Este documento describe la estructura y fuerzas estabilizantes del ADN. Explica que el ADN absorbe radiación UV a 260 nm y que la temperatura de fusión depende del contenido en G-C. También resume experimentos de reasociación de ADN que revelan tres fracciones principales en el ADN eucariótico y que la cinética de reasociación mide la complejidad de las secuencias.

1. ADN: Estructura y Fuerzas
Estabilizantes
Dr. Daniel Corach
Elementos de genética y Biología Molecular
8 de Agosto de 2008
Curso EGBM 2008

3. Fuerzas Estabilizantes.
• La perturbación de la molécula bajo
condiciones controladas nos permitirá
comprobar la existencia de estas fuerzas
• Estas fuerzas subyacen la gran mayoría de
los de los sistemas experimentales de
análisis.

5. Rspectroscopía del AND
El ADN absorbe radiación UV con un máximo en 260 nm
Densidad Optica
El análisis de absorción
permite detectar diferencias en
el estado estructural tanto del
AND como del ARN el
coeficiente de extinción molar
Longitud de Ondah depende de la estructura
260
ADNdc ADNmc
Bajo Mayor coeficiente
coeficiente de de extinción
extinción

6. Estudio de l Estabilidad del ADN Medinate
Curvas de Desnaturalización
Curva de
Desnaturalización
de ADN de
Streptococcus
Cuando el ADN se
desnaturaliza las
dos cadenas se
separan y su
absorbbancia al
UV se incrfeenta
Temperatura
Tm= temp.a la que el 50%de las moleculas se desnaturalizan

7. Composición de Bases (contenido en G-C)
determina la temperatura de fusión : varia entre
los organismos
Tm C°

8. El Contenido en G-C es Propoecional a la Densidad de Flotación
80
M. phlei
60
G + C (%)
Serratia
E. coli
Timo de Ternera
40 Esperma de Salmón
Pneumococcus
20
1.69 1.70 1.71 1.72 1.73 1.74
Densidad (r)

9. Contenido en GC de Diversos Genomas
Organism % GC
Homo sapiens 39.7 %
Oveja 42.4 %
Burro 42.0 %
Toryuga 43.3 %
Salmon 41.2 %
Erizo de Mar 35.0 %
E. coli 51.7 %
Staphylococcus aureus 50.0 %
Fago λ 55.8 %
Fago T7 48.0 %

11. Factores que afectan la temperatura de
fusión
µ = 0.06
• La temperatura de fusión µ = 0.21
(Tm) aumenta con: % G+C
– aumento en G+C
– aumento de la fuerza iónica (µ)
• Tm disminuye con:
– Aumento de desnaturalizantes.
– Incremento de “mismatches” Tm
Tm = 0.41 (% G+C) + 16.6 log M + 81.5 -0.7 (% formamida)
-1o (% mismatch)

12. Fuerzas Estabilizantes.
Correlación entre CG% y Tm
SSC 1 X %GC=(Tm-69,3) x 2,44
SSC0,1 X %GC=(Tm-53,9) x 2,44

13. Reasociación del ADN
• Proceso cinético de
segundo orden..
• Con una fase lenta y
una fase rápida.
• Depende de la
concentración de
reactantes, de las
condiciones iónicas
del medio, de la
Temperatura, etc.

14. Efecto Hipocrómico
D.O. • El efecto hipocrómico
se encuentra
Baja [Na] influenciado por
ciertas condiciones.
• Cuales?
Alta [Na] • Porqué?
94C 10C
Temperatura

15. Cambios Estructurales Durante la
Desnaturalización del ADN
•

16. Estructura de ADN
Caracteísticas Adicionales
El ADN Genómico está constituído por moleculas grandes:
Eschericia coli: 4.7 x 106 pb; ~ 1 mm de longitud
Humano: 3.2 x 109 pb; ~ 1 m de longitud
Algunas moleculas de ADN (plasmidos, ADN mitocondrial) son circulares y no
tienen extremos libres:
mtDNA
ADN bacteriano (un único cromosoma circular)
Un gen promedio de 1000 pb codifica para una proteina promedio de alrededor de 330
aminoacidos
El porcentage de ADN no codificante varia mucho entre organismos
Organismo # Pares de Base # Genes ADN No-codificante
Virus chico 4 x 103 3 Muy poco
‘virus típico 3 x 105 200 Muy poco
bacteria 5 x 106 3000 10 - 20%
Levadura 1 x 107 6000 > 50%
humano 3.2 x 109 30,000? 99%
amfibios < 80 x 109 ? ?
plantas < 900 x 109 23,000 - >50,000 > 99%

17. 140 Mb
3300 Mb
4.4 Mb
0.6 Mb
4.6 Mb

18. Las células portan diferentes contenidos
de ADN en sus genomas
• Valor-C – la cantidad total de ADN en un genoma haploide
• n = número cromosómico, v.g. 23 en humanos
• Cromosomas
• autosomas
• cromosomas sexuales
• ploidia – número de copias de los cromosomas en la célula
• haploide – una copia
• diploide – dos copias
• poliploide – copias multiples
• aneuploide – número incompleto o aberrante de copias

19. “Paradoja del Valor C”.
Ausencia de Relación Entre la Cantidad de
ADN y la Complejidad Organismica.

20. La Cinética de
Reasociación mide la
Complejidad de las
Secuencias

21. Cinética de Reasociación
• Genoma Procariótico
• Curva de reasociación
simple.
• La reacción se
completa en un rango
de Cot reducido (2
ordenes de magnitud)

22. Reasociación, Annealing, Hibridación
de Acidos Nucleicos: Curvas Cot
Co x t1/2
Reasociacion más Lenta
• Las primeras en encontrar su complentarias y asociar son secuencias simples de ADN.
• Cinética de 2° orden, la asociación más rápida se produce entre las secuencias simples.
• La Clase más lenta la constituyen el ADN de copia única que constituye la mayoría de los
genes.
• Cot refleja la cantidad de una familia de secuencias en el genoma.

23. Experimentos de Reasociación
revelan 3 fracciones principales en el
ADN eucariótico.
• ADN Copia Unica (50-60%)
• Contiene la mayoría de las secuencias codificantes.
• ADN Moderadamente-repetido/repetición-
intermedia(25-40%)
• Incluye elementos mobiles de ADN.
• ADN altamente repetido/Secuencias simples/ADN
Satélite (10-15%)

24. Tipos de ADN en cada componente cinético
ADN Genómico Humano
0
”Plegadoquot;
Más de 106 de secuencias de ADN satélite
Alrededor de 1 million de copias de repeticiones Alu, c/u 0.3 kb
fracción reasociada
0.25 Alrededor de 50,000 copias de repeticiones L1
(longitud: 0.2 a 7 kb), más 1000 a
10,000 copias de al menos10 otras
familias de repeticiones dispersas
intermedias de ADN
0.50
Miles de repeticiones de genes de rRNA
0.75
Entre 50,000 at 100,000 genes ”cpia únicaquot;
1.00
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5
Cot

25. Cinética de Reasociación
1.0
Fracción AND Procariota
que
Permanec AND
Repetido Unique
e Mono Secuencia
Cadena 0.5 compleja
ADN Eucariota
(C/Co) de ADN
0
10-4 10-3 10-2 10-1 1 101 102 103 104
Cot (mole x seg./l)

26. ADN Repetido
Organism % ADN Repetido
Homo sapiens 21 %
Ratón 35 %
B. taurus 42 %
Drosophila 70 %
Trigo 42 %
Arveja 52 %
Maiz 60 %
Saccharomycetes cerevisiae 5%
E. coli 0.3 %

27. Cinética de Reasociación
1.0
Fracci Mayor valor
ón que
Perma
de Cot1/2
nece indica mayor
Mono complejidad
Caden 0.5
a Cot1/2 genómica
(C/C0)
0
10-4 10-3 10-2 10-1 1 101 102 103 104
Cot (mole x seg./l)

28. ADN satélite
• Más 1 x 106
copias/genoma,
• Unidades de
repetición cortas
aprox. 100pb.
• Sin función
conocida.
• Organizados en
tandem

29. Secuencias Repetidas Invertidas

30. Formación de Tallo-Rulo
(Stem-loops)

31. Complejidad de Secuencia no
es lo mismo que longitud.
• Complejidad es el número de pares de bases de
una secuencia de ADN única no repetida.
• Ejemplo:. considere ADN de 1000 pb.
• 500 pb: secuencia a, presente en copia única.
• 500 pb secuencia b (100 bp) repetida 5X
a b b b b b
|___________|__|__|__|__|__|
L = longitud = 1000 pb = a + 5b
N = complejidad = 600 pb = a + b

32. ADN menos complejo reasocia
más rápido
Sea a, b, ... z una cadena de pares de bases en un ADN que puede hibridar.
Para simplificar,asignaremos 10 pb por letra.
ADN 1 = ab. Muy baja complejidad de secuencia, 2 letras o 20 bp.
ADN 2 = cdefghijklmnopqrstuv. 10 veces más complejo (20 letras o 200 pb).
ADN 3 =
izyajczkblqfreighttrainrunninsofastelizabethcottonqwftzxvbifyoudontbelieveiml
eavingyoujustcountthedaysimgonerxcvwpowentdowntothecrossroadstriedtoc
atchariderobertjohnsonpzvmwcomeonhomeintomykitchentrad.
100 veces más complejo (200 letras o 2000 pb).

33. ADN menos complejo reasocia
ADN 1
más rápido ADN 3
ADN 2
ab ab ab ab ab
ab ab ab ab ab cdefghijklmnopqrstuv
ab ab ab ab ab cdefghijklmnopqrstuv
ab ab ab ab ab
cdefghijklmnopqrstuv
ab ab ab ab ab
cdefghijklmnopqrstuv
ab ab ab ab ab
ab ab ab ab ab
ab ab ab ab ab
etc.
izyajczkblqfreighttrainrunninsofastelizabethcottonqwf
tzxvbifyoudontbelieveimleavingyoujustcountthedaysi
mgonerxcvwpowentdowntothecrossroadstriedtocatch
Para una igual masa/vol: ariderobertjohnsonpzvmwcomeonhomeintomykitche
ntrad
Concentración Molar de cada secuencia:
150 microM 15 microM 1.5 microM
Velocidad relativa de Reasociación
100 10 1

34. Cinética de Reasociación es una
Reacción de 2ndo orden.
nucleación “zippering”
+
2ndo 1er
orden orden
lento ,rápido
ADN desnaturalizado Un pequeño ADN reasociado
dos cadenas separadas duplex se forma en (2 cadenas en duplex)
una región
complementaria

35. Ecuaciones que describen la
Reasociación
Sea C = concentración de ADN monocatenario a tiempo t
(expresado como moles de nucleotidos por litro).
La velocidad de desaparición de ADN monocadenas(mc)
durante la reasociación está dada por la ecuación de 2do orden
− dC dC
= kC 2 or 2
= −kdt
dt C
Resolviendo la ecuación diferencial tendremos:
C 1
=
C 0 1 + kC 0 t

36. El tiempo requerido para alcanzar el 50% de
reasociación es inversamente proporcional a la
constante de velocidad de la reacción
C 1
=
C 0 1 + kC 0 t
Reasociación 1/2, C
= 0.5, and t = t 1/ 2
C0
1
C 0 t1 / 2 =
k
k en litros (mole nt)-1 seg-1

37. Constante de Velocidad es Inversamente
Proporcional a la complejidad de
secuencia
L L = longitudh; N = complejidad
k α
N
Empiricamente, la constante de velocidad k es medida como:
5 L
k = 3 × 10
N
En 1.0 M Na+ a T = Tm - 25oC

38. El Tiempo requerido para la Reasociación 1/2 es
directamente proporcional a la complejidad de
secuencia.
N
C0 t 12 α (4)
L
Para una medida de reasociación, normalmente se rompe el
ADN hasta una longitud de fragmentos cosntante L (v.g. 400 bp).
Entonces Lno es más variable y
C0 t 1 2 α N (5)
N
desconocido C0 t 12desconocido
standard
= standard
(6)
N C0 t 12
V.g. E. coli N = 4.639 x 106 pb

39. El Tiempo de Reasociación es Proporcional a la Complexidad del genoma
Tamaño
1 10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010
del genoma
0
Fracción reasociada
Poli U/ Satélite MS2 T4 E. coli Vaca
0.5 Poli A De ratón
1.0
10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 10 100 1K 10K
c0t (mole/L • segc)
Tiempo creciente de reasociación

40. Secuencias Repetidas Agrupadas
Idiograma de
Cromosomas Humanos
Con bandeo-G
Repeticiones en
Tandem sobre
todos los cromosomas:
Telomeros
Centromeros
5 clusters de repeticiones de genes de ARNr:
Brazos cortos (p) de cromsomas: 13, 14, 15, 21, 22

41. Hibridación de Acidos Nucleicos:
Herramientas experimentales
• Hibridación “in situ”.
• Hibridación en solución:
– Homóloga
– Heteróloga
– PCR
Hibridación sobre membrana:
Southern
Northern
Wstern
Dot-Blot
Hibridación sobre DNA-Chips (Microarrays)

42. Hibridación de Acidos Nucleicos
ADN1 ADN2
Sonda
ARN o
Primer
Hibridación
Southern
PCR
Hibridación Hibridación en
Northern
Solución

43. Fin