Este documento describe un estudio que evalúa el medio de cultivo celular BrainPhys® para cultivar neuronas primarias de ratón y estudiar el daño axonal después de una lesión por estiramiento mecánico in vitro. Los autores muestran que BrainPhys® mejora los niveles de neurofilamentos en los cultivos neuronales y facilita la investigación del daño axonal después de una lesión, en comparación con el medio estándar Neurobasal®. El estudio proporciona una valiosa herramienta para investigar los mecanismos del da

1. BrainPhys® aumenta los niveles de neurofilamentos en cultivos del SNC y
facilita la investigación del daño axonal después de una lesión por
estiramiento mecánico in vitro
Travis C. Jackson , 1, 2
Shawn E. Kotermanski , 3
Edwin K. Jackson , 3
y Patrick M. Kochanek 1, 2
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Datos asociados
Materiales complementarios
Resumen
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1. INTRODUCCIÓN
El medio de cultivo celular se usa ampliamente para estudiar neuronas in vitro . Comúnmente se emplean
diferentes formulaciones como Neurobasal® o DMEM, más diferentes tipos de suplementos que se agregan con
frecuencia a esos medios, e influyen en variables experimentales como el crecimiento de células CNS / neuritas
y la viabilidad a largo plazo ( Brewer et al., 1993 ; Geranmayeh et al. ., 2015 ; Harrill et al., 2015 ; Hogins et al.,
2011 ; Marx, 2013 ; Ren et al., 2007 ; Shin et al., 2006 ; Thomson et al., 2006 ; Ye y Sontheimer, 1998 ).
BrainPhys® es un avance reciente en medios de cultivo celular para el crecimiento de neuronas. Es una nueva
formulación que mejora las propiedades electrofisiológicas en las neuronas, comparable en eficacia al líquido
cefalorraquídeo artificial (aCSF), y también mantiene la viabilidad a largo plazo (a diferencia del aCSF que
conserva la viabilidad solo por un corto tiempo) ( Bardy et al., 2015 ) Para obtener una lista química y una
comparación de las cantidades de ingredientes neuroactivos en BrainPhys® versus el estándar de oro
Neurobasal®, se dirige al lector a los datos complementarios que acompañan al informe seminal de Bardy y
colegas ( Bardy et al., 2015) Hasta donde sabemos, no se ha evaluado la utilidad de BrainPhys® para el estudio
de la muerte neuronal en cultivos primarios de roedores del SNC, específicamente en el contexto de un trauma
mecánico.
La lesión cerebral traumática leve / conmoción cerebral (mTBI) es el diagnóstico más común de TBI y
representa ~ 80-90% de todos los casos ( Blennow et al., 2016 ; Kraus y Nourjah, 1988 ). En la mayoría de los
pacientes, los síntomas neurológicos se resuelven dentro de las dos semanas posteriores a la lesión ( McClincy
et al., 2006 ). Sin embargo, ~ 10-15% de los pacientes con mTBI tienen deficiencias neurológicas persistentes
que duran meses después del insulto y posteriormente son diagnosticados con síndrome post-conmoción
cerebral (PCS) ( Silverberg e Iverson, 2011 ). Identificar los cambios bioquímicos, de señalización celular y
neuropatológicos causados por mTBI / PCS puede ayudar en el desarrollo de tratamientos para acelerar la
recuperación.
En adultos, no se cree que un solo mTBI cause niveles significativos de muerte neuronal manifiesta ( Bigler,
2004 ; Bolton Hall et al., 2016 ; DeFord et al., 2002 ; Povlishock et al., 1983 ). La lesión axonal es la
característica neuropatológica principal y se correlaciona con la manifestación de síntomas neurológicos ( Mac
Donald et al., 2011 ; Wright et al., 2016 ). Sin embargo, el mTBI repetitivo, que exacerba el daño a la sustancia
blanca, puede causar la muerte neuronal, particularmente en pacientes vulnerables como los bebés ( Goddeyne
et al., 2015 ; Huh et al., 2007) El diagnóstico de un mTBI no complicado generalmente se determina por

2. hallazgos positivos en la evaluación neurológica pero hallazgos negativos en la tomografía computarizada
craneal. El desarrollo clínico de biomarcadores de lesiones axonales en LCR / plasma como la cadena ligera de
neurofilamentos (NF-L) y la Tau total (liberada de los axones dañados) puede resultar útil para respaldar un
diagnóstico de mTBI ( Zetterberg et al., 2013 ). NF-Len particular ha ganado considerable interés debido a su
sensibilidad para detectar daños sutiles de axones mielinizados de gran calibre en atletas con conmoción
cerebral ( Neselius et al., 2012 ).
Los modelos in vitro de lesión por estiramiento mecánico se usan ampliamente para estudiar los mecanismos de
señalización activados / alterados por trauma en neuronas, astrocitos y en otras células del SNC ( Ahmed et al.,
2000 ; Ahmed et al., 2002 ; Ellis et al., 1995 ; Ellis et al., 2007 ; Goforth et al., 1999 ; McKinney et al.,
1996 ; Neary et al., 2003 ; Tavalin et al., 1995 , 1997 ; Weber et al., 2001 ; Zhang et al. , 1996 ). El controlador
de lesión celular (CIC) es un dispositivo de lesión por estiramiento disponible en el mercado, impulsado por
gas, desarrollado por Ellis et al. (1995), y posteriormente utilizado en numerosos estudios para evaluar los
efectos del trauma mecánico en las células del SNC ( Ellis et al., 1995) Aquí utilizamos el conocido sistema de
lesiones CIC-II para administrar una lesión por estiramiento (estiramiento biaxial de 50 ms / ~ 54%) a las
neuronas cultivadas en BrainPhys®. También realizamos una comparación exhaustiva de proteínas de
señalización celular en BrainPhys® versus Neurobasal® en neuronas no lesionadas, así como en neuronas
estiradas, para caracterizar las posibles diferencias en los sistemas de cultivo. Mostramos que BrainPhys®
mejora el estudio de los cambios inducidos por lesiones en los neurofilamentos axonales, que pueden ser útiles
para (1) detectar nuevos anticuerpos para el desarrollo de biomarcadores, (2) probar terapias de rescate
específicas de axones e (3) investigar nuevos mecanismos de señalización celular, como el motivo de unión al
ARN de la proteína pro-muerte 5 (RBM5) que se exploró más a fondo aquí, que pueden contribuir a la muerte
neuronal / axonal en el contexto de un trauma.
Ir:
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Productos químicos y reactivos
ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE. UU.): Neurobasal®, suplemento B27, Opti-MEM ™ , solución
salina equilibrada de Hanks (HBSS), PBS suplementado con magnesio y cloruro, L-Glutamina, Penicilina-
Estreptomicina, ProLong® Gold Antifade Mountant con DAPI ; SIGMA (St. Louis, MO, EE. UU.): Albúmina
de suero bovino, suero de cabra normal, ácido glutámico, bicarbonato de sodio, HEPES, ADNasa bovina
I; Corning (Corning, Nueva York, EE. UU.): Matrigel Basement Membrane Matrix Phenol Red Free ™ , Cell
Recovery Solution®; Tecnologías STEMCELL (Cambridge, MA, EE. UU.): Neurocult®, BrainPhys®,
suplemento SM1. Anticuerpos primarios:Conejo policlonal anti-malondialdehído (Cat # ab6463, Lot #
GR110035-6). ANTICUERPOS ATLAS (Estocolmo, Suecia): Anti-RBM5 policlonal de conejo (n.º de catálogo
HPA018011, n.º de loteR07119 ), conejo policlonal anti-RBM10 Cat # HPA034972, lote # R32333 ); ENZO
Life Sciences (Farmingdale, NY, EE. UU.): Mouse Monoclonal Anti-α-Fodrin / αII-Spectrin (Cat # BML-
FG6090). TREVIGEN (Gaithersburg, MD, EE. UU.): Anti-poli policlonal de conejo (ADP-ribosa) (PAR) (Cat
# 4336-APC-050, Lote # 22670C11), ANTICUERPOS SECUNDARIOS: (ThermoFisher Scientific) IgG anti-
conejo de cabra (H + L) Conjugado con HRP y Absorbido Cruzado (Cat # G21234 ), IgG Anti-Ratón de Cabra
(H + L) Conjugado con HRP y Absorbido Cruzado (Cat # G21040 ), IgG Anti-Conejo de Cabra (H + L)
Absorbido Cruzado Y Alexa Fluor 594 Conjugado (Cat # A11037 ), Absorbido de IgG de Cabra Anti-Ratón (H
+ L) y Alexa Fluor 488 Conjugado (Cat # A11029 ).
2.2 animales
Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la
Universidad de Pittsburgh. Los protocolos de eutanasia siguen las recomendaciones establecidas por las Pautas
de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria para la eutanasia. Se tomaron todas las medidas para
prevenir el sufrimiento de los animales y para utilizar el número mínimo de sujetos necesarios para la

3. significación estadística y el análisis. Las ratas Sprague Dawley (SD) embarazadas y los ratones C57BL / 6
preñados se compraron de Charles River (Wilmington, MA, EE. UU.). Las ratas y los ratones fueron alojados
en una instalación de la Universidad de Pittsburgh administrada por la División de Recursos de Animales de
Laboratorio. Los roedores tuvieron acceso a alimentos / agua ad libitum y se mantuvieron en un ciclo de luz /
oscuridad de 12 h. Los embriones (~ E15-19) se recolectaron de represas sacrificadas y tejido cerebral cortical
recolectado para el cultivo de neuronas.
2.3 Cultivo primario de neuronas
En resumen, se recogieron mitades corticales de género mixto de ~ E16-17 cerebros embrionarios bajo un
microscopio de luz de disección (Leica; Buffalo Grove, IL, EE. UU.). El tejido cosechado se mantuvo en hielo
en HBSS suplementado con bicarbonato de sodio (10 mM), HEPES (15 mM) y penicilina-estreptomicina (100
unidades / ml). Las mitades corticales se disociaron por cizallamiento mecánico utilizando tijeras estériles (~ 1
min) en un tubo de 1,5 ml. Luego, las células se tripsinizaron durante ~ 8 min en un baño de agua a 37 ° C, se
enfriaron, se centrifugaron (4 ° C / 200 g / 5 min) y se resuspendieron en solución de trituración (10 mg / ml de
DNasa disuelta en Neurobasal® / B27). Las células se dispersaron adicionalmente por ~ 10 pases a través de
una pipeta Pasteur de vidrio pulido al fuego. Las células progenitoras corticales se centrifugaron, se
resuspendieron en medios de recubrimiento (véase más adelante) y se sembraron en placas BioFlex Silastic
(Flexcell International Corp .; Burlington, NC,6 / pozo. En estudios piloto, usando Neruobasal® / B27 (pH ~
7.5–7.6 y suplementado con ácido glutámico 25 μM, L-glutamina 0.5 mM y penicilina-estreptomicina 100 mU /
mL según las instrucciones de fabricación), probamos varias condiciones de recubrimiento de placas,
incluyendo polietileno. D-lisina, laminina, colágeno y matrigel en membranas silásticas. Solo Matrigel mejoró
la adherencia a las placas Silastic en nuestras manos.
Neurocult® / SM1 y Neurobasal® / B27 también se complementaron con ácido glutámico 25 μM y L-glutamina
0,5 mM. Los detalles relacionados con la preparación de las placas son los siguientes: las reservas de Matrigel
congeladas se descongelaron durante la noche a 4 ° C. ~ 1 h antes de la siembra de células, se diluyó Matrigel
0,5 mg / ml (agitado por vórtice ~ 20 s) en medio Opti-MEM helado y se aplicó inmediatamente 1 ml / pocillo
(mecido a mano bajo una campana de flujo laminar) para garantizar un recubrimiento uniforme Toda la
superficie silástica. Las placas se incubaron en 37 ° C / 5% de CO 2incubadora por ~ 1h. Las células
progenitoras neuronales (resuspendidas en Neurocult® / SM1 o Neurobasal® / B27) se contaron en un
Cellometer (Nexcelom Bioscience; Lawrence, MA, EE. UU.). Las placas BioFlex se retiraron de la incubadora
justo antes de la siembra celular. Opti-MEM se aspiró rápidamente por succión al vacío con pipetas de vidrio
estériles y se tuvo cuidado de no tocar la superficie de la membrana. Se añadieron 1,5 x 106 células a cada pocillo
en 2 ml de medio de recubrimiento. Las placas se balancearon suavemente de lado a lado varias veces para
garantizar una distribución uniforme de las células a través de la superficie de la membrana. Las placas se
devolvieron a 37 ° C / 5% de CO 2incubadora y se dejó sin molestias durante 5 días. El día in vitro (DIV) 5 y 8,
los pozos recibieron ½ intercambio de medios (1 ml) con BrainPhys® / SM1 o Neurobasal® / B27; Las
instrucciones del proveedor indican que el primer intercambio de medios (después de colocar en placas en
Neurocult®) está en DIV5 con BrainPhys®, para promover una actividad sináptica saludable en las neuronas
primarias. Durante los intercambios de medios, las placas se retiraron de la incubadora y se colocaron en una
superficie plana debajo de la campana de flujo laminar (es decir, no inclinadas para evitar la exposición parcial
de las neuronas monocapa al aire). Se aspiró cuidadosamente 1 ml usando una punta de pipeta de 1 ml y se
reemplazó con BrainPhys® o Neurobasal®; Se añadieron medios frescos suavemente / despacio dispensándolos
hacia abajo a lo largo de la pared de la placa. Para estudios de lesiones, 750 μL de medio acondicionado (100%
CM ) se recogió en DIV9 de cada pocillo y se mezcló con un volumen igual de BrainPhys® / SM1 o
Neurobasal® / B27 fresco (es decir, para generar 50% de CM). El medio restante en cada pocillo se aspiró y se
reemplazó con 1 ml de CM al 50%. Esto se realizó para (1) diluir aún más los niveles bajos restantes de
Neurocult de tal manera que las lesiones se realizaron principalmente en condiciones de BrainPhys®, y (2) para
corregir para posibles diferencias intrapocillos en los volúmenes de medios finales en DIV9 causados por una
pérdida de evaporación desigual entre los días de cultivo que de otra manera podrían afectar la precisión del
análisis de LDH

4. 2.4 Lesión mecánica por estiramiento
Las placas BioFlex recibieron un estiramiento mecánico inducido por nitrógeno-gas utilizando el dispositivo
Cell Injury Controller-II (Custom Design & Fabrication Inc .; Sandston, VA, EE. UU.) Y se devolvieron a 37 °
C / 5% de CO 2 . El nivel de lesión se estableció en un estiramiento biaxial de 50 ms / 38% o en un estiramiento
biaxial de 50 ms / 54%. El% de estiramiento de la membrana está directamente relacionado con la presión
máxima del pozo (psi) alcanzada, que se registra mediante un transductor de presión conectado al dispositivo
CIC y se regula ajustando la presión de la fuente (es decir, la explosión de nitrógeno). Una presión máxima en
el pozo de 2.7 psi induce un 38% de estiramiento biaxial. Una presión máxima de pozo de 4.0 psi induce un
54% de estiramiento biaxial. Cuadro complementario 1–6muestra las presiones máximas de pozo logradas en
todos los experimentos. Los controles recibieron un ajuste de medios de 1 ml (es decir, 50% CM) pero no
resultaron heridos. En experimentos con lentivirus, el medio CM al 50% se preparó por separado para el vector
de control vacío frente al vector de sobreexpresión RBM5; esto se realizó para (1) tener en cuenta los factores
solubles desconocidos debido al genotipo que pueden afectar el resultado de la lesión (por ejemplo, la
sobreexpresión de RBM5 aumenta la expresión de TNF-α en las células cancerosas ( Wang et al., 2012 )) y (2)
para posibles diferencias en los niveles de LDH basales no lesionados necesarios para calcular con precisión
el% de citotoxicidad.
Los métodos descritos por Bardy C. et al., Y los protocolos de preparación de medios proporcionados por
STEMCELL Technologies Inc., sugirieron la ausencia de antibióticos de penicilina-estreptomicina en
BrainPhys®, lo que puede alterar la electrofisiología normal de las neuronas in vitro ( Bahrami y Janahmadi,
2013) Por lo tanto, tampoco incluimos penicilina-estreptomicina en medio Neurocult® / SM1 o BrainPhys® /
SM1. Se tomaron varias precauciones para mantener la esterilidad. Primero, establecimos el dispositivo CIC
dentro de una campana de flujo laminar. Por lo tanto, todas las lesiones se realizaron en condiciones
estériles. En segundo lugar, limitamos el examen de las células (para una visualización rápida) usando un
microscopio óptico hasta justo después del punto de tiempo de 24 horas después de la lesión (antes de la
recolección de muestras en DIV10). Las placas BioFlex están diseñadas de modo que la membrana Silastic esté
ligeramente elevada por encima de la base de la placa de plástico de 6 pocillos, lo que dificulta la observación
de las células utilizando un microscopio de luz invertido estándar. La alternativa es usar un microscopio óptico
vertical (usando el objetivo 10X) y bajar cuidadosamente el objetivo dentro del pozo (desde arriba) hasta que
las células estén enfocadas. Este método de observación de células conlleva un mayor riesgo de contaminación
del cultivo porque la tapa de la placa protectora debe retirarse y porque la lente / objetivo no estéril está
precariamente cerca de la superficie del medio de cultivo. Por estas razones, las células no se visualizaron
durante el cultivo hasta justo antes de la recolección de la muestra. Utilizando el protocolo anterior como
práctica estándar para cada experimento, observamos cultivos altamente consistentes (saludables / viables /
morfológicamente similares) en todos los experimentos.
2.5 Análisis de LDH
El análisis de LDH se realizó como informamos ( Jackson et al., 2013 ). En resumen, a las ~ 24 h después de la
lesión, se retiraron las placas de la incubadora y se añadieron 100 μl de tampón de lisis celular a un control no
dañado (es decir, un pocillo por placa o por genotipo de virus). El tampón de lisis se aspiró arriba / abajo 10
veces y las placas volvieron a 37 ° C / 5% de CO2 .incubadora por 10 min. Las placas se colocaron
inmediatamente en hielo. Se recogieron 400 μl de medio de cultivo (por pocillo) para cada afección (es decir,
control sin lesiones, control lisado sin lesiones o lesionado) y se transfirieron a un tubo de 1,5 ml. Las muestras
se almacenaron a -80 ° C hasta el análisis aguas abajo. Las muestras descongeladas se centrifugaron a 15 min /
4 ° C / 16,000 g. La liberación de LDH se midió usando el Kit de ensayo de citotoxicidad LDH II (Abcam) y se
analizó en un lector de microplacas GloMax-Multi (PROMEGA; Madison, WI, EE. UU.). Las muestras
individuales se procesaron por duplicado (10 μL / pocillo). El control negativo fue 50% de medio CM
preparado en DIV9. El% de citotoxicidad se calculó mediante la fórmula = (Muestra LDH - Control negativo) /
(Max LDH - Control negativo) × 100.

5. 2.6 Estimulación química de la actividad sináptica
Se sembraron neuronas corticales primarias de rata en placas de 6 pocillos de poliestireno recubiertas con P D L
y se mantuvieron en Neurobasal® / B27 o Neurocult / SM1 durante 5 días. En DIV5 y DIV8, los cultivos
recibieron ½ intercambio de medios con Neurobasal® / B27 o BrainPhys® / SM1, respectivamente. En DIV9,
los medios acondicionados se aspiraron y se reemplazaron con 1 ml de Neurobasal® / B27 100% fresco
precalentado (37 ° C) o BrainPhys® / SM1 que contenía vehículo (agua / DMSO) o medicamentos (1 mM 4-AP
+ bicuculina 25 μM) . Se aplicaron tratamientos experimentales o de vehículos durante 15 minutos. Las células
se lavaron con PBS enfriado con hielo, se homogeneizaron inmediatamente en tampón RIPA (con inhibidores
de proteasa / fosfatasa) y se analizaron las pERK mediante transferencia Western para evaluar el grado de
activación sináptica de NMDAR.
Se realizaron experimentos complementarios independientes para examinar el efecto del medio sobre la
activación de ERK inducida por 4AP / bicuculina en cultivos envejecidos, tanto en neuronas de rata como de
ratón. Las neuronas corticales primarias de ratón o rata DIV19-20 se cultivaron en Neurobasal® / B27,
en placas de 6 pocillos de poliestireno recubiertas con P D L, o se cultivaron en placas BrainPhys® / SM1
en placas de 6 pocillos recubiertas con laminina / poli- L -ornitina. En el día respectivo de experimentación, se
trataron cultivos mixtos de neuronas / glía durante 15 minutos con vehículo (agua / DMSO) o 1 mM 4-AP / 25
μM. Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo, se homogeneizaron en tampón RIPA y los niveles de
pERK se analizaron mediante transferencia Western.
2.7 Western Blot
Las transferencias de Western se realizaron según lo informado pero con modificaciones menores ( Jackson et
al., 2015) Matrigel se eliminó antes de homogeneizar las células. Las placas permanecieron en hielo durante
todo el procedimiento. El resto de los medios se aspiró (es decir, inmediatamente después de recoger /
almacenar los medios para el análisis de LDH). Las células se lavaron rápidamente una vez con 2 ml / pocillo
de PBS helado (suplementado con magnesio y calcio). Se eliminó el PBS y se reemplazó con 1 ml de Cell
Recovery Solution® enfriada con hielo y se incubó (en hielo) durante 15 minutos. Las células se rascaron
suavemente de las membranas silásticas y se transfirieron a un tubo de 1,5 ml. Se añadió 400 μL de Cell
Recovery Solution® adicional a cada pocillo y las células restantes se rasparon cuidadosamente y se agregaron
a 1 ml correspondiente (es decir, para una solución / pocillo de recuperación final de 1,4 ml en un tubo de 1,5
ml). Las células recibieron 45 minutos adicionales en hielo (es decir, 1 hora en total). Los tubos se invirtieron 2-
3 veces y posteriormente se centrifugaron durante 5 min / 4 ° C / 200 g. La solución de recuperación se retiró
cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento celular. Se añadió 1 ml de PBS helado (+ magnesio / +
calcio) al sedimento. Los tubos se invirtieron 2-3 veces y posteriormente se centrifugaron durante 5 min / 4 ° C /
200 g. El PBS se eliminó cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento celular. Se añadieron 65 μL de
tampón RIPA (suplementado con EDTA e inhibidores de proteasa / fosfatasa) a los sedimentos celulares y se
mezcló pipeteando arriba / abajo ~ 10 veces. Las muestras se almacenaron a -80 ° C. En preparación para el
análisis de BCA, las muestras se descongelaron en hielo, se sonicaron ~ 20 s y se centrifugaron 15 min / 4 ° C /
16,000 g. Las concentraciones de proteínas se midieron por BCA como se describió anteriormente. Se añadió 1
ml de PBS helado (+ magnesio / + calcio) al sedimento. Los tubos se invirtieron 2-3 veces y posteriormente se
centrifugaron durante 5 min / 4 ° C / 200 g. El PBS se eliminó cuidadosamente y se desechó sin alterar el
sedimento celular. Se añadieron 65 μL de tampón RIPA (suplementado con EDTA e inhibidores de proteasa /
fosfatasa) a los sedimentos celulares y se mezcló pipeteando arriba / abajo ~ 10 veces. Las muestras se
almacenaron a -80 ° C. En preparación para el análisis de BCA, las muestras se descongelaron en hielo, se
sonicaron ~ 20 s y se centrifugaron 15 min / 4 ° C / 16,000 g. Las concentraciones de proteínas se midieron por
BCA como se describió anteriormente. Se añadió 1 ml de PBS helado (+ magnesio / + calcio) al sedimento. Los
tubos se invirtieron 2-3 veces y posteriormente se centrifugaron durante 5 min / 4 ° C / 200 g. El PBS se eliminó
cuidadosamente y se desechó sin alterar el sedimento celular. Se añadieron 65 μL de tampón RIPA
(suplementado con EDTA e inhibidores de proteasa / fosfatasa) a los sedimentos celulares y se mezcló
pipeteando arriba / abajo ~ 10 veces. Las muestras se almacenaron a -80 ° C. En preparación para el análisis de
BCA, las muestras se descongelaron en hielo, se sonicaron ~ 20 s y se centrifugaron 15 min / 4 ° C / 16,000

6. g. Las concentraciones de proteínas se midieron por BCA como se describió anteriormente. Se añadieron 65 μL
de tampón RIPA (suplementado con EDTA e inhibidores de proteasa / fosfatasa) a los sedimentos celulares y se
mezcló pipeteando arriba / abajo ~ 10 veces. Las muestras se almacenaron a -80 ° C. En preparación para el
análisis de BCA, las muestras se descongelaron en hielo, se sonicaron ~ 20 s y se centrifugaron 15 min / 4 ° C /
16,000 g. Las concentraciones de proteínas se midieron por BCA como se describió anteriormente. Se
añadieron 65 μL de tampón RIPA (suplementado con EDTA e inhibidores de proteasa / fosfatasa) a los
sedimentos celulares y se mezcló pipeteando arriba / abajo ~ 10 veces. Las muestras se almacenaron a -80 °
C. En preparación para el análisis de BCA, las muestras se descongelaron en hielo, se sonicaron ~ 20 s y se
centrifugaron 15 min / 4 ° C / 16,000 g. Las concentraciones de proteínas se midieron por BCA como se
describió anteriormente.
Se cargaron 10-20 μg / pocillo de extracto de proteína en geles prefabricados TGX (BioRad; Hercules, CA, EE.
UU.). Las muestras se corrieron a 120V. Las proteínas sometidas a electroforesis se transfirieron a membrana
de PVDF Hybond P 0.2 (GE Healthcare Life Sciences; Pittsburgh, PA, EE. UU.). En estudios que requieren
tinción de membrana total, los PVDF se incubaron en metanol al 100% durante 30 segundos, se tiñeron con
tinción reversible de membrana Swift (Fisher Scientific), las imágenes se recogieron en un escáner de superficie
plana, las membranas se tiñeron durante ~ 2-3 minutos y se lavaron 5 minutos en TBS . Las membranas se
bloquearon durante 1 hora en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía Tween-20 (TBS-T) y
7,5% de leche de grado de transferencia. Los anticuerpos primarios se diluyeron en TBS-T / leche y se
incubaron en borrones durante la noche en un balancín a 4 ° C. Las membranas se lavaron tres veces con TBS
(5 min por lavado), se incubaron 2 h con anticuerpo secundario, se lavaron tres veces más en TBS, se incubó 1,5
minutos en reactivo de detección de ECL (ThermoFisher Scientific), y las manchas se expusieron a película en
una habitación oscura. Las películas se capturaron en un escáner de superficie plana de 600 ppp y se cumplieron
en Photoshop (Adobe; San José, CA, EE. UU.).
2.8 Lentivirus de alto título
El trabajo BSL-2 fue aprobado por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Pittsburgh. Los
plásmidos de expresión de lentivirus se adquirieron de Origene (Rockville, MD, EE. UU.). Utilizamos el
plásmido pLenti-C-Myc-DDK (Vector de control vacío, Cat # PS100064) y el plásmido pLenti-C-Myc-DDK-
RBM5_ORF (Cat # RR213857L1) para sobreexpresar RBM5 de rata. Los plásmidos de empaque también se
compraron de Origene (Cat # TR3002P5). En resumen, los plásmidos de expresión se amplificaron utilizando
un kit Maxiprep (QIAGEN; Germantown, MD, EE. UU.) Para obtener ADN plasmídico de alta calidad y las
concentraciones se analizaron en un Genova Nano (JENWAY; Staffordshire, Reino Unido). Las células
HEK293Ta (Genecopoeia; Rockville, MD, EUA) se propagaron en matraces T225. A ~ 75-80% de confluencia,
las células se transfectaron con plásmidos de expresión y plásmidos de relleno durante ~ 12 h, utilizando
reactivo de transfección MegaTran diluido en Opti-MEM / FBS al 10% / penicilina-estreptomicina. Se
recogieron medios que contenían virus ~ 36 h y ~ 48 h después de la transfección. El medio se pasó a través de
un filtro Nalgene de 0,45 μM, se concentró a través de una unidad de filtro Centricon Plus-70 y se
ultracentrifugó durante 1,5 h / 4 ° C / 24,000 rpm en un ultra rotor de cubeta oscilante (SW28) (Beckman-
Coulter; Indianapolis, IN) , ESTADOS UNIDOS). El sedimento viral se resuspendió en ~ 200 μl de Opti-MEM
estéril. El título del virus se calculó midiendo los niveles de p24 asociados con virus usando el QuickTiter El
sedimento viral se resuspendió en ~ 200 μl de Opti-MEM estéril. El título del virus se calculó midiendo los
niveles de p24 asociados con virus usando el QuickTiter El sedimento viral se resuspendió en ~ 200 μl de Opti-
MEM estéril. El título del virus se calculó midiendo los niveles de p24 asociados con virus usando el
QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit (Cell Biolabs Inc; San Diego, CA, EE. UU.). Las neuronas se transdujeron a
una multiplicidad de infección (MOI) 30 o 60 en el momento de la siembra (DIV0).
2.9 Inmunofluorescencia
DIV6 o 10 neuronas se colocaron en hielo. Los medios de cultivo celular se descartaron y las células se lavaron
con PBS helado (+ magnesio / + calcio). Las células se fijaron inmediatamente con paraformaldehído al 4% y se

7. incubaron a temperatura ambiente bajo una campana de extracción química durante ~ 30 min. Las células se
lavaron una vez con PBS. En los experimentos de lesión por estiramiento DIV10, para cada placa de 6 pocillos,
se incubaron tres pocillos (una condición por pocillo - sin lesiones, un tramo, dos tramos) con Triton-X 100 al
0,1% diluido en PBS durante 15 minutos para permeabilizar las células, y el otros tres pozos (que también
abarcan las tres condiciones) se incubaron durante un tiempo igual en PBS simple (sin Triton-X 100 al
0,1%); Esto se hizo para probar si la permeabilización afectaba de manera negativa o positiva la detección de
anticuerpos de las proteínas del citoesqueleto axonal NFL y Tau en las superficies silásticas después de una
lesión por estiramiento. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon 1 h con suero de cabra
normal al 20% (NGS) / BSA al 1% en PBS, y se incubaron a 4 ° C durante la noche con anticuerpos primarios
en NGS / PBS al 3%. Las células se lavaron tres veces más en PBS y se incubaron 1,5 ha temperatura ambiente
con anticuerpos secundarios (1: 500) en NGS / PBS al 3%. Las células se lavaron tres veces más en PBS. El
PBS se eliminó un pocillo a la vez (en una habitación con poca luz), y toda la circunferencia de la membrana
Silastic se cortó rápidamente con un bisturí y se dejó caer sobre una base limpia de espuma de poliestireno
debajo. Una pequeña pieza cuadrada de ~ 1 cm × 1 cm de membrana Silastic se cortó cuidadosamente del
centro del disco. Usando pinzas, se colocaron piezas cuadradas de Silastic en un portaobjetos de microscopio y
una o dos gotas de Antifade Gold ProLong® con reactivo de montaje DAPI aplicado a la superficie superior
(frente a la celda). Este proceso se repitió hasta que cada portaobjetos contenía una pieza cuadrada de
membrana Silastic correspondiente a un control no dañado, un estiramiento y dos estiramientos (tomados de la
misma placa). Se colocó suavemente un cubreobjetos sobre los cuadrados Silastic y los portaobjetos sellaron
con esmalte transparente para uñas. Las imágenes fueron capturadas en un microscopio fluorescente Nikon
ECLIPSE Ts2R (Melville, NY, EE. UU.).Fig. 4 -6 tinción de anticuerpos espectáculo para células dado un paso
membrana permeabilización estándar (es decir células no permeabilizadas-tenía los mismos patrones de tinción,
pero general de la señal más débil). Las células también se permeabilizaron para estudios DIV6. Las imágenes
representativas muestran morfologías características en la circunferencia de los pozos.
Figura 4
Figura 6
2.10 Estadísticas
La densitometría de transferencia Western se analizó utilizando el software UN-SCAN-IT (Silk Scientific;
Orem, UT, EE. UU.). El análisis estadístico de los resultados de LDH y la densitometría de transferencia
Western se realizó en GraphPad Prism. Los datos se analizaron utilizando un ANOVA de 1 vía seguido por
Newman-Keuls post-hoc (para comparaciones de grupos múltiples) y por una prueba T no apareada (para
comparación de dos grupos). Los datos fueron significativos en p <.05. Los gráficos muestran la media + SEM.
Ir:
3. RESULTADOS
3.1 Comparación de las principales proteínas del SNC en neuronas primarias de rata mantenidas en
BrainPhys® versus medios neurobasales
Las neuronas corticales primarias de rata, recogidas en el mismo día de aislamiento, se cultivaron en placas de
poliestireno estándar de 6 pocillos recubiertas con Poli- D- Lisina (PDL) o Matrigel. Todos los grupos
recibieron programas de mantenimiento de medios idénticos a lo largo de los días de cultivo ( Fig. 1b ), y se
recolectaron en DIV10 para el análisis de transferencia Western ( Fig. 1a ; una tinción de membrana total
representativa muestra una carga de proteína / transferencia de membrana igual a través de los grupos). Los
homogeneizados se analizaron con anticuerpos para investigar: marcadores específicos de tipo celular ( Fig.
1c ), factores implicados en la neurotransmisión ( Fig. 1d ) y desarrollo axonal ( Fig. 1e ). Fig. 1fmuestra

8. ejemplos en la literatura de cada objetivo y su posible papel en el contexto de lesión cerebral traumática y / o
lesión neurológica (NeuN ( Mullen et al., 1992 ), GFAP ( Otani et al., 2006 ), GluN2B ( Ferrario et al.,
2013 ; Wang et al., 2011 ), GluR1 ( Goforth et al., 2011 ; Smith et al., 2016 ), CREB ( Shaywitz y Greenberg,
1999 ; Valor et al., 2010 ), NF-H ( Anderson et al. ., 2008 ), NF-L( Al Nimer et al., 2015 ; Bergman et al.,
2016 ; Shahim et al., 2016 ; Shahim et al., 2017 ), Tau ( Yang et al., 2017) y PP2A ( Cheng et al., 2015 ; Tan et
al., 2016 )).
Figura 1
Para confirmar en las neuronas corticales de ratas primarias que BrainPhys® / SM1 mejora la actividad
sináptica frente a Neurobasal® / B27, y en el punto de tiempo DIV9, las placas se trataron 15 minutos con un
bloqueador de canales de potasio (4AP) y un inhibidor de GABA A (Bicuculline), o control del vehículo y pERK
medido por Western blot ( Fig. 1G ). La estimulación de la actividad sináptica con 4AP / Bicuculline aumentó
de forma robusta el pERK en cultivos mantenidos por BrainPhys® / SM1 pero no en Neurobasal® / B27 ( Fig.
1G ). Los mismos resultados se observaron en neuronas corticales primarias de ratón envejecidas y en neuronas
de rata envejecidas ( Figura complementaria 2 ).
Las propiedades deformables de las membranas Silastic son ideales para estudiar el efecto de las fuerzas
mecánicas en las células, pero algunas células (como las neuronas) no se adhieren fuertemente al sustrato
Silastic ( Ahmed et al., 2000 ; Cavalcanti-Adam et al., 2002 ; Slemmer et al., 2002 ). En estudios piloto
probamos si varias condiciones de recubrimiento (por ejemplo, P D L estándar , Laminina, Colágeno o
Matrigel) mejoran la unión neuronal. La Fig. 2 muestra las mejores (es decir, Matrigel) y las peores condiciones
(es decir, P D L) en nuestras manos para aumentar la unión de las neuronas DIV6 a la membrana
Silastic. Neurobasal® / B27 mantiene las neuronas cultivadas en P DLa membrana Silastic tratada con L se
adhirió débilmente al sustrato y, por lo general, comenzó a desprenderse (en láminas grandes) después del
primer intercambio de medio ½ ( Fig. 2d-f ). Las neuronas mantenidas por Neurobasal® / B27 cultivadas en
membrana Silastic tratada con Matrigel han mejorado la unión y exhibieron preferentemente una morfología
escasa en forma de red de grupos de neuronas conectadas por axones largos ( Fig. 2g – i ). Se informa que ese
fenómeno ocurre para las neuronas cultivadas en la matriz Matrigel en comparación con otros sustratos de
recubrimiento y puede estar parcialmente mediado por laminina ( Sun et al., 2012 ) Neurocult® / BrainPhys® /
SM1 mantenidas neuronas cultivadas en la membrana Silastic tratada con Matrigel fuertemente adheridas a el
sustrato y desarrolló paquetes extensos de axones largos y cortos ( fig. 2j – l ).
Figura 2
3.2 Efecto de una lesión por estiramiento biaxial del 38% frente al 54% en cultivos mantenidos
BrainPhys®
Las neuronas corticales DIV9 recibieron una única lesión por estiramiento. Los niveles de LDH se analizaron
24 h más tarde. Los niveles de LDH fueron equivalentes en controles no lesionados versus cultivos sometidos a
una lesión por estiramiento del 38% ( Fig. 3a ). En contraste, los niveles de LDH de 24 h fueron
significativamente más altos en los cultivos que recibieron una lesión por estiramiento del 54% (~ 1.9% por
encima de los controles no lesionados); en particular, esto representa solo un aumento menor en LDH dado que
el% de citotoxicidad puede alcanzar un máximo de 100 (es decir, en el eje y), sin embargo, confirma que el
54% de lesión por estiramiento es suficiente para inducir daño celular en nuestras condiciones de cultivo.
Figura 3
Luego medimos los cambios en las proteínas asociadas con la lesión axonal. Específicamente nos centramos en
NF-L y Tau debido al gran interés clínico en estos objetivos como biomarcadores de lesiones. Una sola lesión
por estiramiento del 54% disminuyó de manera sólida los niveles de proteína NF-L, mientras que la proteína
abundante Tau no se vio afectada ( Fig. 3b y 3c ). También observamos disminuciones significativas en los
niveles de α-tubulina ( Fig. 3d ) y GAPDH ( Fig. 3e ) en los niveles de lesión por estiramiento de 38% y

9. 54%. Los hallazgos en la α-tubulina no son sorprendentes. La tubulina (α y β) son componentes principales del
citoesqueleto axonal ( Kevenaar y Hoogenraad, 2015 ). Además, los estudios in vivo muestran que la lesión
axonal mediada por mTBI en ratones conduce a niveles reducidos de tubulina en los nervios dañados (Tzekov et
al., 2016 ).
Los esfuerzos de caracterización adicionales en BrainPhys® mantuvieron cultivos enfocados en el nivel de
lesión por estiramiento del 54% porque inducía mayores cambios moleculares en comparación con los controles
no lesionados (específicamente con respecto a NF-L). Se examinaron los cambios histológicos en cultivos que
recibieron una lesión por estiramiento única versus aquellos que recibieron dos lesiones (en tándem y
administrados con 1 h de separación). Similar a los hallazgos observados previamente en los cultivos DIV6
( Fig. 2 ), las neuronas DIV10 se agruparon en grupos y se rodearon de axones densos ( Fig. 4a ; las flechas
blancas muestran la superposición de NeuN / DAPI). Las proyecciones axonales de gran calibre conectaban
grupos neuronales y tenían una fuerte tinción de NF-L + en controles no lesionados ( Fig. 4b) Una sola lesión
por estiramiento no afectó los grupos neuronales NeuN + (que permanecieron firmemente unidos a la
membrana Silatic) pero causó una pérdida severa de la tinción de NF-L( Fig. 4c y 4d ). Dos lesiones por
estiramiento parecieron aumentar la pérdida de axones NF-L + ( Fig. 4e y 4f ).
La tinción de Tau (como se vio anteriormente) reveló una masa de procesos axonales cortos y largos de alta
complejidad en cultivos DIV10 ( Fig. 5a ). La tinción de Tau también pareció mostrar una pérdida de señal en
relación con los controles no lesionados (particularmente en axones largos) después de una lesión por
estiramiento ( Fig. 5b y 5C ). Utilizamos el anticuerpo monoclonal Tau 46 que está bien caracterizado y su
especificidad objetivo ha sido confirmada en ratones Tau KO ( Petry et al., 2014 ).
Figura 5
En comparación con otras condiciones de recubrimiento ( Fig. 1c ), los niveles de GFAP fueron más altos en
BrainPhys® + Matrigel. Por lo tanto, también examinamos el efecto de la lesión por estiramiento en la
activación de astrocitos en condiciones de cultivo BrainPhys®. La tinción de GFAP fue relativamente
homogénea (expresión de baja a moderada) en astrocitos directamente adyacentes a grupos de neuronas y en
áreas más alejadas de los grupos de neuronas ( Fig. 6a ). La lesión por estiramiento aumentó notablemente la
intensidad de tinción de GFAP, particularmente en los astrocitos directamente adyacentes a los grupos de
neuronas ( Fig. 6b y 6c ). También observamos lo que parecían ser procesos astrocíticos del pie que contactaban
a algunos de los axones lesionados de gran calibre que se proyectaban entre grupos neuronales (Flechas
Blancas).
3.3 Estiramientos múltiples exacerban el daño en cultivos mantenidos BrainPhys®
La evaluación inmunohistológica de NF-L sugirió que las lesiones por estiramiento múltiple exacerban la lesión
axonal ( Fig. 4 ). Para cuantificar la disminución de los niveles de marcadores axonales en diferentes
condiciones de lesión, medimos los cambios de proteínas en NF-L y Tau por Western blot en cultivos
DIV10. Además, probamos si un retraso más largo entre la primera y la segunda lesión por estiramiento (es
decir, 1 hora frente a 4 horas frente a 8 horas) también afectó los resultados de muerte celular o los marcadores
de lesión axonal ( Fig. 7a ). La liberación de LDH a las 24 h en cultivos que recibieron dos lesiones aumentó
significativamente en relación con los controles no lesionados o en los cultivos que recibieron un solo
estiramiento ( Fig. 7b ). Utilizamos una tinción de membrana de PVDF reversible para mostrar una carga de
proteína igual en todos los grupos ( Fig. 7c) Luego, como un marcador adicional de daño celular (es decir,
además de LDH) medimos los productos de descomposición de la αII-Spectrin (SBDP), así como los
marcadores de lesión axonal, incluidos NF-L y Tau ( Fig. 7d ). Dos lesiones por estiramiento llevaron a un
aumento significativo en los niveles de SBDP de 24 h 145/150 kDa frente a los controles no lesionados ( Fig.
7e ). Además, como se esperaba, dos lesiones por estiramiento disminuyeron significativamente los niveles de
NF-L frente a los controles no lesionados, pero no difirieron de los cultivos que recibieron una sola lesión por
estiramiento ( Figura 7f ). Por el contrario, la tau disminuyó significativamente (frente a los controles no
lesionados) solo en cultivos que recibieron dos lesiones por estiramiento ( Fig. 7g ).

10. Figura 7
3.4 Neurobasal® / B27 exacerba los marcadores de daño en las neuronas lesionadas por
estiramiento
A continuación, comparamos el efecto de los medios sobre los resultados de 24 horas después de la lesión
después de un solo estiramiento de ~ 54%. Los extractos se recogieron de cultivos mantenidos por Neurobasal®
/ B27 o BrainPhys® / SM1 y se analizaron mediante transferencia Western. La carga de proteínas fue igual
entre los grupos ( Fig. 8A ). Los niveles de SBDP ( Fig. 8B y 8C ), MDA ( Fig. 8B y 8D) y pADPr ( Fig. 8B, 8E
y 8F ) aumentaron significativamente en los cultivos mantenidos con Neurobasal® / B27 lesionados frente a
BrainPhys® / SM1. Los niveles de caspasa-9 escindida (activa) no fueron significativamente diferentes entre los
grupos ( Fig. 8B y 8G ). La liberación de LDH a las 24 h aumentó significativamente en los cultivos mantenidos
con Neurobasal® / B27 lesionados frente a BrainPhys® / SM1.
Figura 8
3.5 Investigación de nuevos objetivos terapéuticos en cultivos de CNS mantenidos por BrainPhys®
Informamos que el factor de empalme nuclear RBM5, que es bien conocido por promover la muerte celular en
las células cancerosas, aumenta en las neuronas después de un TBI ( Jackson et al., 2015 ). No se ha informado
si los niveles elevados de RBM5 son directamente tóxicos en las células primarias del SNC. Primero
examinamos si los niveles endógenos de RBM5, o su paralogue RBM10 (que también aumenta después de un
TBI in vivo ( Jackson et al., 2015 )), aumentan los cultivos mantenidos por BrainPhys® después de una lesión
por estiramiento ( Fig. 9a ). Los niveles de RBM5 / RBM10 no aumentaron 24 h después de una lesión por
estiramiento mecánico, lo que contrasta con las observaciones después de una lesión cerebral traumática
grave in vivo ( Jackson et al., 2015 ).
Figura 9
Luego probamos si la sobreexpresión forzada de RBM5 aumentaba la vulnerabilidad de los cultivos del SNC a
un trauma mecánico posterior. Las neuronas se transdujeron en DIV0 (día de recubrimiento) con lentivirus
30MOI para administrar un control de vector vacío o un vector que contiene el marco de lectura abierto (ORF)
del gen RBM5 de rata (RBM5 ORF). RBM5 exógeno tiene una etiqueta DDK, detectada por anticuerpos anti-
FLAG, y utilizada para distinguir RBM5 endógeno frente a exógeno. Los niveles de RBM5 aumentaron
ligeramente a 30MOI en comparación con los controles de vectores vacíos ( Fig. 9b ). Un anticuerpo anti-FLAG
confirmó la presencia de RBM5 exógeno. Las sobreexpresiones RBM5 y las neuronas del vector de control
recibieron una única lesión por estiramiento del 54%. Las neuronas que sobreexpresan RBM5 habían
aumentado notablemente los niveles de SBDP ( Fig. 9b y 9c) y modestamente, aunque significativamente,
aumentaron los niveles de LDH ( Fig. 9d ) 24 horas después de la lesión. Los marcadores de daño axonal no se
vieron afectados por la sobreexpresión de RBM5 en cultivos lesionados ( Fig. 9e ). Finalmente, probamos si los
niveles más altos de RBM5 aumentaron aún más el daño después de una lesión por estiramiento. La
transducción de neuronas con lentivirus 60MOI condujo a un aumento de ~ 2 veces en los niveles de RBM5
frente a los controles de vectores vacíos ( Fig. 9f ). Tanto los niveles de SBDP de 24 h ( Fig. 9g ) como los
niveles de LDH ( Fig. 9h ) fueron significativamente más altos en las neuronas que sobreexpresan RBM5 de
lesión por estiramiento. Sin embargo, 60MOI no pareció aumentar aún más el nivel general de lesión (por
ejemplo, 24 h LDH) en relación con 30MOI.
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4. DISCUSIÓN
4.1 BrainPhys® + Matrigel facilita la investigación in vitro de lesiones neuronales y axonales

11. Aquí informamos que BrainPhys® facilita la investigación de neuronas / axones lesionados por estiramiento
cultivados en membranas Silastic in vitro . Además, demostramos la utilidad de los cultivos BrainPhys® +
Matrigel para experimentos de modificación génica para explorar las funciones de objetivos nuevos en el
contexto del trauma. Con respecto a la caracterización de los cambios moleculares antes y después de una lesión
por estiramiento en este sistema, varios hallazgos son notables. Primero, observamos fácilmente la tinción
robusta de NF-L en axones de "gran calibre" (también descritos como "fascículos gruesos tipo ropel" en
la literatura in vitro ( Kosik y Finch, 1987)) que une grupos de neuronas. No es sorprendente que los axones de
NF-L + se dañen fácilmente por estiramiento mecánico, reflejado por una pérdida robusta de tinción de NF-Ly
una marcada disminución en los niveles de proteína NF-L. En relación con los cultivos mantenidos en
Neurobasal® / B27 jóvenes estudiados aquí, que en comparación tienen niveles de NF-Lmucho más bajos en
DIV10 pero aún producen axones, el desarrollo axonal no se ve comprometido por la ausencia de NF-L. De
hecho, los ratones NF-L KO no tienen un fenotipo evidente en el desarrollo temprano, pero muestran un cambio
de axones de calibre grande a pequeño, y también tienen una marcada pérdida de los niveles de NF-H ( Zhu et
al., 1997 ), que también se observó en Cultivos de Neurobasal® / B27. Se necesitan estudios futuros para
determinar si la expresión robusta de NF-L en BrainPhys® / SM1 de alguna manera está relacionada con una
mayor actividad sináptica, particularmente porque los NF modulan la neurotransmisiónin vivo ( Yuan et al.,
2015 ).
La tinción de Tau en contraste se localiza tanto en "gran calibre" como en numerosos axones más pequeños. Los
niveles de Tau no disminuyeron después de una sola lesión por estiramiento del 54%, pero sí disminuyeron
después de múltiples estiramientos. También observamos una disminución reproducible en los niveles de α-
tubulina después de la lesión en cultivos mantenidos con BrainPhys® + Matrigel. La tubulina es un componente
importante del citoesqueleto del axón ( Kevenaar y Hoogenraad, 2015 ). Por lo tanto, la pérdida de α-Tubulina
después del estiramiento mecánico concuerda con los hallazgos sobre las reducciones de Tau / NF-L aquí, y
respalda la noción de que este sistema puede ser particularmente adecuado para la investigación de cambios
moleculares sutiles asociados con la lesión axonal.
4.2 Diferencias de proteínas en cultivos mantenidos BrainPhys® frente a Neurobasal®
Nos sorprendió la magnitud de los cambios de proteínas observados en los cultivos mantenidos por BrainPhys®
versus Neurobasal® ( Fig. 1 ). Se necesitan estudios futuros que utilicen análisis 2D de gel y / o de
secuenciación de ARN a gran escala para describir mejor los cambios proteómicos / translaromáticos globales
en las neuronas mantenidas en diferentes medios y en diferentes edades de cultivo. Los medios de cultivo, que
establecen el entorno extracelular in vitro , son un factor importante que regula (en gran medida) la variabilidad
en la expresión génica global en las células ( Guo et al., 2016) Por lo tanto, no es sorprendente que diferentes
medios de cultivo neuronal puedan afectar de manera diferencial la expresión de proteínas en las neuronas; No
obstante, la magnitud de los cambios fue considerable. Además, Neurobasal® / B27 mejoró los marcadores de
patología después de una lesión por estiramiento frente a BrainPhys®. Estos incluyeron un aumento de la
liberación de LDH a las 24 h (muerte celular), activación de calpaína (SBDP), actividad de PARP (aductos
pADPr) y peroxidación lipídica tóxica (aductos MDA). Estos hallazgos son consistentes con el trabajo de otros
que indican que Neurobasal® promueve la excitotoxicidad ( Hogins et al., 2011 ).
Se deben reconocer varias limitaciones del estudio. Primero, Neurocult® / SM1 puede contribuir a las
diferencias observadas en los cultivos neuronales mantenidos por BrainPhys®, que no se analizaron en detalle
aquí. Dado que esta fue una exploración inicial del uso de BrainPhys®, sentimos que era lógico seguir el
protocolo de cultivo descrito por el proveedor (es decir, los primeros 5d en Neurocult® / SM1 y luego ½
intercambio de medios con BrainPhys® / SM1 a intervalos 3d) . Se recomienda que las neuronas se cultiven en
Neurocult® / SM1 inicialmente porque promueve la diferenciación de los progenitores neurales embrionarios
en neuronas primarias; sin embargo, no está claro si períodos de tiempo más cortos en Neurocult® / SM1 serían
suficientes para inducir la diferenciación y permitir el cambio a BrainPhys® antes. Además,
En segundo lugar, nuestro trabajo no indica que BrainPhys® / SM1 sea mejor que Neurobasal® / B27 para
la investigación in vitro . Neurobasal® / B27 es un medio estándar de oro y tiene ciertos beneficios que

12. BrainPhys® puede no tener. Por ejemplo, Neurobasal® / B27 ha sido promocionado durante mucho tiempo por
su capacidad para promover selectivamente el crecimiento neuronal y limitar la proliferación glial. Nuestra
observación de que las neuronas DIV10 en placas P D L en Neurobasal® / B27 tenían niveles abundantes de
NeuN pero carecen de GFAP corrobora estudios previos que indican que Neurobasal® / B27 es ventajoso para
mantener cultivos enriquecidos en neuronas. En contraste, las neuronas cultivadas en placas P D L en
BrainPhys® / SM1 tenían NeuN y GFAP. Curiosamente, pCREB se reguló de forma sólida en cultivos de
neuronas puras (P DPlacas L en Neurobasal® / B27). No entendemos la causa subyacente de esa diferencia. Los
astrocitos generalmente protegen a las neuronas in vitro (por ejemplo, los cultivos mixtos de neuronas / glia
requieren niveles más altos de glutamato para inducir excitotoxicidad frente a cultivos de neuronas puras
( Amin y Pearce, 1997 ). Especulamos que los cultivos de neuronas puras podrían compensar la falta de
astrocitos mediante la activación de programas de autoprotección, como pCREB, que es conocido por inducir
numerosos genes pro-supervivencia como BDNF y Bcl-2 ( Sakamoto et al., 2011 ). Juntos, nuestros hallazgos
sugieren que Neurobasal® / B27 vs. BrainPhys® / SM1 ofrecen ventajas únicas diferentes para el estudio de
neuronas in vitro .
Finalmente, las diferencias de proteínas observadas en la Fig. 1 deben interpretarse en el contexto más amplio
del curso del tiempo de desarrollo (que no se estudió aquí). Por ejemplo, nuestros resultados muestran que
GluN2B y GluR1 son más altos en los cultivos BrainPhys® / SM1 en comparación con los que se mantienen en
Neurobasal® / B27. Sin embargo, no anticiparíamos que estas proteínas están ausentes en los cultivos
Neurobasal® / B27. De hecho, GluN2B y GluR1 se expresan de manera robusta en cultivos mixtos de neuronas
/ neuronas DIV20 más antiguas mantenidas en Neurobasal® / B27 ( Figura complementaria 1 ). Por lo tanto,
BrainPhys® / SM1 puede simplemente acelerar el desarrollo de neuronas in vitro . Por otro lado, de acuerdo
con los hallazgos electrofisiológicos de Bardy y colegas ( Bardy et al., 2015), descubrimos que la actividad
sináptica estimulante, inducida por un método clásico que utiliza el tratamiento con 4-AP / Bicuculline
( Tauskela et al., 2008 ), aumenta en los cultivos mantenidos BrainPhys® / SM1 frente a los de Neurobasal® /
B27 ( Fig. . 1 y . complementario Fig 2 ). Por lo tanto, la relación entre los niveles de proteínas sinápticas
relacionadas (como GluN2B y GluR1) frente a la funcionalidad de esas sinapsis no está clara. Sin embargo,
nuestros hallazgos sugieren que, al menos en nuestras manos, BrainPhys® / SM1 mejora de manera única la
actividad sináptica.
4.3 RBM5 aumenta la vulnerabilidad de los cultivos del SNC a una lesión posterior
Una razón fundamental para establecer y mejorar modelos in vitro que imitan los mecanismos de daño cerebral
observados en pacientes humanos es, en última instancia, desarrollar sistemas robustos para dilucidar la
contribución de diferentes genes en el resultado con la esperanza de descubrir nuevos objetivos
terapéuticos. RBM5 es una proteína pro-muerte en las células cancerosas. Su sobreexpresión en células
malignas (1) ralentiza su tasa de crecimiento y (2) aumenta su vulnerabilidad a morir por un insulto posterior
( Kobayashi et al., 2011 ; Loiselle et al., 2016 ; Rintala-Maki y Sutherland, 2004 ; Shao et al., 2013 ; Shao et al.,
2012 ; Su et al., 2016) Anteriormente informamos que los niveles de proteína RBM5 aumentan en el cerebro del
ratón después de una lesión cerebral traumática grave ( Jackson et al., 2015 ). El trauma de la médula espinal
también induce la expresión neuronal de RBM5 en roedores ( Zhang et al., 2015 ). Sin embargo, aún no se ha
establecido un papel pro-muerte de RBM5 en las neuronas primarias. Aquí confirmamos que el aumento de los
niveles de RBM5, por sobreexpresión mediada por lentivirus, aumenta la vulnerabilidad a un insulto mecánico.
Como se esperaba, el aumento de los niveles de RBM5 condujo a LDH y SBDP 24h significativamente más
altos después de una sola lesión por estiramiento versus controles de vector vacío. Estos hallazgos muestran por
primera vez que RBM5 juega un papel pro-muerte en las células primarias del SNC. Además, los resultados
demuestran que BrainPhys® / SM1 es altamente adaptable a los estudios de manipulación de genes y, en teoría,
puede usarse para obtener más información sobre cualquier objetivo molecular de interés en el contexto de una
lesión mecánica. En particular, una limitación o ventaja clave que depende del contexto experimental, abordado
en profundidad más arriba, pero que también se relaciona aquí, es que BrainPhys® / SM1 promueve la
supervivencia neuronal y glial. Por lo tanto, se necesitan más estudios para evaluar los efectos pro-muerte de la

13. sobreexpresión de RBM5 en cultivos Neurobasal® / B27 enriquecidos con neuronas utilizando otros tipos de
insultos.
En ausencia de manipulaciones virales, no observamos mayores niveles de RBM5 24 horas después de la lesión,
lo que contrasta con los hallazgos previos en un modelo de LCT grave ( Jackson et al., 2015 ). Por lo tanto, el
nivel de lesión en nuestro modelo de estiramiento puede necesitar aumentarse para desencadenar la regulación
positiva de RBM5 endógeno. Además, los mecanismos patológicos adicionales después de una lesión in
vivo (por ejemplo, hemorragia, edema e inflamación) no se replican in vitro y también pueden contribuir a la
regulación positiva de RBM5 in vivo . Por lo tanto, se garantiza que los futuros estudios mejoren el modelo de
estiramiento detallado aquí simulando lesiones secundarias observadas también después de un TBI, como la
adición de microglia a los cultivos BrainPhys® / SM1, que pueden promover lesiones similares a las
inflamatorias.