El documento presenta una charla sobre el descubrimiento de la función de genes en microorganismos a través de técnicas como knock out y knock down. Se enfoca en el estudio de genes relacionados a la resistencia de Mycobacterium tuberculosis a la pirazinamida, proponiendo un proyecto para identificar bombas de eflujo u otros genes involucrados en el mecanismo de acción de este fármaco.

1. Curso Internacional de Ciencia y Tecnología
Curso de Ciencias Para Profesores
Julio 2013
20 de Julio 2013
Universidad Ricardo Palma
Organizado por:
Científicos Peruanos Jóvenes en el Perú y el Extranjero
Centro de Preparación para la Ciencia y Tecnología
Universidad Ricardo Palma
http://escueladeciencias.hol.es

2. “Descubriendo la función de los
genes en los microorganismos”
Julio - 2013
UPCH-LID Bryan Lucero 1/31
Bryan Lucero
Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática.

3. Esquema
• Dogma Central BM.
• Estrategias de estudio
• Knock Out / Knock Down .
• M. tuberculosis.
• Pirazinamida.
• Metalochaperonas / bombas de eflujo.
• Limitaciones.
• Agradecimientos
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4. Dogma Central de la Biología Molecular
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Flujo de información
ADN
ARN Proteína
(Crick ,1970) “'Central Dogma of Molecular Biology. Nature 227, 561-563

5. UPCH-LID Bryan Lucero 4/31
Flujo de información
ARN
Proteína
ADN
Transcripción
Traducción
Replicación
Knockout
KnockDown
M.O

6. ¿Cómo descubrir la función de un
gen?
Genética Funcional
Knockout
Knock down
(Kaur, 2010)
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7. TUBERCULOSIS
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(WHO,2010)

8. UPCH-LID Bryan Lucero 7/31
• 4.42 Mb
• ~4124 genes.
• 65.62 GC%
GENOMA
(Broad Institute, 2013)

9. FÁRMACOS
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Pirazinamida
(Minsa,2009)

10. Causas de resistencia
• Mal funcionamiento
de la PZAsa
• Falta Expresión de la
PZAsa.
• Mutaciones en RpsA.
• Fallas en la bomba de
eflujo.
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(Zhang, 2003)

11. Falla por mutaciones
en el promotor
Falla por mutaciones
en el gen codificante
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¿?
5 factores:
1. Entrada de PZA.
2. Actividad de PZAasa.
3. [PZAsa].
4. Eficiencia de Bombas
5. [Bombas]

12. Causas de resistencia
• Mal funcionamiento
de la PZAsa
• Falta Expresión de la
PZAsa.
• Mutaciones en RpsA.
• Fallas en la bomba de
eflujo.
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(Zhang, 2003)
MTCH

13. Causas de resistencia
• Mal funcionamiento
de la PZAsa
• Falta Expresión de la
PZAsa.
• Mutaciones en RpsA.
• Fallas en la bomba de
eflujo.
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(Zhang, 2003)
(Zimic,2011)

14. ¿conocemos todas la piezas?
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15. Justificación
• Mejor entendimiento del mecanismo de resistencia
• Mejor diagnóstico de resistencia a PZA.
• Mejor tratamiento. Mas rápido , mas económico.
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16. Determinar la relación directa del efecto del silenciamiento gradual
en la expresión de los genes candidatos a bombas de eflujo/mtch
sobre el mecanismo de acción de la pirazinamida.
• Hallar y priorizar genes candidatos a bombas de eflujo/mtch relacionados al
mecanismo de acción de la pirazinamida en el genoma de M. tuberculosis .
• Obtener cepas transformadas de M. tuberculosis que permitan un silenciamiento
gradual de los genes blancos.
• Observar el efecto del silenciamiento gradual de las bombas de eflujo candidatas
sobre la condición de resistencia a pirazinamida.
• Analizar estadísticamente el efecto directo del silenciamiento genético y la
susceptibilidad de estas cepas hacia las droga.
OBJETIVOS
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17. ¿Está alguna de las bombas de eflujo/MTCH candidatas halladas en el
genoma de Mycobacterium tuberculosis relacionada directamente al
mecanismo de acción de la pirazinamida ?
Pregunta
problema
Hipótesis
El silenciamiento de por lo menos un gen candidato a bomba de eflujo estaría
involucrado en el mecanismo de acción de la pirazinamida en el eflujo de ácido
pirazinoico.
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18. UPCH-LID Bryan Lucero 17/31
A

19. Lista de genes candidatos encontrados en M. tuberculosis
back
Referencias BLAST
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Anotación
Búsqueda
Directa
1

20. UPCH-LID Bryan Lucero 19/31
2
PZAsa RpsA
80 genomas
Bombas/MTCH
Cepas
Resistentes
Selección de
Candidatos

21. UPCH-LID Bryan Lucero 20/31
B
C

22. BamHI - NedI
Plásmido
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Optimización del diseño
-Considerar el sitio de unión al ribosoma.
-Evitar estructuras secundarias que causen
homodimerización.
C
Transformación de cepas H37Rv

23. Knock Down
Considerando 6-9 nn antes de ATG/GAG y una longitud <400 nn
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24. UPCH-LID Bryan Lucero 23/31
D

25. Wayne
Test de Wayne
El método de Wayne es una prueba colorimétrica que detecta POA, este es
expulsado por el bacilo en el medio de cultivo y mediante la reacción de Wayne se
forma un complejo químico de color rojo, mediante una lectura a una longitud de
450 nm se detectará la actividad de la pirazinamidasa en relación con el
silenciamiento de las metalochaperonas hipotéticas.
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pAZ: Gradiente de Inducción

26. WAYNE pH 7.4
Control de la matriz: 1 A Controles para PZA: A Controles para IPTG: 1
MATRIZ EXPERIMENTAL
H37Rv
12, 24,36,y 48 horas
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(0-200 ug/ml)
(0-1000ug/ml)

27. MIC pH 5.8
Control de la matriz: 1 A Controles para PZA: A Controles para IPTG: 1
MATRIZ EXPERIMENTAL
H37Rv
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(0-1000ug/ml)
(0-200 ug/ml)

28. .
p<0.05
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E= x0 + x1*[pza] + x2*[iptg] + x3*[pza]*[iptg]

29. Pruebas Adicionales
RT-qPCR
• Genes blanco.
• Pirazinamidasa
(control).
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Inmunoblot

30. Resultados esperados
• Se espera encontrar niveles óptimos de silenciamiento genético para determinar
eficientemente la funcionalidad.
• Se espera encontrar expresión diferencial inducida del gen antisentido que promueve
una inhibición gradual del gen blanco.
• Este estudio espera encontrar diferencias significativas en el eflujo de ácido pirazinoico
de las cepas transformadas con la cepa H37Rv wild type.
• Demostrar la condición de susceptibilidad de cepas transformadas.
• Se plantea hallar el gen específico que codifique a una bomba de eflujo involucrado en
el mecanismo de acción de la pirazinamida.
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31. Limitaciones
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Condición
del gen
Sesgo en los
criterios de
selección
Familia
genética

32. Gracias por su
atención
Agradecimientos
Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática.
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33. Otros Proyectos
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@Joebluc
BioLuces