durante el proceso
- Incremento sólo en la fase termófila: Carnobacterium, Olivibacter, Flavobacterium,
Rhodococcus, ...

47. Diversidad bacteriana durante el proceso
- Incremento sólo en la maduración: Luteinomonas, Parapedobacter, Truepera,
Planomicrobium, ...

48. Correlación con la transformación físico-química de
la materia orgánica
- Descenso degradación MO (Hemi., Toc, Fat y WSCH) e incremento de la humificación (Lig., HR, HD, PAH)
- Stenotrophomonas, Halotalea, Pseudomonas y Cohnella (degradación de la MO)
- Luteinomonas, Truepera y Planomicrobium (humificaión)

49. 5- Asignación funcional de los taxones (FAPROTAX)

50. 5- Asignación funcional de los taxones (FAPROTAX)
- Funciones metabólicas características del compostaje relacionadas con la
degradación de la materia orgánica y reducción de patógenos

51. Conclusiones:
- Transcriptómica (RNA) es una aproximación válida para el estudio de
las comunidades bacterianas potencialmente activas
- qPCR confirma que la fase más activa es la termófila
- Comportamiento diferenciado de la comunidad bacteriana durante el
proceso: descenso durante el proceso, incremento solo en la fase termófila
y sólo en la maduración
- Hay una especialización bacteriana implicada en los diferentes procesos
metabólicos de la degradación de la materia orgánica
- Luteinomonas, Parapedobacter y Planomicrobium son potenciales
biomarcadores para el proceso de maduración y tienen un papel relevante
en la humificación

52. Hacía donde vamos (o queremos ir):
En Investigación
- Aislamiento y caracterización de PGPR del compost de AL (en marcha)
- Efecto de compost en la fijación simbiótica de nitrógeno (por hacer)
- Tratamiento biológico del “carozo” y aislamiento de bacterias PGPR (en
marcha)
- Patente de un abono orgánico y biológico a partir del compost de AL (por
hacer)
- Compostaje a pequeña escala (en marcha):
Diseño de un reactor (patente)
Curso y libro sobre “La ciencia del compostaje en casa”

53. http://www.compostandociencia.com
Email: german.tortosa@eez.csic.es
compostandociencia@gmail.com
@germantortosa
¡Muchas gracias por vuestra atención!